第33卷第4期2010年7月
河北农业大学学报
J OU RNAL OF AGRICU LTU RAL UNIVERSITY OF H EBEI
Vol.33No.4
Jul.2010
文章编号:1000-1573(2010)04-0001-04
棉花叶片硝酸还原酶活性的测定方法
刘洁,王省芬,张桂寅,吴立强,
李志坤,马峙英
(华北作物种质资源研究与利用省部共建实验室,河北省作物种质资源重点实验室,河北农业大学,河北保定071001)
摘要:本研究应用磺胺比色法测定棉花叶片硝酸还原酶活性(NR A),探讨了体内法测定棉花叶片NR A的最适条件。通过分析比较硝酸盐诱导、2,4-二硝基苯酚、三氯乙酸及煮沸等因素对N RA测定结果的影响,建立了体内法测定棉花叶片N RA的最佳条件,即用50mmol/L的KN O3溶液诱导棉花叶片48h、抽气前后分别加入2,4-二硝基苯酚和1,6-二磷酸果糖、暗保温35min后煮沸10min可以使N RA的活性达到最高。棉花叶片N RA测定方法的建立为进一步研究棉花的氮素代谢奠定了基础。
关键词:棉花;硝酸还原酶;酶活性测定
中图分类号:S562文献标志码:A
Determination method of nitrate reductase activity in cotton leaves
LIU Jie,WAN G Xin g-fen,ZHAN G Gu-i yin,WU L-i qian g,
LI Zh-i kun,MA Zh-i ying
(No rth China Key Labor ator y fo r Cro p G ermplasm Resources of M inistry of Educatio n,Key L abo rato ry o f Crop Ger mplasm Reso urces o f Hebei,Ag r icultural U niversit y of H ebei,Baoding071001,China)
Abstract:T he method o f sulfonam ides color im etry w as used to deter mine the nitr ate reductase activity(NRA)in cotto n leaves.T he optim um factors fo r determ inatio n of NRA in cotton leav es by in vivo method w ere discussed.Thro ug h com parativ e analysis of several m ain factors of in vivo method such as nitrate induction,2,4-dinitr opheno l,3-chlor oactic acid and boiling etc.,the optimum condition w as identified for deter mination metho d o f NRA in co tto n leaves.
The induction o f50mm ol/L KN O3solutio n fo r48h,appendment of2,4-dinitrophenol befo re elicitting air and of1,6-dipho sphate fructose after elicitting air,boiling10min after incubated fo r35m in at30e in the dark could o btain the highest NR activity.T he results sho w ed that in vivo method w as r eliable and easy to determine the NR activity of co tton leaves,and this meth-od lays the foundatio n fo r further study on nitro gen metabolism of co tton.
Key words:cotton;nitr ate reductase;determination of enzym e activity
硝酸盐是植物重要的氮素来源,在其代谢过程中通过硝酸还原酶的作用转变为亚硝酸盐,然后再通过亚硝酸还原酶的作用转变成氮循环的重要原料-铵。植物吸收利用环境中的NO3-,需经过2个
1收稿日期:2010-05-01
基金项目:河北省科技支撑计划重大项目(06220113D);河北省自然科学基金重大项目(C2006001034).作者简介:刘洁(1984-),女,河北省廊坊市人,在读硕士生,主要从事分子遗传及其育种应用研究.
通讯作者:马峙英,教授,主要从事棉花育种研究.E-mail:mzhy@https://www.doczj.com/doc/52810449.html,
河北农业大学学报第33卷
同化反应步骤:首先由硝酸还原酶(Nitrate reduc-tase,NR)把NO3-还原为亚硝态氮(N O2-),然后再由亚硝酸还原酶(Nitrite r eductase,NiR)把NO2-还原为NH4+,才能进一步参与氨基酸及蛋白质的合成[1]。
1952年Evans和N ason在红色链孢霉中最早发现硝酸还原酶(NR),次年又在高等植物中发现[2]。硝酸还原酶是高等植物氮素同化的限速酶,可直接调节硝酸盐还原,从而调节氮代谢,并影响到光合碳代谢[3]。硝酸还原酶活性(NRA)的高低不仅表明了植物体内硝酸盐的吸收、积累水平,也反映着植物对氮素的利用水平[4]。在绿色器官中NR mRNA的表达水平在光下是增加的。在黑暗中虽然施加了硝,但NR mRNA也是持续的低水平[5]。NR对环境条件十分敏感,光、NO3-含量、CO2浓度等均会影响其活性[6]。在植物氮代谢的研究中,硝酸还原酶活性是研究重点之一。
目前报道的硝酸还原酶活性的测定方法主要有体外法和体内法[7-9]。体外法操作流程复杂、要求条件较高,相比之下体内法简便、快速,在研究中应用较多。有报道认为,体内法存在NRA测定值偏低、重复性不够理想的缺点,因而需要针对不同的测定材料,确定最佳的测定条件[9]。但有关棉花氮代谢中硝酸还原酶活性测定的方法还未见报道。本研究深入探讨了体内法测定棉花叶片硝酸还原酶活性的最佳条件,为进一步研究棉花的氮素代谢奠定基础。
1材料与方法
1.1供试材料
供试棉花品种为陆地棉品种/邯2080,由河北农业大学棉花遗传育种研究室提供。
1.2试验方法
1.2.1棉花无菌苗的培养种子经浓硫酸脱绒后晾干,用011%升汞处理8~10min,无菌水冲洗3~4次,无菌水浸泡过夜至露白,将处理好的种子接种于无菌苗培养基上,(25?2)e下培养,待棉苗长到4~ 5片真叶时,摘取真叶用于硝酸还原酶活性测定。1.2.2试验材料的KNO3诱导处理硝酸还原酶是一种诱导酶,有报道指出用KN O3溶液诱导可以提高材料中的硝酸还原酶活性[10-11]。根据报道,本研究利用KNO3溶液进行了诱导处理。具体操作是:取棉花无菌苗叶片,用蒸馏水洗净、吸干,用直径为1cm的打孔器制成叶盘,随机取50个称重,置入50mmo l/L KN O3溶液中室温下进行诱导处理(为防止水分蒸发,将叶片用透明薄膜包被),处理时间为12、24、36和48h,每天的光、暗周期各12h,并以未诱导处理的棉苗作为对照。
1.2.3硝酸还原酶活性测定参照周树等的体内测定法,测定棉花叶片中硝酸还原酶活性[9]。将KNO3诱导处理后的棉花叶片置于50mL三角烧瓶中,加入10mL含012mol/L KNO3的磷酸缓冲液(011m ol/L,pH715),空白对照选用不含KNO3的磷酸缓冲液。将三角烧瓶放入真空干燥器中抽气,反复数次,使叶片完全沉于液面下,取出三角烧瓶置于30e温箱中,暗保温30min,保温结束后取1mL反应液于试管中,加入2mL1%对氨基苯磺酸溶液、2mL012%A-萘胺溶液,30e静置30min,用DU800型分光光度计于520nm波长下测定吸光值,每个处理重复3次。将1g鲜重材料每小时催化生成NO2-的微摩尔数定义为1U[8]。在上述基本流程基础上,设置以下几种处理:
1显色液配方处理:本试验中分别用3mo l/L H Cl、H2SO4、H3PO4和H Ac配制对氨基苯磺酸和A-萘胺显色液。
o2,4-二硝基苯酚处理:分别在抽气前和抽气后向三角烧瓶中加入2mL1mm ol/L的2,4-二硝基苯酚,以阻止NO2-被进一步还原,比较抽气前和抽气后加入2,4-二硝基苯酚对NRA的影响。
?1,6-二磷酸果糖处理:在抽气后向三角烧瓶中加2m L215mm ol/L的1,6-二磷酸果糖溶液,为硝酸还原酶的诱导合成提供能量。
?三氯乙酸处理:暗保温结束后,加入015mL 1%三氯乙酸,使酶钝化。
?暗保温处理:设置20、30、35、40min3个处理时间。
?煮沸处理:将暗保温35m in后的反应液分别煮沸2、5、10、15m in,并与未煮沸的进行比较[13-14]。
2结果与分析
2.1显色液配方处理对NRA的影响
从表1可以看出,随着酸强度的增加,A520值呈现逐渐下降的趋势,具体表现为H Ac>H3PO4> H Cl>H2SO4,而且以3mol/L H Ac为溶剂配制的显色液与NO2-反应经过15m in即可在520nm获得最大吸光值,而其余3种需显色30m in A520才能达到最大值,并且它们的A520值均小于H Ac作为溶剂的显色剂。
2
第4期 刘 洁等:棉花叶片硝酸还原酶活性的测定方法
表1 几种配方显色液对NO 2-显色速度和灵敏度的影响Table 1 The influence of several solution formulations
on NO 2-developing speed and sensitivity
配方Fo rmula A 520
显色15min 显色30min 3mo l/L H Cl 0.795?0.042 1.37?0.0123mo l/L H 2SO 40.512?0.021 1.159?0.0083mo l/L H 3PO 40.975?0.035 1.421?0.0103mo l/L
H A c
1.575?0.009
1.585?0.011
注:表中数据为平均值?标准误(n =3),以下同。
2.2 KNO 3诱导处理对NRA 的影响
从图1可以看出,经过硝酸盐诱导的棉花叶片中NRA 明显高于未经诱导处理的叶片。
注:数据为平均值?标准误(n =3);误差线上相同字母表示差异不显著(P =0105),以下同
图1 诱导时间对棉花NRA 的影响
Fig.1 The influence of induction time
on the NRA of cotton
一般情况下,用50mmol/L 的KNO 3溶液对棉花叶片诱导48h 即可得到较好的结果,可以提高NRA 的测定值及试验的重复性。但从36h 和48h 的NRA 数值上看出,诱导时间对NRA 的影响不大。2.3 2,4-二硝基苯酚、1,6-二磷酸果糖和三氯乙酸
处理对NRA 的影响
由表2中处理A 和B 的数据可以看出,抽气前后加入2,4-二硝基苯酚所得NRA 不同。抽气前加入2,4-二硝基苯酚比抽气后加入2,4-二硝基苯酚的NRA 值要高,且二者差异显著,因此在抽气前加入2,4-二硝基苯酚有利于NRA 的测定。
比较表2中处理A 和C 的数据可知,1,6-二磷酸果糖的加入对于NRA 值的提高有显著影响,说明1,6-二磷酸果糖对于提高NRA 是十分重要的。
对于三氯乙酸对NRA 的影响,可从表2中处理A 和D 两组数据的比较中看出,三氯乙酸作为一
种使酶钝化的试剂,在同样都进行煮沸的情况下,三氯乙酸对于NRA 的测定结果没有影响。
表2 不同处理方法对棉花叶片NRA 的影响
Table 2 The influence of dif ferent treatment methods on the NRA of cotton leaves 处理T r eatment
2,4-二硝基苯酚
2,4-dinitro phenol 抽气前Befo re elicitting air 抽气后After elicitting a ir
1,6-二磷酸果糖1,6-diphosphate
fructose 三氯乙酸3-chlor oactic
acid 煮沸Boiling 硝酸还原酶活性NR A/[L mo l #(h #g )-1]A +-+++(1.569?0.018)a B -++++(1.306?0.012)b C +--++(1.310?0.010)b D
+
-+
-+
(1.560?
0.011)a
注:NRA 数据为平均值?标准误(n =3);具有相同字母者表示差异不显著(P =0105).
2.4 暗保温时间对NRA 的影响
从图2中可以看出,NRA 与暗保温时间在30min 内几乎呈线性关系,超过30min 则NRA 趋于
平稳。
图2 暗保温时间对棉花叶片NRA 的影响Fig.2 The inf luence of dark holding time on
the NRA of cotton leaves
因此,对于棉花叶片的NRA 的测定,选择35m in 的暗保温时间比较适合。2.5 煮沸时间对NRA 的影响
从图3可以看出,煮沸处理棉花叶片的NRA,随着煮沸时间的延长,NRA 也逐渐增高,煮沸10m in 时NRA 达到最高值,继续煮沸无明显变化。由此可以推断煮沸处理可以使在暗保温过程中产生的NO 2-更充分地从叶片组织中渗透出来。
3
河北农业大学学报第33
卷
图3煮沸时间对棉花叶片NRA的影响
Fig.3The inf luence of boiling time on
the NRA of cotton leaves
3讨论
通常在硝酸还原酶活性测定时用对氨基苯磺酸和a-萘胺2种显色剂。据报道,用25%H Cl(V/V,即3mol/L)分别配制磺胺和a-萘胺两种显色剂,表现出溶解度小,反应速度慢,灵敏度低,显色时间长等缺点[12]。本研究用体内法测定棉花叶片NRA 时,发现以3m ol/L H Ac做为溶剂分别配制对氨基苯磺酸和a-萘胺2种显色剂,不仅可以提高显色反应的灵敏度,而且还可以加快显色反应的速度并缩短显色反应的时间,达到事半功倍的效果。
本研究发现用50mmo l/L的KNO3溶液诱导48h得到的NRA结果理想,主要因为硝酸还原酶是一种诱导酶,在有KNO3诱导的情况下,刺激了植物体内硝酸还原酶的表达,从而提高了NRA。通过比较抽气前后加入适量2,4-二硝基苯酚后的NRA值可以看出,2,4-二硝基苯酚阻止了反应液内的NO3-在抽气过程中被亚硝酸还原酶进一步还原,影响试验的准确性,从而初步断定2,4-二硝基苯酚对亚硝酸还原酶有一定的抑制作用,或是其他方面的干扰作用。1,6-二磷酸果糖位于糖酵解途径的重要位置,它的代谢不仅可以生成高能磷酸键,而且产生了还原剂NADH,同时ADP被磷酸化成ATP,伴随有少量的放能。1,6-二磷酸果糖的加入为硝酸盐同化提供了更多的还原力,保证了反应所需要的能量。
本研究中,三氯乙酸的加入对NRA影响不大,分析原因可能是因为三氯乙酸的作用是使酶钝化而终止反应,随后的煮沸使所有蛋白质彻底失活,两者作用相互掩盖,导致对结果影响不显著。周国章等[8]报道过NRA在暗保温30~40m in内的变化不大,35m in时NRA最高,40min时略有下降[10],本研究结果与前人报道相同。可能是随时间增加部分NO3-被还原降低了NRA。有关研究也认为,体内法测定NRA的数据稳定性与NO3-能否充分进入叶片,NO2-是否充分渗出有一定的相关性[7,11]。煮沸的过程可使暗保温产生的NO2-彻底从叶片组织中充分渗透出来,从而使棉花NRA的测定结果更加精确。因而测定棉花叶片的NRA时,在暗保温结束后进行煮沸处理是十分必要的。
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(编辑:梁虹)
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植物体内硝酸还原酶活力的测定 P56—59 硝酸还原酶（NR）是植物氮素同化的关键美，它催化植物体内的硝酸盐还原为亚硝酸盐：NO3—＋NADH＋H+ →NO2—＋NAD++H2O产生的亚硝酸盐与对—氨基苯磺酸（或对—氨基苯磺酰胺）及α—萘胺（或萘基乙烯胺）在酸性条件下定量生成红色偶氮化合物。 生成的红色偶氮化合物在540nm有最大吸收峰，可用分光光度计法测定。硝酸还原酶活性可由产生的亚硝态氮的量表示。一般以每克鲜重含氮量表示，即ug·g—1·h—1为单位。NR的测定可分为活体法和离体法。活体法步骤简单，适合快速、多组测定。离体法复杂，但重复性好。 一、离体法 仪器与用具： 冷冻离心机；分光光度计；天平；冰箱；恒温水浴锅；研钵；剪刀；离心管；具塞试管（10ml）；移液管（5、2、1ml）；洗耳球。 试剂： 亚硝酸钠标准溶液：准确称取分析纯NaNO2 0.9857g溶于去离子水定容至1000ml，然后再吸收5ml定容至1000ml，即为含亚硝态氮1ug/ml的标准溶液； 0.1mol/L PH 7.5 的磷酸缓冲液：Na2HPO4·12H2O 30.0905g与NaH2PO4·2H2O 2.4965g加去离子水溶解后定容至1000ml； 1%（W/V）溶液：1.0g对氨基苯磺酸溶于100ml 3mol/L HCl中（25ml浓盐酸加水定容至100ml即为3mol/L HCl）； 0.02%（W/V）萘基乙烯胺溶液：0.0200g萘基乙烯胺溶于100ml去离子水中，贮于棕色瓶中； 0.1mol/L KNO3溶液：2.5275g KNO3溶于250ml 0.1mol/L PH 7.5 的磷酸缓冲液中； 0.025mol/L PH 8.7的磷酸缓冲液：8.8640g Na2HPO4·12H2O ，0.0570g K2HPO4·3H2O加去离子水溶解后定容至1000ml； 提取缓冲液：0.1211g半胱氨酸，0.0372g EDTA溶于100ml 0.025mol/L PH8.7的磷酸缓冲液中； 2mg/ml NADH溶液：2mg NADH溶于1ml 0.1mol/L PH 7.5 的磷酸缓冲液（临用前配置）。 方法： 1. 标准曲线制作
实验9 硝酸还原酶活性的测定 一、目的 学会植物组织中硝酸还原酶活性的测定方法。 二、材料用具及仪器药品 木茨叶或菠菜叶子、蓖麻叶、721型分光光度计、真空泵（或注射器）、保温箱、天平、真空干燥器、钻孔器、三角瓶、移液管、烧杯、洗耳球 0.1mol/L磷酸缓冲液（pH7.5）、0.2mol/L KNO3）；磺胺试剂、a-苯胺试剂，NaNO2 标准溶液： a—萘胺试剂配制：0.2克a—萘胺加25ml浓盐酸，用蒸馏水稀释至100ml。 磺胺试剂配制：取1克磺胺加25ml浓盐酸，用蒸馏水稀释至100ml. NaNO2标准溶液：1克NaNO2用蒸馏水溶解，定量至1000ml，然后吸取5ml，再加蒸馏水定量至1000ml，该溶液每ml含有NaNO25ug，用时稀释之。 磷酸缓冲液： 贮备液A：0.2mol/L NaH2PO4溶液（27.8g NaH2PO4·H2O配成1000ml）。 贮备液B：0.2 mol/L Na2HPO4溶液（53.65g Na2HPO4·7H2O或Na2HPO4·12H2O 配成1000ml）取A液16ml+B液84ml，用水稀释至200ml 三、原理 硝酸还原酶是植物氮素代谢作用中关键性酶，与作物吸收和利用氮肥有关，它作用于NO—3还原于NO—2 NO—3+NADH+NO—2+NAD++H2O 产生的NO-2可以从组织内渗透到外界溶液中，并积累在溶液中，测定反应溶液中NO-2的含量的高低，即表明酶活性的大小。 NO-2含量的测定用磺胺（对氨基苯磺酸胺sulfanil—amide）比色法，这种方法非常灵敏，能测定每m10.5ug的NaNO2。 四、方法步骤 1．将新鲜叶片（蓖麻、烟草、木茨叶等）水洗，用吸水纸吸干水分，然后用1cm的钻孔器钻取的圆片，在天平上称取等量的叶圆片两份，每份0.5克，（或每份取50个叶圆片），分别置于含有下列溶液的三角瓶中，（1）0.1mol/L磷酸缓冲溶液5ml+蒸馏水5ml。（2）0.1mol/L磷酸缓冲溶液5ml+0.2mol/L KNO3 5ml。然后将三角瓶置于真空干燥器中，接上真空泵抽气，放气后，叶圆片即沉于溶液中，（如果没有真空瓶，也可以用20ml注射器代替，将反应液及叶片一起倒入注射器内,，用手指堵住注射器出口小孔，然后用力拉注射器使之真空，如此抽气放气反复进行多次，即可使叶圆片中的空气抽去，并沉于溶液中），将三角瓶置于30℃温箱中，使不见光，保温作用30分钟，然后分别吸取反应溶液1ml，以测定NO-2含量。 注意取样前叶子要进行一段时间的光合作用，以积累碳水化合物，如果组织中的碳水化合物含量低，会使得酶的活性降低，此时则可在反应溶液中加入30μmol/L 的 3—磷酸甘油醛或1.6——二磷酸果糖，能显著增加NO-2的产生。 2．NO-2含量的测定 保温30分钟结束时，吸取反应溶液1ml于一试管中，先加入磺胺试剂2ml，后加入一
食品添加剂硝酸盐亚硝酸盐的毒性和人体健康的危害 毒理与功能评价所陈新霞奚清丽王民生 常见的硝酸盐(nitrate)为硝酸钠，为白色细小结晶状粉末，稍带淡灰色或淡黄色，无臭，味略苦咸，易潮解和溶于水，其水溶液为中性，高热时分解为亚硝酸钠。硝酸盐广泛用作于食品加工业中的发色剂和防腐剂。 亚硝酸盐(nitrite)俗称“硝盐”，外观及滋味都与食盐相似，人们通常称为“工业用盐”。亚硝酸盐主要指亚硝酸钠，它是一种白色或淡黄色结晶状颗粒或粉末，无臭，味咸稍带苦味，易潮解，易溶于水，难溶于乙醇和乙酸，其水溶液的pH为9，能缓慢吸收空气中的氧而转变为硝酸钠。亚硝酸盐主要用于生产各种染料和某些有机合成、金属表面的热处理，也常在肉类制品中允许作为发色剂限量使用。 硝酸盐和亚硝酸盐广泛分布于自然环境，主要来源是含氮肥料的大量使用。食品、燃料、炼油等工厂排入环境和水体中的大量含氮废弃物和氮氧化物，经过生物、化学转换后均形成硝酸盐，而造成地表水和地下水的硝酸盐污染，在硝酸盐还原菌的作用下，硝酸盐还原成亚硝酸盐。无机、有机含氮肥料和农药的大量使用，导致土壤中硝酸盐富集化，菜根从土壤中获取养分的同时，也摄入了大量硝酸盐，一些蔬菜如卷心菜、花椰菜、胡萝卜、芹菜、菠菜等通常含有很高的硝酸盐（1000 ～3000mg／kg），一般成年人每天摄入的硝酸盐约100mg 。蔬菜中的硝酸盐，在腌制过程中极易被还原成亚硝酸盐。在食品加工中，硝酸盐和亚硝酸盐常作为肉制品的发色剂添加于食品原料中，以增加腌肉制品的色泽和抑制微生物的繁殖及毒素的产生，来延长保质期和提高腌肉的风味。 人体主要通过饮食摄入过多的硝酸盐与亚硝酸盐，这两种物质在我国A级绿色食品中不得使用。1994年联合国粮农组织和WHO规定了硝酸盐和亚硝酸盐的每日容许摄入量（ADI 值）分别为5mg／kg和0.2mg／kg。我国食品安全国家标准食品添加剂使用标准（GB2760-2011）规定，在肉制品中硝酸盐(硝酸钠，硝酸钾)的最大使用量不得超过500mg ／kg，亚硝酸盐的最大使用量不得超过150mg／kg。在肉制品中亚硝酸盐的最终残留量不得超过30mg／kg，肉罐头中不得超过50mg／kg。婴儿对硝酸盐和亚硝酸盐敏感，因此，欧共体建议亚硝酸盐不得用于婴儿食品，硝酸盐应限制使用。 硝酸盐与亚硝酸盐主要从消化道进入人体。含有大量硝酸盐的饮水、粮食、鱼、肉制品、蔬菜、渍酸菜、隔夜炒菜等食用后，在口腔可被唾液中硝酸盐还原酶还原成亚硝酸盐进入人体。 唾液腺可以浓缩富集硝酸盐并分泌到口腔中，唾液中的硝酸盐水平是血液中的20倍。Xia等比较了Sjogren综合征、腮腺良性肥大患者和健康成人的腮腺液、混合唾液、血液和尿液中硝酸盐、亚硝酸盐含量后发现，Sjogren综合征患者混合唾液中硝酸盐、亚硝酸盐的总量均明显低于健康对照组和腮腺良性肥大组，而Sjogren综合征患者尿液中硝酸盐、亚硝酸盐的总量均明显高于健康对照组。Xia等还通过建立小型猪腮腺破坏萎缩的动物模型来进行硝酸盐负荷实验研究，结果发现当双侧腮腺破坏后混合唾液中硝酸盐、亚硝酸盐含量明显降低，给予硝酸盐负荷后腮腺破坏组混合唾液中硝酸盐、亚硝酸盐升高的幅度明显低于对照组，而尿液中的硝酸盐含量却明显高于对照组。说明腮腺是机体硝酸盐代谢的重要器官,而机体维持高浓度的唾液硝酸盐含量可能与口腔抗菌作用有关。 唾液中的硝酸盐随吞咽运动进入胃中,在正常情况下在胃和十二指肠重吸收入血，经血循环回到唾液腺，再次分泌到唾液中，经历了从十二指肠→唾液腺→口腔→十二指肠的循环过程，这种循环使硝酸盐不断地在口腔被还原成亚硝酸盐，人体内80%亚硝酸盐都是从这个循环得到的。在病理情况下，如一些疾病导致胃酸过低时，胃液中的一些硝酸盐还原菌活性增强，也可使硝酸盐还原为亚硝酸盐。Hunault的研究表明硝酸盐在胃肠道高吸收，而在
一、实验目的和要求 掌握体内法测定植物组织中的硝酸还原酶原理和方法，明确诱导酶含义。 二、实验内容和原理 硝酸还原酶（NR）是植物氮素同化的关键酶，与作物吸收和利用氮肥有关。它催化植物体内的硝酸盐还原为亚硝酸 盐： 产生的NO2-可以从组织内渗透到外界溶液中，并积累在溶液中，测定NO2-含量的增加，即表示该酶活性的大小。 NO2-含量的测定用磺胺比色法。在酸性溶液中产生的亚硝酸盐与对–氨基苯磺酸（或对–氨基苯磺酰胺）反应产生重氮，再与α–萘胺（或萘基乙烯二胺）偶联形成紫红色的偶氮化合物。生成的红色偶氮化合物在540nm波长下有最大吸收峰，可用分光光度法测定，利用标准曲线确定溶液中NO2-含量。 三、主要仪器设备 1、实验仪器分光光度计，真空泵，温箱，天平，2个烧杯，移液管若干，试管3支，剪刀。 2、实验试剂0.1mol/L pH7.5的磷酸缓冲液，对-氨基苯磺酸溶液，α-萘胺溶液，亚硝酸钠标准液 3、实验材料在15-25℃蒸馏水培养一周的大麦苗两组，一组加KNO3，一组加NH4Cl，在白天置光照下处理。 四、操作方法和实验步骤 1、剪取新鲜的叶片两组，一组是处理苗0.51g，另一组是对照苗0.50g，叶片各剪为0.5~1cm的碎片，压实。 2、两组中各加入15ml的酶促反应液。 3、真空抽取10min，充分交换细胞内外液。 4、加盖在30℃的保温箱中保温20min。 5、去除材料，用移液管取4ml反应液，加入2ml磺胺，加入2ml苯基，放置15min。 6、比色：在540nm的波长下分光光度测定亚硝酸的OD值。 7、空白管：4mlH2O +磺胺溶液2ml+萘基乙烯二胺溶液2ml 室温放置15min同样在540nm的波长下分光光度测定亚硝酸的OD值。 五、实验数据记录和处理 称重：处理苗0.51g；对照苗0.50g OD值：处理苗0.513A；对照苗0.050A NO2- 含量标准曲线：Y=257.29X-4.8262（X=OD值；Y=NO2含量（nmol）） 有标准曲线得出NO2-的含量：处理苗：C NO2-=127.16nmol 对照苗：C NO2-=8.038nmlo 硝酸还原酶活力(nmol NO2-·g-1·h-1)= 根据OD值从标准曲线上查得的NO2（nmol）×3 ×15/4/m 硝酸还原酶活力：处理苗=2805 nmol NO2-·g-1·h-1对照苗=180.855 nmol NO2-·g-1·h-1 六、实验结果与分析
硝酸还原酶的测定方法 硝酸还原酶活性的测定原理硝酸还原酶是植物氮素代谢作用中关键性酶，与作物吸收和利用氮简单易行，在一般条件下都能做到。红色的偶氮染料。反应液的酸度大则增加重氮化作用的速度，但降低偶联作用的速度，颜色比较稳定。增加温度可以增加反应速度，但降低重氮盐的稳定度，所以反应需要在相同条件下进行。这种方法非常灵敏，能测定每ml含0.5μg的NaNO2。仪器药品721型分光光度计真空泵（或注射器）保温箱天平真空干燥器钻孔器三角烧瓶移液管烧杯0.1mol/L磷酸缓冲液，pH7.5（见附表2）。0.2mol/L KNO3：溶解20.22g KNO3于1000ml 蒸馏水器中。磺胺试剂：1g磺胺加25ml浓盐酸，用蒸馏水器稀释至100ml。α—萘胺试剂：0.2gα—萘胺溶于含1ml浓盐酸的蒸馏水器中，稀释至100ml。NaNO2标准溶液：1g NaNO2用蒸馏水器溶解成1000ml。然后吸取5ml，再加稀释成1000ml，此溶液每ml含有NaNO2 5μg，用时稀释之。操作步骤 1. ．将新鲜取回的叶片（蓖麻、烟草、向日葵、油菜、小麦、棉花等均可）水洗，用吸水纸吸干，然后用钻孔器钻成直径约1cm的圆片，用洗涤2梍3次，吸干水分，然后于台天平上称取等重的叶子圆片两份，每份约0.3—0.4g（或每份取50个圆片），分别置于含有下列溶液的50ml三角烧瓶中：(1)0.1mol/L磷酸缓冲溶液(pH7.5)5ml 5ml；(2)0.1mol/L磷酸缓冲溶液(pH7.5)5ml 0.2mol/L KNO3 5ml。然后将三角烧瓶置于真空干燥器中，接上真空泵抽气，放气后，圆片即沉于溶液中（如果没有真空泵，也可以用20ml注射器代替，将反应液及叶子圆片一起倒入注射器中，用手指堵住注射器出口小孔，然后用力拉注射器使真空，如此抽气放气反复进行多次，即可使圆片中的空气抽去而沉于溶液中）。将三角烧瓶置于30℃温箱中，使不见光，保温作用30分钟，然后分别吸注意取样前叶子要进行一段时间的光合作用，以积累碳水化合物，如果组织中的碳水化合物含量低，会使得酶的活性降低，此时则可于反应溶液中加入30μg3—磷酸甘油醛或1，6—二磷酸果糖，能显著增加保温30分钟结束时，吸取反应溶液1ml于一试管中，加入磺胺试剂2ml及α—萘胺试剂2ml，混合摇匀，静置30分钟，用比色计进行比色测 3. ．绘制标准曲线与重氮化作用及偶联作用的速度有关，温度、酸浓度等都影响显色速度，同时也影响灵敏度，但如果标准与样品的测定都在相同条件下进行，则显色速度相同，彼此可以比较。吸取不同浓度的NaNO2溶液（例如5、4、3、2、1、0.5μg/ml）1ml于试管中，加入磺胺试剂2ml及α—萘胺试剂2ml，混合摇匀，静置30分钟（或于一定温度的水俗中保温30分钟），立即于分光光度计中进行测定，测定时的波长为520nm，比色，读取吸光度或透光率。然后，以吸光度为纵坐标，NaNO2浓度为横坐标。于毫米方格纸上绘制吸光度—浓度曲线。实验作业1．试比较不同植物的酶活性。2．试比较取样前植物处于照光或黑暗条件下酶活性的不同。参考文献1．陈薇、张德颐：1980。植物组织中硝酸还原酶的提取测定和纯化，植物生理学通讯，1980(4)：45—49。2．周树、郑相穆：1985。硝酸还原酶体内分析方法的探讨，植物生理学通讯，1985(1)：47—49。3．Hageman,R.H.and D.P. ．Hucklesby:1971.Methods in Enzymology,23A:491—503. 4．Radin.J.W.:1973.Plant Physiology,51:332—336. 5．Snell,F.D.and C.T.Snell:1949.Colorimetric Methods of Analysis,Vol.II,802—807 （华东师范大学张志良）参考资料：硝酸还原酶活性的测定一、材料用具及仪器药品木茨叶或菠菜叶子、蓖麻叶、721型分光光度计、真空泵（或注射器）、保温箱、天平、真空干燥器、钻孔器、三角瓶、移液管、烧杯、
硝酸还原酶的测定 一、实验目的和要求 掌握体内法测定植物组织中的硝酸还原酶原理和方法，明确诱导酶含义。 二、实验内容和原理 硝酸还原酶(NR)是植物氮素同化的关键酶，与作物吸收和利用氮肥有关。它催化植物体内的硝酸盐还原为亚硝酸盐: --产生的NO可以从组织内渗透到外界溶液中，并积累在溶液中，测定NO含量的增加，即表示该酶活22 性的大小。 装 -NO含量的测定用磺胺比色法。在酸性溶液中产生的亚硝酸盐与对–氨基苯磺酸(或对–氨基苯磺酰2 订 胺)反应产生重氮，再与α–萘胺(或萘基乙烯二胺)偶联形成紫红色的偶氮化合物。生成的红色偶氮 线化合物在540nm波长下有最大吸收峰，可用分光光度法测定，利用标准曲线确定溶液中NO2-含量。三、主要仪器设备 1、实验仪器分光光度计，真空泵，温箱，天平，2个烧杯，移液管若干，试管3支，剪刀。 2、实验试剂 0.1mol/L pH7.5的磷酸缓冲液，对-氨基苯磺酸溶液，α-萘胺溶液，亚硝酸钠标准液 3、实验材料在15-25? 蒸馏水培养一周的大麦苗两组，一组加KNO3，一组加NH4Cl，在白天置光照下处理。 四、操作方法和实验步骤
、剪取新鲜的叶片两组，一组是处理苗0.51g，另一组是对照苗0.50g，叶片各剪为0.5~1cm的碎片，压1 实。 2、两组中各加入15ml的酶促反应液。 3、真空抽取10min，充分交换细胞内外液。 4、加盖在30?的保温箱中保温20min。 5、去除材料，用移液管取4ml反应液，加入2ml磺胺，加入2ml苯基，放置15min。 6、比色:在540nm的波长下分光光度测定亚硝酸的OD值。 7、空白管:4mlH2O +磺胺溶液2ml+萘基乙烯二胺溶液2ml ,室温放置15min同样在540nm的波长下分光光度测定亚硝酸的OD值。 五、实验数据记录和处理 称重: 处理苗0.51g;对照苗0.50g OD值:处理苗0.513A;对照苗0.050A - NO含量标准曲线:Y=257.29X- 4.8262(X=OD值;Y=NO2含量(nmol)) 2---有标准曲线得出NO的含量:处理苗:C NO=127.16nmol 对照苗:C NO=8.038nmlo 222--1-1硝酸还原酶活力(nmol NO?g?h)= 根据OD值从标准曲线上查得的NO2(nmol)× 3 × 15/4/m2 -1-1-1-1 --硝酸还原酶活力:处理苗=2805 nmol NO?g?h 对照苗=180.855 nmol NO?g?h22 六、实验结果与分析 1、实验结果分析:实验表明用硝酸钾处理的苗比用氯化铵处理的苗硝酸还原酶活力更强～而且根据测出 的亚硝酸的含量～处理苗是对照苗的10倍左右～远比旁边几组的高～因为可能是因为在取材的时候～取了粘有培养液的根部～但并没有用蒸馏水洗去吸附在上面的硝酸根、亚硝酸根～或者根部的硝酸还原酶活性更多,猜测,。 2、诱导时如用NaNO3 替代KNO3结果会如何，为什么,
首都师范大学生命科学学院实验报告 实验题目硝酸还原酶活性的测定 一、实验原理 硝酸还原酶是植物氮素作用中的关键性酶，硝酸还原酶作用于 NO 使之还原为 NO 。 NO -+ NADH + H + — NO 2- + NAD + + H 2O 产生的NO 可以从植物组织渗透到外界溶液中，积累在溶液中。因此，测定反 应液中NO 含量的增加即表明酶活性的大小。 NO 含量的测定----磺胺法 NO 2-与磺胺和-萘胺在酸性条件下生成粉红色化合物，用比色法在520nm 下读 取光密度值。 —、实验用品 1. 材料：完全营养的小麦苗，缺氮培养的小麦苗 2. 仪器和用具：722型分光光度计，剪刀，真空泵，电子天平，温箱，烧杯，移液 枪，tip 头(两种规格：1000卩I ，200卩I ) 三、实验步骤 1. 分别配制反应液于小烧杯中 (1) 0.1M 磷酸缓冲液5ml +蒸馏水5ml (2) 0.1M 磷酸缓冲液 5ml + 0.2MKNQ 5ml 2. NO 2- 的获得 (1) 称取新鲜叶片0.5g 共四份,剪成小片，分别置于小烧杯内的反应液中。 (2) 在真空干燥器中抽气20min,使叶片沉于溶液底部，溶液即可渗入组织内取代其 中的空气， 内部产生的NO 可渗透到外部溶液中。 3.将小烧杯转到30 r 温箱,使其不见光,保温20min 。 4.用5卩g/ml NaNQ 母液配制标准梯度溶液 5、4、3、2、1、0.5、0.1、 0 卩 g/ml 。 5.吸取不同浓度的NaNOmI 于试管中，加入磺胺试剂2ml 及a -萘胺试剂2ml ，混 合均匀，在60r 水浴中保温20min ，于比色杯中，在520nm 下进行比色，读取光 密度，然后做出光密度一浓 度曲线，以光密度为纵坐标， 体步骤及结果如下表和下图所示。 课程名称植物生理实验 实验时间2010331 成绩 姓名唐倪文 班级_3 学号 1090800032 NaNO 浓度为横坐标。具
硝酸还原酶（Nitrate Reductase，NR）活性测定试剂盒使用说明 可见分光光度法50管/24样产品简介： NR（EC1.7.1.3）广泛存在于植物中，是植物硝态氮转化为氨态氮的关键酶，也是诱导酶，对作物的产量和品质有影响。 NR催化硝酸盐还原为亚硝酸盐，NO3ˉ+NADH+H＋→NO2ˉ+NAD＋+H2O；产生的亚硝酸盐能够在酸性条件下，与对氨基苯磺酸及α-萘胺定量生成红色偶氮化合物；生成的红色偶氮化合物在540nm有最大吸收峰，可用分光光度法测定。 试验中所需的仪器和试剂： 可见分光光度计、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。 产品内容： 诱导剂储备液：液体50mL×1瓶，4℃保存。 提取液：液体50mL×1瓶，4℃保存。 试剂一：液体20mL×1瓶，-20℃保存。 试剂二：液体10mL×1瓶，-20℃保存。 试剂三：液体25mL×1瓶，4℃保存。 试剂四：液体25mL×1瓶，4℃保存。 试剂五：标准储备液1mL，-20℃保存。 诱导剂应用液的配制：用时将诱导剂储备液稀释10倍，即取10mL诱导剂储备液加90mL 蒸馏水，充分混匀。
0.1umol/mL的标准液的配制：用时将试剂五稀释100倍，即取0.1ml试剂五加9.9mL 蒸馏水，充分混匀。 操作步骤： 一、样品测定的前处理： 1、取适量诱导剂于烧杯中，将新鲜标本洗净，滤纸吸干，放入诱导剂应用液中（淹没即可），浸泡2h，取出样本，滤纸吸干后，-20℃冷冻30min，取出样本，滤纸吸干。（根据需要进行诱导处理） 2、称取约0.1g样本，加入1mL提取液，冰浴研磨，4000g，4℃离心10min，取上清冰上放置待测。 二、NR测定操作： 1，分光光度计预热30min以上，调节波长至540nm，蒸馏水调零。 2，样本测定（在EP管中加入下列试剂） 试剂名称（μL）测定管对照管标准管空白管 样本100100 0.1μmol/mL NaNO2100 双蒸水500100 试剂一375375375 试剂二125125125 混匀后，37℃（哺乳动物）或25℃(其他物种）水浴30min 试剂三250250250250 试剂四250250250250 混匀，显色20min，4000g常温离心10min，取上清，540nm下比色。
实验三、硝酸还原酶和谷氨酰胺合成酶活性的测定 一、硝酸还原酶的测定 [原理]： 硝酸还原酶（NR）是植物氮素同化的关键酶，它催化植物体内的硝酸盐还原为亚硝酸盐，产生的亚硝酸盐与对-氨基苯磺酸（或对-氨基苯磺酰胺）及α-萘胺（或萘基乙烯胺）在酸性条件下定量生成红色偶氮化合物。 生成的红色偶氮化合物在540nm有最大吸收峰，可用分光光度法测定。硝酸还原酶活性可由产生的亚硝态氮的量表示。一般以每克鲜重含氮量表示，即以ug.g-1.h-1为单位。NR的测定可分为活体法和离体法。活体法步骤简单，适合快速、多组测定。离体法复杂，但重复性较好。 [试剂] 1．亚硝酸钠标准溶液：准确称取分析纯NaNO20.9857g溶于去离子水后定容至1 000ml，然后再吸取5ml定容至1000ml，即为含亚硝态氮1ug.ml-1的标准液；2．0.1molpH7.5的磷酸缓冲液：Na2HPO4.12H2O30.0905g与NaH2PO4.2H2O 2.4965g加去离子水溶解后定容至1 000ml； 3．1%（W/V）溶液：1.0g 对氨基苯磺酸溶于100ml 3 mol.L-1HCL中（25ml浓盐酸加水定容至100ml 即为 3 mol.L-1HCL）； 4．0.02%（W/V）萘基乙烯胺溶液：0.020g萘基乙烯胺溶于100ml 去离子水中，贮于棕色瓶中； 5．0.1mol.L-1KNO3溶液：2.5275g KNO3溶于250Ml 0.1mol.L-1Ph7.5的磷酸缓冲液中； 6．0.025mol.L-1Ph 8.7 的磷酸缓冲液：8.864 0g Na2HPO4.12H2O，0.0570g KH2OP4.3H2O，溶于1 000ml去离子水中； 7．30%三氯乙酸溶液：30g三氯乙酸。水溶后定容至100ml。 [方法]； 摇匀后在25度下保温30min，然后在540nm下比色测定。以亚硝态氮（ug）为横坐标（X），吸光值为纵坐标（Y）建立回归方程。 2.样品中硝酸还原酶活力测定 1.在取材的前一天加50mmol/L KNO3或NaNO3到培养苗的水中就可以诱导酶的产生。 2.称取作物叶片0.5g（共3份，剪成1cm 左右的小段（均匀），放入3只三角瓶中，其中 1份作对照，另外2份作酶活性测定用。 3.反应：先向对照三角瓶中加入1ml30%三氯乙酸溶液，然后各三角瓶中都加入9ml 0.1mol/L KNO3溶液，混匀后立即放入干燥器中，抽气30分钟（期间几次通入空气，再 抽真空，使叶片完全沉入瓶底，后在25℃黑暗中反应0.5小时，分别向测定瓶（对照瓶除外）加入1ml30%三氯乙酸终止酶反应。
货号：QS1800 规格：50管/24样硝酸还原酶（Nitrate Reductase，NR）活性测定试剂盒说明书 分光光度法 正式测定前务必取 2-3个预期差异较大的样本做预测定 测定意义： NR（ EC 1.7.1.3）广泛存在于植物中，是植物硝态氮转化为氨态氮的关键酶，也是诱导酶，对作物的产量和品质有影响。 测定原理： O；产生的亚硝酸NR催化硝酸盐还原为亚硝酸盐，NO3ˉ +NADH+H＋→ NO2ˉ +N AD＋ +H 2 盐能够在酸性条件下，与对–氨基苯磺酸及α- 萘胺定量生成红色偶氮化合物；生成的红色偶氮化合物在 540 nm 有最大吸收峰，可用分光光度法测定。 自备实验用品及仪器： 可见分光光度计、水浴锅、台式离心机、1mL玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。 试剂的组成和配制： 诱导剂储备液：液体50mL×1瓶，4℃保存。 提取液：液体50mL×1瓶，4℃保存。 试剂一：液体10mL×1瓶，-20℃保存。 试剂二：液体4mL×1瓶，-20℃保存。 试剂三：液体15mL×1瓶，4℃保存，（如出现结晶析出，60℃-90℃水浴溶解后使用）； 试剂四：液体15mL×1瓶，4℃避光保存。 试剂五：标准储备液1mL，-20℃保存。 诱导剂应用液的配制：用时将诱导剂储备液稀释10倍，即取10mL诱导剂储备液加90mL 蒸馏水，充分混匀。 0.1μmol/mL的标准液的配制：用时将试剂五稀释100倍，即取 0.1ml试剂五加9.9mL蒸馏水，充分混匀。 样品测定的前处理： 组织的前处理： （1）取适量诱导剂于烧杯中，将新鲜标本洗净，滤纸吸干，放入诱导剂应用液中（淹没即可），浸泡2h，取出样本，滤纸吸干后，-20℃冷冻30min，取出样本，滤纸吸干。（一般不要诱导处理，预测定结果没有活性则需要诱导处理） （2）按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。 细菌或培养细胞的前处理： 先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。 测定步骤： 第1页，共2页
首都师范大学生命科学学院实验报告 课程名称植物生理实验实验时间2010.3.31 成绩 姓名唐倪文班级3 学号1090800032 实验题目硝酸还原酶活性的测定 一、实验原理 硝酸还原酶是植物氮素作用中的关键性酶，硝酸还原酶作用于NO 3 -使之还原为 NO 2 -。 NO 3- + NADH++ H+ → NO 2 -+ NAD++ H 2 O 产生的NO 2 -可以从植物组织渗透到外界溶液中，积累在溶液中。因此，测定反 应液中NO 2 -含量的增加即表明酶活性的大小。 NO 2 -含量的测定----磺胺法 NO 2 -与磺胺和 -萘胺在酸性条件下生成粉红色化合物，用比色法在520nm下读取光密度值。 二、实验用品 1.材料：完全营养的小麦苗，缺氮培养的小麦苗 2.仪器和用具：722型分光光度计，剪刀，真空泵，电子天平，温箱，烧杯，移液枪，tip头（两种规格：1000μl，200μl） 三、实验步骤 1.分别配制反应液于小烧杯中 (1)0.1M磷酸缓冲液5ml + 蒸馏水5ml (2)0.1M磷酸缓冲液5ml + 0.2MKNO 3 5ml 2. NO 2 -的获得 (1)称取新鲜叶片0.5g共四份,剪成小片,分别置于小烧杯内的反应液中。 (2)在真空干燥器中抽气20min,使叶片沉于溶液底部,溶液即可渗入组织内取代其 中的空气,内部产生的NO 2 -可渗透到外部溶液中。 3.将小烧杯转到30℃温箱,使其不见光,保温20min。 4.用5μg/ml NaNO 2 母液配制标准梯度溶液5、4 、 3 、 2 、 1 、 0.5 、0.1、0 μg/ml。 5.吸取不同浓度的NaNO 2 1ml于试管中，加入磺胺试剂2ml及α-萘胺试剂2ml，混合均匀，在60℃水浴中保温20min，于比色杯中，在520nm下进行比色，读取光 密度，然后做出光密度—浓度曲线，以光密度为纵坐标，NaNO 2 浓度为横坐标。具体步骤及结果如下表和下图所示。
硝酸盐还原试验 ? ?减少硝酸盐含量的测试可以帮助鉴定奈瑟氏球菌，并将其与莫拉氏菌和金氏菌等其他菌种区分开。 ?它有助于区分淋病奈瑟氏球菌和反硝化克氏杆菌。 ?它有助于识别棒状杆菌。
? ?被测生物具有强大的硝酸盐还原酶，可将硝酸盐进一步还原为氨或分子N2。 注意： 仅需向培养物中添加少量锌粉，便需要进一步测试。锌粉的作用是将硝酸盐还原为亚硝酸盐。 注意颜色的变化。添加锌粉后，如果颜色变为红色，则表示硝酸盐未还原。 硝酸盐还原测试需要哪些材料？ ?用倒置的Durhams管专门培养基硝酸盐肉汤 ?试剂种类 oα萘胺试剂 o亚硫酸试剂 o锌粉 ?刻录机 ?接种环 ?滴管 ?被测试的生物 ?保温箱 2. 孵化。 3. 向肉汤中加入一滴磺胺酸和一滴α萘胺。 4. 如果颜色变为红色，则表示被测生物对硝酸盐还原测试呈阳性。
如果在添加必要的试剂后培养物未变红，则需要执行下一步，即添加锌粉。仔细检查颜色是否变化。如果颜色变为红色，则表示被测生物对硝酸盐还原测试呈阴性。 ? 亚硝酸盐。但是，应执行另一步骤以确认结果是否为真阴性。为什么？因 为某些生物体具有将硝酸盐进一步还原为亚硝酸盐的另一个分子的能力。 因此，您需要在肉汤中添加少量锌粉。锌的作用是它将催化硝酸盐还原为 亚硝酸盐。如果介质的颜色变为红色，则表示结果为真负片。如果添加锌 粉后颜色未发生变化，则表示结果为阳性。 ?阳性–如果添加试剂后颜色变为樱桃红色，则硝酸盐还原测试为阳性。如果采取了其他步骤（例如添加锌粉），则在添加锌粉后介质的颜色未变为红色的情况下，结果为肯定。 安全措施 试剂α萘胺和亚硫酸是有毒的，吞咽时可能极为有害和致命。这些试剂应具有良好的腐蚀性，因此应妥善处理，并且不应与皮肤，眼睛和呼吸道接触。 如果试剂与您的眼睛接触，应立即用水冲洗并寻求医疗帮助。另一方面，锌粉与水接触后极易燃烧。 存放锌粉时，必须确保将其存放在密闭且干燥的容器中。万一着火，请勿用水。您可以使用沙子或二氧化碳灭火。
硝酸还原酶(NR)提取液 简介： 硝酸还原酶(Nitrate reductase，NR)是一种氧化还原酶，可分为参与硝酸盐同化的同化型还原酶和催化以硝酸盐为活体氧化的最终电子受休的硝酸盐呼吸异化型(呼吸型)还原酶。硝酸还原酶是植物氮素代谢中氮素同化的关键酶，该酶与作物吸收利用氮肥有关，对作物的产量和质量有影响，因此可以把硝酸还原酶的活力当作营养诊断养、农田施肥或作物育种的生理生化指标。 Leagene 硝酸还原酶(NR)提取液主要用于裂解植物组织，提取样品中的丙酮酸脱羧酶。该试剂仅用于科研领域，不宜用于临床诊断或其他用途。 组成： 自备材料： 1、蒸馏水 2、离心管或试管 3、匀浆器或研钵 4、低温离心机 操作步骤(仅供参考)： 1、取植物组织清洗干净，切碎，置于冰箱。 2、配制硝酸还原酶提取工作液：取出硝酸还原酶提取液液和PMSF，恢复至室温，混合，混匀，即配即用，不易久置，否则蛋白酶抑制剂PMSF 的效率会有所下降。 3、加入预冷的硝酸还原酶提取工作液，冰浴情况下充分匀浆或研磨。 4、离心，留取上清液即为硝酸还原酶粗提液，保存，用于硝酸还原酶的检测或其他用途。计算： 组织或植物粗酶液获得率(ml)=上清液体积(ml)/组织或植物质量×100% 注意事项：编号 名称CS0471 Storage 试剂(A):硝酸还原酶提取液500ml 4℃避光试剂(B):PMSF 1ml -20℃使用说明书1份
1、实验材料应尽量新鲜，如取材后不立即使用，应存于-20-80℃。 2、硝酸还原酶容易失活，提取和测定时均应操作迅速，尽量在4℃操作。 3、如果测定植物样本，取样最好在晴天进行，最好提前一天施些硝态氮肥，取样部位应 一致。 4、待测样品中不能含有磷酸酶抑制剂，同时需避免反复冻融。 5、所测样本的值高于标准曲线的上限，应用丙酮酸脱羧酶提取工作液稀释样品后重新测 定。 6、为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。 有效期：12个月有效。 相关： 编号名称 CS0001ACK红细胞裂解液(ACK Lysis Buffer) DC0032Masson三色染色液 DF0135多聚甲醛溶液(4%PFA) NR0001DEPC处理水(0.1%) NR0002Trizol(总RNA提取试剂) PS0013RIPA裂解液(强) TC1167植物总糖和还原糖检测试剂盒(硝基水杨酸法)
货号：QS1813 规格：50管/24样 亚硝酸还原酶（Nitrite reductase，NiR ）试剂盒说明书 可见分光光度法 注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。 测定意义： 硝酸还原酶（NiR）是一类能催化亚硝酸盐还原的酶，广泛存在于微生物及植物体内，是自然界氮循环过程中的关键酶，可以将亚硝酸盐降解为NO或NH3，从而减少环境中亚硝态氮的积累，降低因亚硝酸盐累积而造成的对生物体的毒害作用。 测定原理： 亚硝酸还原酶可将NO 2-还原为 NO，使样品中参与重氮化反应生成紫红色化合物的NO 2 -减少， 即540nm处吸光值的变化可反应亚硝酸还原酶的活性。 自备实验用品及仪器： 天平、研钵、可见分光光度计、水浴锅、低温离心机、1mL 玻璃比色皿。 试剂的组成和配制： 提取液：液体80mL×1 瓶，4℃保存。 试剂一：液体10mL×1 瓶，4℃保存。 试剂二：粉剂×1 瓶，4℃保存。临用前加 12mL 蒸馏水溶解。 试剂三：液体12mL×1 瓶，4℃保存。（如出现沉淀可以 70-80℃加热溶解） 试剂四：液体25mL×1 瓶，4℃避光保存。（如出现沉淀可以 70-80℃加热溶 解） 试剂五：液25mL×1 瓶，4℃避光保存。 工作液：临用前根据用量将试剂四和试剂五以 1:1 的比例混合。 酶液提取： 1. 组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液），进行冰浴匀浆。10000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。 2．细菌、真菌：按照细胞数量（10 4 个）：提取液体积（mL）为 500~1000：1的比例（建议500万细胞加入 1mL 提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率 300w，超声 3 秒，间隔 7 秒，总时间 3min）；然后 10000g，4℃离心 10min，取上清置于冰上待测。 测定操作表： 第1页，共3页
实验 6 植物体内硝酸还原酶活力的测定 硝酸还原酶（ nitrate reductase,NR ），是植物氮素同化的关键酶，它催化植物体内的硝酸盐还原为亚硝酸盐（ NO 3 ˉ +NADH+H ＋→ NO 2 ˉ +NAD ＋ +H 2 O ）。产生的亚硝酸盐与对–氨基苯磺酸（或对–氨基苯磺酰胺）及α - 萘胺（或萘基乙烯二胺）在酸性条件下定量生成红色偶氮化合物。其反应如下： 生成的红色偶氮化合物在 540 nm 有最大吸收峰，可用分光光度法测定。硝酸还原酶活性可由产生的亚硝态氮的量表示。一般单位鲜重以 N μg ／（ g · h ）为单位。 NR 的测定可分为活体法和离体法。活体法步骤简单，适合快速、多组测定。离体法复杂，但重复性较好。 Ⅰ离体法 二、实验材料、试剂与仪器设备 （一）实验材料 水稻、小麦叶片、幼穗等。 （二）试剂 1 ．亚硝酸钠标准溶液：准确称取分析纯 NaNO 2 0.9857 g 溶于无离子水后定容至 1000 mL ，然后再吸取 5 mL 定容至 1000 mL ，即为含亚硝态氮的 1 μg ／ mL 的标准液。 2 ． 0.1 mol/L pH 7.5 的磷酸缓冲液： Na 2 HPO 4 · 12H 2 O 30.0905 g 与 NaH 2 PO 4 · 2H 2 O 2.4965 g 加无离子水溶解后定容至 1000 mL 。 3 ． 1 ％磺胺溶液： 1.0 g 磺胺溶于 100 mL 3mol/L HCl 中（ 25 mL 浓盐酸加水定容至 100 mL 即为 3 mol/L HCl ）。 4 ． 0.02 ％萘基乙烯胺溶液： 0.0200 g 萘基乙烯胺溶于 100 mL 无离子水中，贮于棕色瓶中。
实验二、硝酸还原酶活性的测定-活体法 [原理]： 硝酸还原酶（NR）是植物氮素同化的关键酶，它催化植物体内的硝酸盐还原为亚硝酸盐，产生的亚硝酸盐与对-氨基苯磺酸（或对-氨基苯磺酰胺）及α-萘胺（或萘基乙烯胺）在酸性条件下定量生成红色偶氮化合物。 生成的红色偶氮化合物在540nm有最大吸收峰，可用分光光度法测定。硝酸还原酶活性可由产生的亚硝态氮的量表示。一般以每克鲜重含氮量表示，即以ug.g-1.h-1为单位。NR 的测定可分为活体法和离体法。活体法步骤简单，适合快速、多组测定。离体法复杂，但重复性较好。 [试剂] 1．亚硝酸钠标准溶液：准确称取分析纯NaNO20.9857g溶于去离子水后定容至1 000ml，然后再吸取5ml定容至1000ml，即为含亚硝态氮1ug.ml-1的标准液； 2．0.1molpH7.5的磷酸缓冲液：Na2HPO4.12H2O30.0905g与NaH2PO4.2H2O 2.4965g加去离子水溶解后定容至1 000ml； 3．1%（W/V）溶液：1.0g 对氨基苯磺酸溶于100ml 3 mol.L-1HCL中（25ml浓盐酸加水定容至100ml 即为 3 mol.L-1HCL）； 4．0.02%（W/V）萘基乙烯胺溶液：0.020g萘基乙烯胺溶于100ml 去离子水中，贮于棕色瓶中； 5．0.1mol.L-1KNO3溶液：2.5275g KNO3溶于250Ml 0.1mol.L-1Ph7.5的磷酸缓冲液中；6．0.025mol.L-1Ph 8.7 的磷酸缓冲液：8.864 0g Na2HPO4.12H2O，0.0570g KH2OP4.3H2O，溶于1 000ml去离子水中； 7．30%三氯乙酸溶液：30g三氯乙酸。水溶后定容至100ml。 [方法] 摇匀后在25度下保温30min，然后在540nm下比色测定。以亚硝态氮（ug）为横坐标（X），吸光值为纵坐标（Y）建立回归方程。 2.样品中硝酸还原酶活力测定 1.在取材的前一天加50mmol/L KNO3或NaNO3到培养苗的水中就可以诱导酶的产生。 2.称取作物叶片0.5g（共3份，剪成1cm 左右的小段（均匀），放入3只三角瓶中，其中 1份作对照，另外2份作酶活性测定用。 3.反应：先向对照三角瓶中加入1ml30%三氯乙酸溶液，然后各三角瓶中都加入9ml 0.1mol/L KNO3溶液，混匀后立即放入干燥器中，抽气30分钟（期间几次通入空气，再 抽真空，使叶片完全沉入瓶底，后在25℃黑暗中反应0.5小时，分别向测定瓶（对照瓶除外）加入1ml30%三氯乙酸终止酶反应。 4.比色测定：将各瓶摇匀静置2min后，各取2ml反应液，加入1ml磺胺，摇匀后再加入 1ml萘基乙烯胺，再在35℃水浴中显色15min ，后比色，540nm 5.空白溶液：2ml蒸馏水+1ml磺胺+1mlα-萘胺。同样和样液一样进行水浴15min。
硝酸还原酶活力的测定 1原理 硝酸还原酶（ nitrate reductase,NR ），是植物氮素同化的关键酶，它催化植物体内的硝酸盐还原为亚硝酸盐（NO3ˉ+NADH+H ＋→ NO2ˉ+NAD＋+H 2 O ）。产生的亚硝酸盐与对–氨基苯磺酸（或对–氨基苯磺酰胺）及α- 萘胺（或萘基乙烯二胺）在酸性条件下定量生成红色偶氮化合物。其反应如下： 生成的红色偶氮化合物在 540 nm 有最大吸收峰，可用分光光度法测定。硝酸还原酶活性可由产生的亚硝态氮的量表示。一般单位鲜重以ug/(g·h) 为单位。NR 的测定可分为活体法和离体法。活体法步骤简单，适合快速、多组测定。离体法复杂，但重复性较好。 药品配制 1)0.1mol/L pH为7.5的磷酸缓冲液: 称取Na2HPO4·12H2O 30.0905g, NaH2 PO4·2H2O 2.4965g, 溶解并定容至1000ml. 2)0.2 mol/L KNO3溶液: 2.5275g KNO3用pH为7.5的磷酸缓冲液溶解并定容至100 ml. 3)30%三氯乙酸：75.0g 三氯乙酸用水定容至250mL。 4)硝酸试剂的配制: 0.5g α-萘胺加水煮沸1-2分钟,趁热加入1.25g 对氨基苯磺酸,再 加250 ml冰醋酸,加水定容至500mL.保存于暗处.
2酶活性测定 1)称样: 从田间取回新鲜叶片，用水洗净，吸干水份，用打孔器打出直径 0.5cm 的叶圆 片，用蒸馏水冲洗叶圆片 1 ～ 2 次，用吸水纸把水吸干后，称取等重叶圆片4份，每份重 0.5 g ，放入50mL的三角瓶中。 2)抽提: 正常处理—→向每个三角瓶中先后加入5mL磷酸缓冲液溶和5mL硝酸溶液； 对照处理—→先加1mL三氯乙酸,再加其它两种溶液。 在黑暗的条件下用真空泵反复抽提30分钟. 3)放置: 在黑暗,25℃条件下放置30分钟. 4)终止反应: 正常处理—→向三角瓶中加入1mL三氯乙酸； 对照处理—→不加三氯乙酸。 然后吸取反应液 2mL，然后各加8 mL硝酸试剂.30分钟后用分光光度计在 540 nm 波长下比色. 3计算公式 NR活性ug/(g·h) ＝B*11*10/（2*m*h） B:比色液中浓度ug/g·h M:样品质量 g H:时间（小时）