硝酸还原酶活性的测定

赵志杰，史国安，董新纯编的《植物生理学实验指导》）

参考陈建勋，王晓峰主编的《植物生理学实验指导》,P27～29

硝酸还原酶活性的测定

原理

硝酸还原酶是植物氮素代谢作用中关键性酶，与作物吸收和利用氮

简单易行，在一般条件下都能做到。

红色的偶氮染料。反应液的酸度大则增加重氮化作用的速度，但降低偶联作用的速度，颜色比较稳定。增加温度可以增加反应速度，但降低重氮盐的稳定度，所以反应需要在相同条件下进行。这种方法非常灵敏，能测定每ml含0.5μg的NaNO2。

仪器药品

721型分光光度计真空泵（或注射器）

保温箱天平

真空干燥器钻孔器

三角烧瓶移液管

烧杯

0.1mol/L磷酸缓冲液，pH7.5（见附表2）。

0.2mol/L KNO3：溶解20.22g KNO3于1000ml蒸馏水中。

磺胺试剂：1g磺胺加25ml浓盐酸，用蒸馏水稀释至100ml。

α—萘胺试剂：0.2gα—萘胺溶于含1ml浓盐酸的蒸馏水中，稀释至100ml。

NaNO2标准溶液：1g NaNO2用蒸馏水溶解成1000ml。然后吸取5ml，再加蒸馏水稀释成1000ml，此溶液每ml含有NaNO2 5μg，用时稀释之。

操作步骤

1. ．将新鲜取回的叶片（蓖麻、烟草、向日葵、油菜、小麦、棉花等均可）水洗，用吸水纸吸干，然后用钻孔器钻成直径约1cm的圆片，用蒸馏水洗涤2梍3次，吸干水分，然后于台天平上称取等重的叶子圆片两份，每份约0.3—0.4g （或每份取50个圆片），分别置于含有下列溶液的50ml三角烧瓶中：(1)0.1mol/L 磷酸缓冲溶液(pH7.5)5ml+蒸馏水5ml；(2)0.1mol/L磷酸缓冲溶液

(pH7.5)5ml+0.2mol/L KNO3 5ml。然后将三角烧瓶置于真空干燥器中，接上真空泵抽气，放气后，圆片即沉于溶液中（如果没有真空泵，也可以用20ml注射器代替，将反应液及叶子圆片一起倒入注射器中，用手指堵住注射器出口小孔，然后用力拉注射器使真空，如此抽气放气反复进行多次，即可使圆片中的空气抽去而沉于溶液中）。将三角烧瓶置于30℃温箱中，使不见光，保温作用30分钟，然后分别吸

注意取样前叶子要进行一段时间的光合作用，以积累碳水化合物，如果组织中的碳水化合物含量低，会使得酶的活性降低，此时则可于反应溶液中加入

30μg3—磷酸甘油醛或1，6—二磷酸果糖，能显著增加

保温30分钟结束时，吸取反应溶液1ml于一试管中，加入磺胺试剂2ml及α—萘胺试剂2ml，混合摇匀，静置30分钟，用比色计进行比色测

3. ．绘制标准曲线

与重氮化作用及偶联作用的速度有关，温度、酸浓度等都影响显色速度，同时也影响灵敏度，但如果标准与样品的测定都在相同条件下进行，则显色速度相同，彼此可以比较。

吸取不同浓度的NaNO2溶液（例如5、4、3、2、1、0.5μg/ml）1ml于试管中，加入磺胺试剂2ml及α—萘胺试剂2ml，混合摇匀，静置30分钟（或于一定温度的水俗中保温30分钟），立即于分光光度计中进行测定，测定时的波长为520nm，比色，读取吸光度或透光率。然后，以吸光度为纵坐标，NaNO2浓度为横坐标。于毫米方格纸上绘制吸光度—浓度曲线。

实验作业

1．试比较不同植物的酶活性。

2．试比较取样前植物处于照光或黑暗条件下酶活性的不同。

参考文献

1．陈薇、张德颐：1980。植物组织中硝酸还原酶的提取测定和纯化，植物生理学通讯，1980(4)：45—49。

2．周树、郑相穆：1985。硝酸还原酶体内分析方法的探讨，植物生理学通讯，1985(1)：47—49。

3．Hageman,R.H.and D.P. ．Hucklesby:1971.Methods in

Enzymology,23A:491—503.

4．Radin.J.W.:1973.Plant Physiology,51:332—336.

5．Snell,F.D.and C.T.Snell:1949.Colorimetric Methods of

Analysis,Vol.II,802—807

硝酸还原酶(NR)的测定采用离体法：（1g样）（参考陈建勋，王晓峰主编的《植物生理学实验指导》,P27～29）

亚硝酸钠标准溶液（1µg/ml）：称NaNO2 0.9857g ,定容到1000ml，再吸5ml 定容到1000ml。

0.1 mol/L pH7.5的磷酸缓冲溶液：30.0905g Na2HPO4·12H2O + 2.4965g NaH2PO4·2H2O，加蒸馏水定容到1000ml。

3mol/L HCl：125ml浓盐酸加蒸馏水定容到500ml。

1％磺胺溶液：5.0g磺胺溶于500ml 3mol/L HCl中。

0.2％a-萘胺溶液：1.0g a-萘胺溶于125ml冰醋酸后用蒸馏水定容到500ml，贮于棕色瓶中。

0.1mol/L KNO3溶液：5.055g KNO3溶于500mln 0.1 mol/L pH7.5的磷酸缓冲溶液。

0.025mol/L pH8.7的磷酸缓冲溶液：Na2HPO4·12H2O 8.8640g +

NaH2PO4·2H2O 0.0570g，加蒸馏水定容到1L。

提取缓冲液：1.211g半胱氨酸+ 0.372g EDTA，溶于1L 0.025 mol/L pH8.7的磷酸缓冲溶液。

2mg/ml NADH 溶液：0.5g NADH溶于250ml 0.1 mol/L pH7.5的磷酸缓冲溶液（临用前配制）。

首先标制作准曲线:

取7支洁净烘干的15ml刻度试管加试剂，即配成0～2.0μg的系列标准亚硝态氮溶液。摇匀后在30℃保温箱或恒温水浴中保温30min，然后在540nm波长下比色。以亚硝态氮（μg）为横坐标（x），光密度值为纵坐标（y）绘标准曲线或建立回归方程。

各试剂加入顺序

管号

1

2

3

4

5

6

7

亚硝酸钠标准液(ml)

0.2

0.4

0.8

1.2

1.6

2.0

蒸馏水(ml)

2.0

1.8

1.6