《分子生物学》实验指导(2015-2016)

一目的基因的获得细菌基因组DNA的提取（一）仪器1）台式高速离心机2）恒温水浴箱3）枪式移液器4）灭菌的EP管和Tip头（二）试剂1）溶液1:25%蔗糖50mmol/LTris-Hcl，pH8.050mmol/LEDTA，pH8.0500ug/ml溶菌酶（现用现配）100ug/mlRNase2)溶液Ⅱ：100mmol/LTris-Hcl，pH8.01%SDS400ug/ml蛋白酶K3）酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）4）氯仿：异戊醇（24：1）5）3mol/LNaAc(pH5.2)6）异丙醇或无水乙醇7）70%乙醇8)TE缓冲液：10mmol/LTris-Hcl，pH8.01mmol/LEDTA，pH8.0(三)实验步骤1)5mL细菌过夜培养，5000rpm离心10分钟，去上清液。

2）将菌体细胞悬于250uL溶液1中，37°C水浴保温过夜。

3）加250uL溶液Ⅱ，55°C水浴保温4小时。

4）加0.9倍体积的酚/氯仿/异戊醇（25：24：1），轻轻混匀，于14000rpm离心10分钟，转移水相至新的Ep管，重复步骤4一次。

5）向转移的水相中加入0,9倍体积的氯仿/异戊醇（24：1），轻轻混匀，于14000rpm离心10分钟，转移水相至新的Ep管，重复步骤5一次。

6）向转移的水相中加入0.1倍体积的3mol/LNaAc和0.7倍体积的异丙醇（或2.5倍体积的无水乙醇），冰上放置30分钟。

7）14000rpm离心20分钟，弃上清，用0.5mL70%乙醇洗涤沉淀一次，弃上清，沉淀于室温干燥。

8）将DNA沉淀溶解于15ulTE缓冲液中，-20°C保存。

9）进行DNA含量和纯度检测，琼脂糖凝胶电泳鉴定。

植物DNA的SDS提取法：（一）试验试剂：1）研磨缓冲液：称取59.63gNaCl，13.25g柠檬酸三钠，37.2gEDTA－Na分别溶解后合并为一，用0.2mol/L的NaOH调至pH7.0，并定容至1000ml。

分子生物学实验技术目录实验一细菌的培养 2实验二质粒DNA的提取 3实验三紫外吸收法测定核酸浓度与纯度 4实验四水平式琼脂糖凝胶电泳法检测DNA 5实验五质粒DNA酶切及琼脂糖电泳分析鉴定 7实验六植物基因组DNA提取、酶切及电泳分析 8实验七聚合酶链反应（PCR）技术体外扩增DNA 9实验八 RNA提取与纯化 11实验九 RT-PCR扩增目的基因cDNA 13实验十质粒载体和外源DNA的连接反应 15实验十一感受态细胞的制备及转化 16实验十二克隆的筛选和快速鉴定 18实验十三 DNA分析——Southern杂交 19一基本操作实验一、细菌培养实验二、质粒DNA提取实验三、紫外吸收法测定核酸浓度与纯度实验四、水平式琼脂糖凝胶电泳法检测DNA实验五、质粒DNA酶切及琼脂糖电泳分析鉴定实验六、植物基因组DNA提取、定量、酶切及电泳分析实验八、植物RNA提取及纯化二、目的基因获取实验七、聚合酶链式反应（PCR）技术体外扩增DNA实验九、RT-PCR扩增目的基因cDNA三、目的基因的克隆和表达实验十、质粒载体和外源DNA的连接反应实验十一、感受态细胞的制备及转化实验十二、克隆的筛选和快速鉴定实验十三、DNA分析——Southern杂交实验一细菌的培养一、目的学习细菌的培养方法及培养基的配置。

二、原理在基因工程实验和分子生物学实验中，细菌是不可缺少的实验材料。

质粒的保存、增殖和转化；基因文库的建立等都离不开细菌。

特别是常用的大肠杆菌。

大肠杆菌是含有长约3000kb的环状染色体的棒状细胞。

它能在仅含碳水化合物和提供氮、磷和微量元素的无机盐的培养基上快速生长。

当大肠杆菌在培养基中培养时，其开始裂殖前，先进入一个滞后期。

然后进入对数生长期，以20~30min复制一代的速度增殖。

最后，当培养基中的营养成分和氧耗尽或当培养基中废物的含量达到抑制细菌的快速生长的浓度时，菌体密度就达到一个比较恒定的值，这一时期叫做细菌生长的饱和期。

可编辑修改精选全文完整版分子生物学实验方法与步骤表达蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析一、原理细菌体中含有大量蛋白质，具有不同的电荷和分子量。

强阴离子去污剂SDS与某一还原剂并用，通过加热使蛋白质解离，大量的SDS 结合蛋白质，使其带相同密度的负电荷，在聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）上，不同蛋白质的迁移率仅取决于分子量。

采用考马斯亮兰快速染色，可及时观察电泳分离效果。

因而根据预计表达蛋白的分子量，可筛选阳性表达的重组体。

二、试剂准备1、30%储备胶溶液：丙烯酰胺（Acr）29.0g，亚甲双丙烯酰胺（Bis）1.0g，混匀后加ddH2O，37O C溶解,定容至100ml, 棕色瓶存于室温。

2、1.5M Tris-HCl(pH 8.0：Tris 18.17g加ddH2O溶解, 浓盐酸调pH至8.0,定容至100ml。

3、1M Tris-HCl(pH 6.8：Tris 12.11 g加ddH2O溶解, 浓盐酸调pH至6.8,定容至100ml。

4、10% SDS：电泳级SDS 10.0 g加ddH2O 68℃助溶,浓盐酸调至pH 7.2,定容至100ml。

5、10电泳缓冲液(pH 8.3：Tris 3.02 g，甘氨酸18.8 g，10% SDS 10ml加ddH2O溶解, 定容至100ml。

6、10%过硫酸铵（AP）： 1gAP加ddH2O至10ml。

7、2SDS电泳上样缓冲液：1M Tris-HCl (pH 6.82.5ml，-巯基乙醇1.0ml，SDS 0.6 g，甘油2.0ml，0.1%溴酚兰1.0ml，ddH2O 3.5ml。

8、考马斯亮兰染色液：考马斯亮兰0.25 g，甲醇225ml，冰醋酸 46ml，ddH2O 225ml。

9、脱色液:甲醇、冰醋酸、ddH2O以3∶1∶6配制而成。

二、操作步骤采用垂直式电泳槽装置（一）聚丙烯酰胺凝胶的配制1、分离胶(10%的配制:ddH2O 4.0ml30%储备胶 3.3ml1.5M Tris-HCl2.5ml10% SDS 0.1ml10% AP 0.1ml取1ml上述混合液,加TEMED(N,N,N’,N’-四甲基乙二胺10μl 封底,余加TEMED4μl ,混匀后灌入玻璃板间，以水封顶，注意使液面平。

《分子生物学实验技术实验操作指南》目录1 植物基因序列分析 (3)2 引物设计的原则 (4)3 试剂的配置和灭菌 (5)4 植物基因组DNA的提取 (6)5 DNA的定量 (8)6 DNA的电泳 (9)8 PCR产物的回收 (12)9 PCR产物连接T载体和感受态细胞的转化 (14)10 菌落（液）PCR (17)11 质粒DNA的提取 (19)12 质粒DNA的酶切 (21)1 植物基因序列分析1.基因组DNA（genomic DNA, gDNA）：功能基因包括三个基本序列：5’上游区，转录区和3’下游区。

2.5’上游区和3’下游区：转录起始位点上游和转录终止位点下游的序列，主要起到基因表达调控作用。

3.转录区：转录起始位点和转录终止位点之间的序列，经核不均一RNA最终被加工为成熟的mRNA。

4.信使RNA（messenger RNA, mRNA）：由DNA的一条链作为模板转录而来的，携带遗传信息的能指导蛋白合成的一类单链核糖核酸。

由编码区、上游的5’非编码区和下游3’非编码区组成，5’端带有7-甲基鸟苷-三磷酸帽子结构，3’端有多腺苷酸尾巴。

5.互补DNA（complementary DNA, cDNA）：具有与某mRNA链呈互补的碱基序列的单链DNA。

6.蛋白质编码区（sequence coding for amino acids in protein, CDS）：与蛋白质序列一一对应的DNA序列，且该序列中间不含其它非该蛋白质对应的序列。

只有外显子，不含内含子。

7.5’非翻译区（5’-untranslated region, 5’UTR）：mRNA位于基因转录起始位点至编码区翻译起始密码子之间顺序。

8.3’非翻译区（3’-untranslated region, 3’UTR）：mRNA位于编码区翻译终止密码子下游一段不被翻译的序列。

2 引物设计的原则1.引物长度：一般为20-25bp。

若产物长度等于或小于500bp，可选用16-18bp的引物；若产物长达5kb，则需要用更长的引物。

实验一RT-PCR法钓取小鼠肝脏GAPDH基因一、TRlzol试剂提取小鼠肝脏总RNATRIzol RNA提取试剂盒是由GIBCOBRL公司推出的产品，其操作方法简捷、方便，lh之内即可完成，所制备的RNA可用于cDNA合成及Northern blot等。

【试剂】TRlZOL试剂氯仿异丙醇75％乙醇（DEPC水配制）无RNase水【操作方法】（1）收获细胞1~5×106；或50-100mg组织，加TRlzol试剂lml匀浆。

（2），移入1.5ml Ep管中，室温静置5min。

（3）每1ml TRIZOL中加氯仿0.2m1，摇振15s，置室温2～3min。

（4）4℃离心，12,000g×15min。

（5）仔细吸取上层水相，移至另一Ep管中。

（6）加0.5ml异丙醇，混匀，置室温10min。

（7）4℃离心，12,000g×10min。

（8）弃上清，加75％乙醇1m1，轻轻摇振，充分洗涤沉淀，4℃离心，7500g×5min。

（9）弃上清，真空干燥后，沉淀重悬于50μl无RNase水中。

一70℃保存备用。

二、核酸的定量（1）分光光度法测定核酸浓度。

组成核酸分子的碱基，均具有一定的吸收紫外线特性，最大吸收波长为250~270nm之间。

例如腺嘌呤的最大紫外线吸收值在260.5nm，胞嘧啶：267nm 鸟嘌呤：276nM胸腺嘧啶：264.5 nm尿嘧啶259nm。

这些碱基与戊糖、磷酸形成核苷酸后，其最大吸收峰不会改变，但核苷酸最大吸收波长是260nm，吸收低谷在230nm，这个物理特性为紫外分光光度法测定核酸溶液浓度提供了基础。

在波长260nm紫外线下，1OD值的光密度相当于双链DNA浓度为50ug/ ml；单链DNA或RNA为40ug/ml；单链寡核苷酸为20ug/ml。

另外，还可以通过测定260nm和280nm的紫外线吸收值，然后根据其比值来估计核酸的纯度。

DNA样品的比值为1.8，RNA样品的比值为2.0。

1病原生物基因组在医学上有何应用？详见书P3a菌种鉴定b确定病毒感染和病毒载量c病毒分析d细菌耐药监测和分子流行病学调查2什么是原癌基因，原癌基因有什么特性，原癌基因可以分为哪些种类以及原癌基因常见的激活机制有哪些？原癌基因是指人类或其他动物细胞(以及致癌病毒)固有的一类基因，能诱导细胞正常转化并使之获得新生物特征的基因总称。

特性：进化上高度保守，负责调控正常细胞生命活动，可以转化为癌基因。

功能分类：生长因子，生长因子受体，信号转导蛋白，核调节蛋白，细胞周期调节蛋白，抑制凋亡蛋白激活机制：插入激活，基因重排，基因点突变，基因扩增，基因转录改变3试述Down综合征（21三体综合征）的主要临床特征及核型。

临床特征：生长发育障碍，智力低。

呆滞面容，又称伸舌样痴呆。

40%患者有先天性心脏畸形。

肌张力低，50%患者有贯通手，男患者无生育能力，女患者少数有生育能力，遗传风险高。

核型：92.5%患者游离型：核型为47，XX(XY),+212.5%患者为嵌合型：46，XX(XY)/47，XX(XY),+215%患者为易位型：46，XX(XY),-14，+t(14q21q)4简述淋球菌感染的主要传统实验室诊断方法及其主要特点，对比分析分子生物学方法的优势1直接涂片染镜检：敏感度和特异性差，不能用于确诊。

2分离培养法：诊断NG感染的金标准，但是其对标本和培养及营养要求高，培养周期长，出报告慢，难以满足临床要求。

3免疫学法：分泌物标本中的非特异性反应严重以及抗体法间的稳定性和条件限制，推广受限。

分子生物学的优点：敏感，特异，可直接从了临床标本中检出含量很低的病原菌，适应于快速检测5、在单基因遗传病的分子生物学检验中，点突变检测常用方法有哪些？1异源双链分析法（HA）2突变体富集PCR法3变性梯度凝胶电泳法4化学切割错配法5等位基因特异性寡核苷酸分析法6DNA芯片技术7连接酶链反应8等位基因特异性扩增法9RNA酶A切割法10染色体原位杂交11荧光原位杂交技术6、简述白假丝酵母菌的分子生物学检验方法白假丝酵母菌分子生物学检验主要包括白假丝酵母菌特异性核酸（DNA RNA）的检测、基因分型和耐药基因分析等。

北京化工大学分子生物学实验指导实验一 少量质粒DNA的制备一、实验目的（1）了解质粒的特性及其在分子生物学研究中的作用。

（2）掌握质粒DNA分离、纯化的原理。

（3）学习碱裂解法分离质粒DNA的方法。

二、实验原理质粒（plasmid）是一种双链的共价闭环状的DNA分子，它是染色体外能够稳定遗传得因子。

质粒具有复制和控制机构，能够在细胞质中独立自主地进行自身复制，并使子代细胞保持它们恒定的拷贝数。

从细胞生存来看，没有质粒存在，基本上不妨碍细胞的存活，因此质粒是寄生性的复制子。

根据质粒的这种特性，通常采用DNA体外重组技术和微生物转化等基因工程的技术和方法，使重组到质粒的某种基因（如干扰素基因）带进受体细胞（如具有一定特性的大肠杆菌细胞等）表达它的遗传性质，改变或修饰寄主细胞原有的代谢产物，或产生新的物质（如干扰素）。

目前，质粒已广泛地用作基因工程中的DNA分子无性繁殖的运载体，同时它也是研究DNA结构与功能的较好模型。

在细菌细胞中，质粒DNA通常为染色体DNA的2%左右，但是细菌质粒DNA的含量与其复制类型有关。

质粒在细胞内的复制，一般分为两种类型：严密控制（stringent control）复制型和松弛控制型（relaxed control）复制型。

严密控制复制型的质粒只在细胞周期的一定阶段进行复制，染色体不复制时，质粒也不复制。

每个细胞内只含1个或几个质粒分子（即有1个或几个拷贝）。

松弛控制复制型的质粒在整个细胞周期中随时可以复制，当染色体复制已经停止时，该质粒仍然能够继续复制。

该质粒在一个细胞内有许多拷贝，一般在20个以上，例如col E1 质粒（含有产生大肠杆菌素E1 基因）及其衍生质粒，在每个细胞内约有20多个拷贝。

所有分离质粒DNA的方法都包括3个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离和纯化质粒DNA。

目前应用于质体DNA的纯化或抽取的方法众多，例如碱溶裂法（alkaline lysis）、热裂解法（boiling method）、氯化铯（CsCl）纯化法，及市售柱层析套管法等。

《分子生物学》实验指导书实验学时：32学时适用专业：生物科学、生物技术实验目录实验一质粒DNA的提取、酶切与电泳鉴定 (1)实验二聚合酶链式反应扩增DNA片段 (3)实验三大肠杆菌感受态细胞的制备与质粒DNA分子转化 (4)实验四植物基因组DNA提取及电泳 (6)实验五植物基因组RNA提取及电泳 (7)实验一质粒DNA的提取、酶切与电泳鉴定实验项目类型：综合性一、实验目的1. 学习质粒的相关基本知识，掌握碱裂解法提取质粒DNA的原理和方法。

2. 学习和掌握限制性内切酶的特性、掌握对重组质粒进行限制性内切酶酶切的原理和方法，并理解限制性内切酶是DNA重组技术的关键工具。

二、实验原理碱裂解法提取质粒DNA的原理是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA的结构差异来实现分离的。

在pH12-12.5时，线性DNA被彻底变性，但共价闭环质粒DNA虽然氢键也发生断裂，但两条互补链仍会紧密缠绕结合在一起。

当在溶液体系中加入pH4.8的KAC时，溶液恢复中性，质粒DNA迅速复性，染色体DNA则由于变性而相互混乱缠绕，不能复性，从而离心即可以把变性的染色体DNA沉淀和蛋白-SDS复合物沉淀分离出来。

三、实验仪器与材料1. 材料：含pSV的E.coli JM109菌株、1.5ml塑料离心管、离心管架、EB、酚、氯仿、异丙醇、乙醇、琼脂糖、吸头等。

2. 溶液或试剂：LB培养基、溶液Ⅰ、溶液II（0.4mol/L NaOH、2%SDS用前等体积混合）、溶液Ⅲ、分离液：酚/氯仿/异戊醇＝25:24:1、无水乙醇、70%乙醇等。

3. 仪器或其他用具：微量移液器(20μl,200μl,1000μl)、恒温振荡摇床、高压蒸汽灭菌锅、涡旋振荡器、琼脂糖凝胶电泳系统、凝胶成像系统、恒温培养箱、制冰机等。

四、操作步骤质粒DNA的提取步骤：1. 用灭菌的牙签挑取白色单菌落接种于另外已制备好的LB琼脂平板上，保存菌种，并把牙签放入盛3 ml LB液体培养基的试管中，37℃振荡培养过夜。

临床分子生物学检验技术实验指导简介临床分子生物学检验技术是一种在临床医学中应用的分子生物学技术，通过分析和检测个体的基因组、蛋白质组和代谢产物等分子级别的信息，以帮助诊断和治疗疾病。

本文档将指导您进行一系列临床分子生物学检验技术实验，包括基因扩增、基因测序和蛋白质分析等。

基因扩增实验实验材料•反应体系：DNA模板、引物、dNTPs、酶切酶、Taq聚合酶、缓冲液等•实验仪器：热循环仪、电泳仪等•实验耗材：离心管、PCR管、琼脂糖凝胶、电泳试剂等实验步骤1.准备反应体系：–将PCR管中添加所需的反应体系成分，包括DNA模板、引物、dNTPs、酶切酶、Taq聚合酶和缓冲液等，按照所需体积进行计量。

–将PCR管密封。

2.设置热循环仪参数：–根据扩增反应的需求，设置热循环仪的参数，如退火温度、延伸温度和循环次数等。

3.进行扩增反应：–将PCR管放入热循环仪中，开始扩增反应。

4.等待扩增反应结束：–根据所设定的循环次数，等待扩增反应结束。

5.进行电泳分析：–取出PCR管中的反应体系，加入加载缓冲液，并将其倒入琼脂糖凝胶槽中。

–以合适的电压和时间进行电泳分析。

6.结果分析：–通过电泳图，观察扩增产物带的大小和强度，判断扩增是否成功。

基因测序实验实验材料•反应体系：DNA样本、引物、dNTPs、酶切酶、DNA聚合酶、缓冲液等•实验仪器：测序仪•实验耗材：离心管、测序管等实验步骤1.提取DNA样本：–从待测样本中提取DNA，使用适当的提取试剂盒进行提取。

2.准备反应体系：–将测序反应所需的反应体系成分，包括DNA 样本、引物、dNTPs、酶切酶、DNA聚合酶和缓冲液等，按照所需体积进行计量。

–将反应体系混合均匀。

3.进行测序反应：–将反应体系转移到测序管中，加入测序仪所需的荧光探针。

–将测序管放入测序仪中，开始测序反应。

4.等待测序反应结束：–根据所设定的反应时间，等待测序反应结束。

5.结果分析：–通过测序仪输出的测序图谱，解读每个碱基的荧光信号，得到待测DNA序列。

《分子生物学检验技术》实验指导【实验目的】1、把握动物组织DNA提取的方法；2、把握紫外分光光度法检测、鉴定DNA浓度和纯度的方法。

【实验原理】获得相当纯度和完整性的基因组DNA，可用于DNA酶切图谱、多态性分析、基因诊断、构建基因组文库等。

因此，DNA样品质量的好坏将直截了当关系到实验的成败。

较理想的DNA样品应达到以下三点要求：①不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子；②最大程度地降低蛋白质、多糖和脂类分子的污染；③排除RNA分子的污染和干扰。

DNA以核蛋白形式存在于细胞中，提取DNA的原则是即要将DNA与蛋白质、脂类和糖类等成分分离，又要保持DNA分子的完整。

本实验中，用阴离子去垢剂十二烷基磺酸钠（SDS）消化破裂细胞膜、核膜，并使组织蛋白变性沉淀，DNA从核蛋白中游离分开；为操纵组织中脱氧核糖核酸酶（DNase）对DNA的降解，加入柠檬酸钠或乙二胺四乙酸二钠（EDTA－Na2）以除去兴奋该酶的金属离子，SDS也能使DNase变性失活；蛋白酶K 可水解蛋白质，消化DNA酶；分离后的DNA用饱和酚/氯仿抽提除去蛋白质，接着用氯仿抽提以除去DNA溶液中微量酚的污染；最后用无水乙醇沉淀DNA，得到欲提取的基因组DNA。

260nm处DNA有最大吸取峰，测DNA的A260，可运算其浓度。

而蛋白质在280nm处有最大吸取峰，可测定A260nm/A280nm比值，检测DNA的纯度，该比值介于1.8~2.0之间。

【实验器材和试剂】1、动物小白鼠2、设备移液器、台式离心机、水浴箱、陶瓷研钵等；751紫外分光光度计、石英比色皿、洗瓶、滤纸等。

3、试剂（1）基因组DNA提取试剂盒（北京康为世纪生物科技公司）：包括Buffer CL、Buffer PP、Buffer GE、RNase A、Proteinase K（7）生理盐水，4℃贮存（8）无水乙醇、70%乙醇【操作步骤】1、制备肝匀浆迅速处死小白鼠，称取新奇肝脏组织50 mg，用预冷生理盐水洗去血液，滤纸吸干后剪碎组织，将剪碎组织放于组织匀浆器或研钵中研磨，同时加入300 μl Buffer CL。

分子生物学实验技术目录实验一细菌的培养 (2)实验二质粒DNA的提取 (3)实验三紫外吸收法测定核酸浓度与纯度 (5)实验四水平式琼脂糖凝胶电泳法检测DNA (6)实验五质粒DNA酶切及琼脂糖电泳分析鉴定 (8)实验六植物基因组DNA提取、酶切及电泳分析 (9)实验七聚合酶链反应（PCR）技术体外扩增DNA (10)实验八RNA提取与纯化 (12)实验九RT-PCR扩增目的基因cDNA (15)实验十质粒载体和外源DNA的连接反应 (17)实验十一感受态细胞的制备及转化 (18)实验十二克隆的筛选和快速鉴定 (20)实验十三DNA分析——Southern杂交 (22)一基本操作实验一、细菌培养实验二、质粒DNA提取实验三、紫外吸收法测定核酸浓度与纯度实验四、水平式琼脂糖凝胶电泳法检测DNA实验五、质粒DNA酶切及琼脂糖电泳分析鉴定实验六、植物基因组DNA提取、定量、酶切及电泳分析实验八、植物RNA提取及纯化二、目的基因获取实验七、聚合酶链式反应（PCR）技术体外扩增DNA实验九、RT-PCR扩增目的基因cDNA三、目的基因的克隆和表达实验十、质粒载体和外源DNA的连接反应实验十一、感受态细胞的制备及转化实验十二、克隆的筛选和快速鉴定实验十三、DNA分析——Southern杂交实验一细菌的培养一、目的学习细菌的培养方法及培养基的配置。

二、原理在基因工程实验和分子生物学实验中，细菌是不可缺少的实验材料。

质粒的保存、增殖和转化；基因文库的建立等都离不开细菌。

特别是常用的大肠杆菌。

大肠杆菌是含有长约3000kb的环状染色体的棒状细胞。

它能在仅含碳水化合物和提供氮、磷和微量元素的无机盐的培养基上快速生长。

当大肠杆菌在培养基中培养时，其开始裂殖前，先进入一个滞后期。

然后进入对数生长期，以20~30min复制一代的速度增殖。

最后，当培养基中的营养成分和氧耗尽或当培养基中废物的含量达到抑制细菌的快速生长的浓度时，菌体密度就达到一个比较恒定的值，这一时期叫做细菌生长的饱和期。

学习指南分子生物学实验课程是在分子生物学及基因工程等理论课的基础上，开设的一门综合性兼设计性实验课程。

该的教学内容主要突出实验技术的基础性和实用性，把目前最基本的分子生物学实验技术融入具体的系列实验中形成综合与设计性大实验。

要求学生掌握基因工程的实验技术与方法、实验的设计原理、结果分析方法和分子生物学的基本原理和基本实验操作技术，进一步培养学生的实践能力、独立分析问题、解决问题、动手操作的能力。

该课程126学时，3学分。

教材：魏群主编，《分子生物学实验指导》（第二版），高等教育出版社，2007年。

主要参考书：魏群等译，基因克隆和DNA分析，第五版，高等教育出版社，2007。

吴乃虎编著，《基因工程原理》，第二版，科学出版社，2001年。

黄培堂等译，《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社，2002年。

梁国栋主编，《最新分子生物学实验技术》，科学出版社，2001年。

Molecular biology （5th edition，by Robert F. Weaver）Molecular cloning： a laboratory manual （4th edition, by Michael R. Green and Joseph Sambrook)教学资源：北京师范大学分子生物学实验精品课程教学网络平台。

教学策略与方法建议：本课程采用传统的实验教学方法，结合多媒体、讲座、小组讨论与集体讨论、实验设计、网络教学、教学录像、分子生物学小知识和小技巧介绍等多种教学手段，帮助学生通过本课程的学习全面地掌握分子生物学的基本实验方法与技能以及实验设计的思路，以提高学生从事科学研究的综合素质和实践能力。

要求学生先学习普通化学及实验；有机化学及实验、微生物学等课程。

上课期间注意听讲，做好记录，多动手，善于观察，与组员协作好，合理安排时间。

分子生物学实验指导1. 实验背景分子生物学是研究生物大分子的结构、功能和相互作用的一门科学。

它包括DNA、RNA、蛋白质等生物大分子的研究，以及研究它们在细胞内的功能和相互作用的方式。

分子生物学的发展对于理解生物现象、治疗疾病和推动基因工程等都起到了重要的作用。

在进行分子生物学实验之前，我们需要了解一些基本的实验原理和步骤，以确保实验的准确性和可重复性。

本文将介绍一系列分子生物学实验的指导，包括DNA提取、PCR、凝胶电泳等。

2. 实验材料•细菌培养基•细菌菌株•试剂盒（DNA提取、PCR、凝胶电泳）•离心管、PCR管、琼脂糖凝胶板等实验器材3. 实验步骤3.1 DNA提取1.取一定数量的细菌菌株，并将其转接到细菌培养基中。

2.在转接后的细菌培养基中培养一夜，使细菌得到充分生长。

3.将培养好的细菌菌液转移到离心管中，进行离心。

4.移除上清液，加入细菌细胞裂解液，并进行充分混合。

5.进行高速离心，将裂解后的细菌细胞碎片与上清液分离。

6.取得上清液，为DNA提取做好准备。

3.2 PCR1.准备PCR反应试剂盒，包括模板DNA、引物、dNTPs等。

2.处理PCR管，加载模板DNA、引物、dNTPs和酶。

3.设置PCR反应器的温度程序，包括变性、退火和延伸等步骤。

4.将PCR反应管放入PCR机中，进行PCR反应。

3.3 凝胶电泳1.准备琼脂糖凝胶板，根据需要调整琼脂糖浓度和凝胶浓度。

2.准备样本，将PCR反应产物与DNA标准样品一同加载到凝胶孔中。

3.加载电泳缓冲液，确保凝胶完全被浸泡。

4.打开电泳仪，进行凝胶电泳，设定一定的电流和时间。

4. 结果分析通过实验，我们可以获得一系列结果。

在DNA提取实验中，我们可以通过测量DNA的浓度和质量来评估提取的效果。

在PCR实验中，可以通过检测PCR产物的大小和数量来评估PCR反应的效果。

在凝胶电泳实验中，可以通过观察凝胶图像来判断PCR产物的大小和纯度。

5. 实验注意事项在进行分子生物学实验时，需要注意以下事项：•实验前要充分准备。

分子生物学技术实验手册高雄医学院生物学系游仲逸、张永福编着目录实验一：Genomic DNA的制备实验二：Total RNA的制备实验三：聚合脢连锁反应实验四：DNA选殖实验五：基因转型实验六：质体DNA的少量制备和限制脢切割分析实验七：DNA定序分析实验八：北方点墨分析实验九：在大肠杆菌内大量表现重组蛋白实验一：Genomic DNA的制备实验目的纯化genomic DNA是一系列DNA分析，如南方点墨法(Southern blotting)，聚合脢连锁反应(polymerase chain reaction, PCR)，基因组库(genomic library)之建构及筛选等的前置步骤。

本实验将从你所选定之动物组织或细胞中抽取genomic DNA。

你将从本实验中学习如何自细胞或组织中萃取并纯化genomic DNA。

实验原理本实验是以动物组织或细胞作为genomic DNA的来源。

先以阴离子性清洁剂如sodium dodecyl sulfate (SDS)将细胞打破，并使蛋白质变性，以抑制DNase的活性，也让DNA上的蛋白质解离。

同时加入高浓度的ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)亦可抑制DNase的活性。

另外以RNase除去RNA。

而蛋白质则不以有机溶剂如phenol来萃取掉，而是以盐类沉淀方法去除。

如此可避免使用具毒性之有机溶剂，而DNA亦较不会断裂。

萃取到的genomic DNA以酒精沉淀法浓缩，并回溶于TE缓冲溶液中保留。

最后，测波长260 nm与280 nm之吸光值，以计算所抽出DNA之浓度与纯度。

纯DNA的A260/A280比值约为1.8，比值太低时，表示蛋白质残留太多。

DNA浓度计算方式为OD260=1时，DNA浓度约为50 g/ml。

实验材料∙RBC lysis solution：ammonium chloride, EDTA, sodium bicarbonate∙Cell lysis solution：10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 100 mM EDTA, 0.5% SDS∙RNase A solution：4 mg/ml RNase A∙Protein precipitation solution：10 M ammonium acetate∙Isopropanol∙70% ethanol∙TE缓冲溶液：10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA实验步骤1. 首先要将细胞溶解，不同材料之处理方式略有差别。

《分子生物学》实验指导（2015-2016）《分子生物学》实验指导实验1 总DNA提取生物总DNA的提取是分子生物学实验的一个重要内容。

由于不同的生物材料细胞壁的结构和组成不同，而细胞壁结构的破坏是提取总DNA的关键步骤。

同时细胞内的物质也根据生物种类的不同而有差异，因此不同生物采用的提取方法也不同，一般要根据具体的情况来设计实验方法。

本实验介绍采用CTAB法提取植物总DNA的技术。

[实验目的]学习和掌握学习CTAB法提取植物总DNA的基本原理和实验技术。

学习和掌握紫外光吸收法鉴定DNA的纯度和浓度。

[实验原理]植物叶片经液氮研磨，可使细胞壁破裂，加入去污剂（如CTAB），可使核蛋白体解析，然后使蛋白和多糖杂质沉淀，DNA进入水相，再用酚、氯仿抽提纯化。

本实验采用CTAB法，其主要作用是破膜。

CTAB 是一种非离子去污剂，能溶解膜蛋白与脂肪，也可解聚核蛋白。

植物材料在CTAB的处理下，结合65℃水浴使细胞裂解、蛋白质变性、DNA 被释放出来。

CTAB与核酸形成复合物，此复合物在高盐（>0.7mM）浓度下可溶，并稳定存在，但在低盐浓度（0.1-0.5mM NaCl）下CTAB-核酸复合物就因溶解度降低而沉淀，而大部分的蛋白质及多糖等仍溶解于溶液中。

经过氯仿/ 异戊醇(24:1) 抽提去除蛋白质、多糖、色素等来纯化DNA，最后经异丙醇或乙醇等沉淀剂将DNA沉淀分离出来。

由于核酸、蛋白质、多糖在特定的紫外波长都有特征吸收。

核酸及其衍生物的紫外吸收高峰在260nm。

纯的DNA样品A260/280≈1.8，纯的RNA样品A260/280≈2.0，并且1μg/ml DNA 溶液A260=0.020。

[实验器材]1、高压灭菌锅2、冰箱3、恒温水浴锅4、高速冷冻离心机5、紫外分光光度计6、剪刀7、陶瓷研钵和杵子8、磨口锥形瓶（50ml）9、滴管10、细玻棒11、小烧杯（50ml）12、离心管（50ml）13、植物材料[实验试剂]1、3×CTAB buffer（pH8.0）100mM Tris25mM EDTA1.5M NaCl3% CTAB2% β-巯基乙醇2、TE缓冲液（pH8.0）10mmol/L Tris·HCl1mmol/L EDTA3、氯仿-异戊醇混合液（24：1，V/V）4、95％乙醇5、液氮[实验步骤]1、称取2g新鲜的植物叶片，用蒸馏水冲洗叶面，滤纸吸干水分。

分子生物学实验设计田益夫（2013141241072）唐子林（2013141241127）（一）实验目的获得发绿色荧光的细菌。

（二）实验概述通过体外扩增目的基因eGFP并构建表达载体pET-28a-eGFP转入大肠杆菌BL21，涂板观察细菌中外源绿色荧光蛋白基因表达情况。

（三）实验步骤及材料1 实验准备与质粒提取1.1 实验材料及试剂含有pEGFP-N3质粒的大肠杆菌菌液和含有pET-28a质粒的大肠杆菌菌液（或pEGFP-N3质粒、pET-28a质粒及E.coli DH5α）；胰蛋白胨，酵母提取物，琼脂，去离子水，1N NaOH；溶液I, 溶液II, 溶液III;卡那霉素储存液（50mg/ml），工作浓度50μg/ml;氨苄青霉素储存液（100mg/ml）,工作浓度100μg/ml；饱和酚，氯仿，异戊醇；无水乙醇，含RNase的双蒸水。

1.2 实验仪器恒温摇床，超净工作台，高温灭菌锅，10、200、1000μl移液器各一支及对应枪头各一盒，台式高速离心机，制冰机，混合漩涡器，EP管，三角瓶等常用玻璃仪器，琼脂糖凝胶电泳仪等。

1.4实验具体步骤1.4.1 仪器准备与培养基的配置（1）取两个250ml锥形瓶，各配置100ml固体/液体LB培养基，（2）按照体系将以上物品分别加入两个烧杯中，加入80ml去离子水混匀溶解。

加入琼脂的培养基在石棉网上加热溶解。

（3）用1N NaOH调节PH至7.5，倒入250ml锥形瓶中，与装好的平板一起放入高温灭菌锅内121℃灭菌20min。

（4）将包好的平板，枪头（10、100、1000μl），EP管，三角瓶等常用仪器放入高温灭菌锅内121℃灭菌30min。

（5）将灭菌后的常用仪器放置于干热灭菌箱内保存备用。

（6）取一支200μl移液枪，200μl枪头一盒，灭菌后的培养基、灭菌后的平板等放于紫外灯下照射30min。

（7）待培养基降温至50℃左右，各加入Kana霉素10μl。