全血胆碱酯酶活性测定

实习三有机磷经皮染毒对全血胆碱酯酶活性的影响（一）目的和意义1、学习经皮染毒技术，掌握急性经皮毒性试验的方法。

2、观察有机磷经皮肤吸收后对机体的急性毒性作用。

3、掌握全血胆碱酯酶活性的测定方法及原理。

（二）仪器1．解剖剪刀、弯剪、镊子、灌胃针。

2．恒温水箱(37±0.5℃)。

3．离心机。

4．分光光度计，10mm比色皿。

5．血红蛋白吸管（20μl）；刻度吸管（5.0ml，2.0ml，1.0ml）；离心管（10ml）；容量瓶（10ml，100ml）；试管（10ml）、烧杯等。

（三）试剂1．受试物：有机磷（由指导教师自定）；溶剂，根据受试物的理化性质选定。

2．磷酸盐缓冲液(1/15m mol/L，pH7.40)：称取9.07g无水磷酸二氢钾(KH2PO4)，用水溶解并稀释至1000mL(甲液)；称取23.87g磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)，用水溶解并稀释至1000mL(乙液)。

取甲液19.2mL与乙液80.8mL混合即得。

3．生理盐水：氯化钠8.5g/L。

4．硫代乙酰胆碱(ASCh)：称取72.3mg ASCh(生物试剂)溶于生理盐水中，并稀释到10mL；置冰箱中保存，临用时以生理盐水稀释10倍。

5．5，5′－联硫代－双－2－硝基苯甲酸(DTNB)溶液：称取19.8mg DTNB，滴加磷酸盐缓冲液(4.2)，搅拌，直至完全溶解，溶液透明(大约加2mL)，再用生理盐水(4.3)稀释至10mL，置冰箱中保存，临用时以生理盐水稀释10倍。

出现黄色即弃用。

6．抑制剂毒扁豆碱：取1mg左右柳酸毒扁豆碱，溶于0.5mL生理盐水(4.3)，临用时配制，严防污染其他试剂及器材。

7．1m mol/L谷胱甘肽标准溶液：精确称取3.07mg还原型谷胱甘肽用水溶解，移入10mL容量瓶中，稀释至刻度。

此液1mL相当于1μmol谷胱甘肽。

因其易被氧化，应于用时配制，水必须先经煮沸去氧冷却后使用。

（四）实验步骤1．实验动物的选择实验动物可选择健康豚鼠或家兔，也可用大鼠。

全血胆碱酯酶活性的测定欧阳家百（2021.03.07）——羟胺三氯化铁法实验目的1. 掌握三氯化铁比色法的实验原理、分析步骤及酶测定的临床意义。

2. 了解常见全血胆碱酯酶活性测定方法的优缺点、注意事项。

3. 学会末梢血的采集。

实验原理血液胆碱酯酶使乙酰胆碱分解为胆碱和乙酸。

未被胆碱酯酶水解而剩余的乙酰胆碱和碱性羟胺反应，形成红色羌酸铁络合物。

颜色深度与剩余乙酰胆碱的量成正比。

在波长520nm比色定量，由水解的乙酰胆碱的量计算胆碱酯酶活性。

试剂和材料蒸馏水盐酸溶液(1＋2)碱性羟胺溶液磷酸盐缓冲液(PH＝7.20) 三氯化铁溶液氯化乙酰胆碱标准液分光光度计10mL比色管漏斗恒温水浴箱，控温±0.5℃采血针头血色素吸管采样、运输和保存用血色素吸管，取指血20μL，注入比色管中(事先加入0.98mL磷酸盐缓冲液)，立即进行测定。

实验步骤A 样品管+0.98mL 磷酸盐缓冲液+0.02mL全血 37℃水浴 5min+1.0mL乙酰胆碱应用液 37℃水浴 30minB 对照管0.98mL磷酸盐缓冲液+0.02mL全血 37℃水浴 5min+1.0mL水 37℃水浴 30minC 标准管1.0mL 磷酸盐缓冲液 37℃水浴 5min + 1.0mL乙酰胆碱应用液37℃水浴 30minD 空白管1.0mL 磷酸盐缓冲液 37℃水浴 5min +1.0mL水37℃水浴 30min水浴之后对A、B、C、D四个试管分别进行以下操作：1.加入 4.0mL 碱性羟胺溶液，充分振摇 2min；2.加入 2.0mL 盐酸溶液，充分振摇 2min；3.加入 2.0mL 三氯化铁溶液，充分振摇；4.滤纸过滤，520nm比色。

实验结果表1-1 520nm波长下样品的吸光度样品编号 A B C D吸光度 0.299 0.003 0.538 0.000结果计算①计算酶活性的绝对值带入得： Xs==3.149μmolXs：水解乙酰胆碱的浓度，μmol(0.02mL·37℃·30min)；试剂空白为参比的在波长520nm处样品管的吸光度值；A：以B：以试剂空白为参比的在波长520nm处对照管的吸光度值；C：以试剂空白为参比的在波长520nm处标准管的吸光度值。

胆碱酯酶（CHE）的测定
一、原理：血清及组织中CHE使乙酰胆碱水解成胆碱和乙酸，未被水解的剩余乙酰胆碱与羟胺作用生成乙酰羟胺，再与铁离子在酸性溶液中形成棕色复合物，根据颜色深浅推算出酶的活力。

二、试剂：
1、试剂一：溶液60ml×1瓶，室温保存。

2、试剂二：乙酰胆碱粉剂×1支，-20℃保存，稀释液5ml×1瓶，4℃保存。

80μmol/ml 乙酰胆碱底物贮备液的配制：将一支乙酰胆碱碱粉剂倒入5ml稀释液中即成，4℃。

8μmol/ml 乙酰胆碱应用液的配制：贮备液：试剂=1：9稀释。

3、试剂三：甲粉剂×1支；乙液30ml×1瓶；丙液30ml×1瓶；室温保存。

试剂三应用液的配制：每次测试前将甲粉倒入乙液中，充分摇匀，根据需要量将甲乙混合液与丙液等量混合，充分混匀，配成试剂三应用液，现用现配。

4、试剂四：溶液30ml×1瓶，室温保存。

5、试剂五：溶液20ml×1瓶，室温保存。

6、试剂六：粉剂×1瓶，稀释液30ml×1瓶，测试前将稀释液倒入粉剂中，充分混匀，避光
4℃冷藏。

测各管吸光度值。

四、计算：
1、定义：血清中CHE的计算：每毫升血清在37℃和底物作用20分钟，分解1μmol乙酰胆
碱为1个活力单位。

2、计算公式：
血清中CHE活力。

全血胆碱酯酶活性的测定——羟胺三氯化铁法实验目的1. 掌握三氯化铁比色法的实验原理、分析步骤与酶测定的临床意义。

2. 了解常见全血胆碱酯酶活性测定方法的优缺点、注意事项。

3. 学会末梢血的采集。

实验原理血液胆碱酯酶使乙酰胆碱分解为胆碱和乙酸。

未被胆碱酯酶水解而剩余的乙酰胆碱和碱性羟胺反应，形成红色羌酸铁络合物。

颜色深度与剩余乙酰胆碱的量成正比。

在波长520nm比色定量，由水解的乙酰胆碱的量计算胆碱酯酶活性。

试剂和材料蒸馏水盐酸溶液(1＋2)碱性羟胺溶液磷酸盐缓冲液(PH＝7.20)三氯化铁溶液氯化乙酰胆碱标准液分光光度计10mL比色管漏斗恒温水浴箱，控温±0.5℃采血针头血色素吸管采样、运输和保存用血色素吸管，取指血20μL，注入比色管中(事先加入0.98mL磷酸盐缓冲液)，立即进行测定。

实验步骤A 样品管+0.98mL 磷酸盐缓冲液+0.02mL全血37℃水浴5min+1.0mL乙酰胆碱应用液37℃水浴30minB 对照管0.98mL磷酸盐缓冲液+0.02mL全血37℃水浴5min +1.0mL水37℃水浴30minC 标准管1.0mL 磷酸盐缓冲液37℃水浴5min +1.0mL乙酰胆碱应用液37℃水浴30minD 空白管 1.0mL 磷酸盐缓冲液37℃水浴5min +1.0mL水37℃水浴30min水浴之后对A、B、C、D四个试管分别进行以下操作：1.加入4.0mL 碱性羟胺溶液，充分振摇2min；2.加入2.0mL 盐酸溶液，充分振摇2min；3.加入2.0mL 三氯化铁溶液，充分振摇；4.滤纸过滤，520nm比色。

实验结果表1-1 520nm波长下样品的吸光度样品编号 A B CD吸光度 0.299 0.003 0.538 0.000结果计算①计算酶活性的绝对值带入得： Xs=7538.0299.0003.0538.0⨯-+=3.149μmol Xs ：水解乙酰胆碱的浓度，μmol(0.02mL ·37℃·30min)；A ：以试剂空白为参比的在波长520nm 处样品管的吸光度值； B ：以试剂空白为参比的在波长520nm 处对照管的吸光度值；C ：以试剂空白为参比的在波长520nm 处标准管的吸光度值。

胆碱酯酶活力测定的中毒标准
胆碱酯酶（ChE）活力测定可以用于检测有机磷农药、神经毒剂等对胆碱酯酶的抑制作用，从而判断暴露者是否中毒。

根据WHO的建议，胆碱酯酶活力的下限可以作为暴露标准的参考。

下面是常用的胆碱酯酶活力参考值：
胆碱酯酶活力正常参考值：在25℃下，健康人血浆中胆碱酯酶活力的正常范围为3300~12,000 U/L。

有机磷农药中毒参考值：血浆中胆碱酯酶活力下降到正常值的30%以下，表示中毒程度较轻；下降到正常值的10%以下，表示中毒程度较重。

神经毒剂中毒参考值：血浆中胆碱酯酶活力下降到正常值的50%以下，表示中毒程度较轻；下降到正常值的20%以下，表示中毒程度较重。

需要注意的是，由于胆碱酯酶活力受多种因素影响，如个体差异、性别、年龄等，因此，这些参考值仅供参考，具体应根据实际情况进行判断。

同时，在实际应用中，还应结合其他检测方法和中毒症状进行综合分析。

胆碱酯酶活性测定方法
胆碱酯酶（acetylcholinesterase, AChE）活性测定方法主要有以下几种常用的方法：
1. 利用酶促反应产生的色素变化测定：
(1) 比色法：将胆碱酯酶底物乙酰胆碱与碱性溴化镉等试剂反应，生成黄色产物，利用比色计或分光光度计测定产物的吸光度，间接测定胆碱酯酶活性。

(2) 荧光法：将胆碱酯酶底物与荧光染料反应，使底物和产物之间发生荧光变化，利用荧光光谱仪测定荧光强度，间接测定胆碱酯酶活性。

2. 利用电化学方法测定：常用的是反应器中使用碳电极或银电极，利用底物和产物之间的电位差变化测定胆碱酯酶活性。

3. 利用放射性同位素标记测定：将底物或产物标记上放射性同位素，通过测定放射性同位素的放射性强度，间接测定胆碱酯酶活性。

4. 利用质谱法测定：将底物和产物分离并通过质谱仪测定其质荷比，间接测定胆碱酯酶活性。

需要注意的是，不同的测定方法适用于不同的实验目的和样本类型，具体的选择应根据实验需求和设备条件来确定。

全血胆碱酯酶活性的分光光度测定方法羟胺三氯化铁法Blood—Determinatoin of cholinesterase activity—Spectrophotometricmethod—Hydroxylamine-ferric chloride method1 主题内容与适用范围本标准规定了血中胆碱酯酶活性的分光光度测定方法——羟胺三氯化铁法。

本法最低检测浓度为2.4μmol/L。

本标准适用于正常人和接触有机磷农药人员血中胆碱酯酶活性的测定。

2 原理血液胆碱酯酶使乙酰胆碱分解为胆碱和乙酸。

未被胆碱酯酶水解而剩余的乙酰胆碱与碱性羟胺反应，生成乙酰羟胺，然后，与三氯化铁在酸性溶液中反应，形成红色羟肟酸铁络合物。

颜色深度与剩余乙酰胆碱的量成正比。

在波长520 nm比色定量，由水解的乙酰胆碱的量计算胆碱酯酶活性。

3 仪器3.1分光光度计，10mm比色杯。

3.2比色管，10 mL。

3.3普通漏斗，40mm。

3.4恒温水浴箱，控温士0.5℃。

3.5采血针头。

3.6血色素吸管，有20μL刻度。

4试剂本标准所用试剂均为分析纯试剂。

4.1 实验用水，蒸馏水或具同等纯度的去离子水。

4.2 盐酸，=1.19 g/mL。

4.3 盐酸溶液(1+2)。

4.4 碱性羟胺溶液，临用前将139 g/L盐酸羟胺溶液和140 g/L氢氧化钠溶液等体积混合。

4.5 磷酸盐缓冲液(pH=7.20)，准确称取磷酸氢二钠()8.36g和磷酸二氢钾()1.36g，用水溶解并稀释到500mL，保存在冰箱内。

4.6 三氯化铁溶液，称取10 g三氯化铁()，加0.84 mL盐酸(4.2)，然后加水100mL。

贮存于棕色瓶中。

4.7 氯化乙酰胆碱标准液，精确称取乙酰胆碱1.2716g，用磷酸盐缓冲液(4.5)溶解，并稀释到100 mL，此溶液1mL相当于70μmol乙酰胆碱，为贮备液。

临用前，取此溶液用磷酸盐缓冲液(4.5)稀释10倍，此溶液1 mL相当于7μmol乙酰胆碱，为应用液。

实验五全血胆碱酯酶活性测定全血胆碱脂酶活性分光光度测定方法WS/T67—1996[原理]胆碱脂酶水解硫代乙酰胆碱（ASCH，acetyl-thilcholine）,生成硫代乙酰胆碱和乙酸。

硫代胆碱与硫基现色几剂，5,5-联硫代双-2-硝基苯甲酸[DTNB，dithio-bis-(nitribenzoic acid)]反应，形成黄色化合物5-巯基-2-硝基苯甲酸（TNB）。

在412nm长下比色定量。

[仪器]分光光度计，5mm比色杯；恒温水浴；离心机；血红蛋白吸管，20ul；刻度吸管，5.0ml, 2.0 ml；试管10ml；容量瓶，10ml。

[试剂]1．1/15mol/L磷酸盐缓冲液（PH 7.4）；生理盐水：氯化钠0.85/100ml；硫代乙酰胆碱（ASCh）溶液：称取ASCh 72.3mg，溶于生理盐水中并稀释成10ml。

置冰箱中保存。

临用时，以生理盐水稀释10倍；5,5-联硫代双-2-硝基苯甲酸（DTNB）溶液：称取DTMB19.8mg，滴加硫酸缓冲液并搅拌至完全溶解，溶液透明（约2ml）。

再用生理盐水稀释至10ml ，置冰箱中保存。

临用时，用生理盐水稀释10倍；出现黄色即弃取；毒扁豆碱溶液（抑制剂）：取毒扁豆碱约1mg，溶于1ml生理盐水中。

临用时配制。

严防污染其他试剂和器材。

2．巯基标准溶液：准确称取还原型谷胱甘肽3.07mg，用水（经煮沸并冷却的水）溶解并移入10ml容量瓶中，稀释至刻度。

此溶液1ml相当于1μmol谷胱甘肽。

因谷胱甘肽易氧化，故溶液应临用时配制。

[采样、运输和保存]取10ul末梢血滴入置有肝素钠或3ml磷酸缓冲液的小试管中，混匀，加塞。

置冰瓶中运送，于4℃冰箱内保存，尽快分析。

[分析步骤]1．标准曲线的绘制：取5支试管，按实习10—6配制标准。

以水为参比测定吸光度。

从各标准管的吸光度减去0管，以酶活性为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。

2．样品测定实习表10—6 标准管的配制管号0 1 2 3 4巯基标准溶液，ml 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4水，ml 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1缓冲溶液，ml 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 DTNB溶液，ml 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5胆碱酯酶活性，μmol/ml 0.0 20 40 60 801．将样品从冰箱中取出，使恢复到室温，混匀待用。