全血胆碱酯酶活性的测定

实习三有机磷经皮染毒对全血胆碱酯酶活性的影响（一）目的和意义1、学习经皮染毒技术，掌握急性经皮毒性试验的方法。

2、观察有机磷经皮肤吸收后对机体的急性毒性作用。

3、掌握全血胆碱酯酶活性的测定方法及原理。

（二）仪器1．解剖剪刀、弯剪、镊子、灌胃针。

2．恒温水箱(37±0.5℃)。

3．离心机。

4．分光光度计，10mm比色皿。

5．血红蛋白吸管（20μl）；刻度吸管（5.0ml，2.0ml，1.0ml）；离心管（10ml）；容量瓶（10ml，100ml）；试管（10ml）、烧杯等。

（三）试剂1．受试物：有机磷（由指导教师自定）；溶剂，根据受试物的理化性质选定。

2．磷酸盐缓冲液(1/15m mol/L，pH7.40)：称取9.07g无水磷酸二氢钾(KH2PO4)，用水溶解并稀释至1000mL(甲液)；称取23.87g磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)，用水溶解并稀释至1000mL(乙液)。

取甲液19.2mL与乙液80.8mL混合即得。

3．生理盐水：氯化钠8.5g/L。

4．硫代乙酰胆碱(ASCh)：称取72.3mg ASCh(生物试剂)溶于生理盐水中，并稀释到10mL；置冰箱中保存，临用时以生理盐水稀释10倍。

5．5，5′－联硫代－双－2－硝基苯甲酸(DTNB)溶液：称取19.8mg DTNB，滴加磷酸盐缓冲液(4.2)，搅拌，直至完全溶解，溶液透明(大约加2mL)，再用生理盐水(4.3)稀释至10mL，置冰箱中保存，临用时以生理盐水稀释10倍。

出现黄色即弃用。

6．抑制剂毒扁豆碱：取1mg左右柳酸毒扁豆碱，溶于0.5mL生理盐水(4.3)，临用时配制，严防污染其他试剂及器材。

7．1m mol/L谷胱甘肽标准溶液：精确称取3.07mg还原型谷胱甘肽用水溶解，移入10mL容量瓶中，稀释至刻度。

此液1mL相当于1μmol谷胱甘肽。

因其易被氧化，应于用时配制，水必须先经煮沸去氧冷却后使用。

（四）实验步骤1．实验动物的选择实验动物可选择健康豚鼠或家兔，也可用大鼠。

胆碱酯酶检查的流程和注意事项下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。

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胆碱酯酶活性测定方法
胆碱酯酶（acetylcholinesterase, AChE）活性测定方法主要有以下几种常用的方法：
1. 利用酶促反应产生的色素变化测定：
(1) 比色法：将胆碱酯酶底物乙酰胆碱与碱性溴化镉等试剂反应，生成黄色产物，利用比色计或分光光度计测定产物的吸光度，间接测定胆碱酯酶活性。

(2) 荧光法：将胆碱酯酶底物与荧光染料反应，使底物和产物之间发生荧光变化，利用荧光光谱仪测定荧光强度，间接测定胆碱酯酶活性。

2. 利用电化学方法测定：常用的是反应器中使用碳电极或银电极，利用底物和产物之间的电位差变化测定胆碱酯酶活性。

3. 利用放射性同位素标记测定：将底物或产物标记上放射性同位素，通过测定放射性同位素的放射性强度，间接测定胆碱酯酶活性。

4. 利用质谱法测定：将底物和产物分离并通过质谱仪测定其质荷比，间接测定胆碱酯酶活性。

需要注意的是，不同的测定方法适用于不同的实验目的和样本类型，具体的选择应根据实验需求和设备条件来确定。

全血胆碱酯酶活性的分光光度测定方法羟胺三氯化铁法Blood—Determinatoin of cholinesterase activity—Spectrophotometricmethod—Hydroxylamine-ferric chloride method1 主题内容与适用范围本标准规定了血中胆碱酯酶活性的分光光度测定方法——羟胺三氯化铁法。

本法最低检测浓度为2.4μmol/L。

本标准适用于正常人和接触有机磷农药人员血中胆碱酯酶活性的测定。

2 原理血液胆碱酯酶使乙酰胆碱分解为胆碱和乙酸。

未被胆碱酯酶水解而剩余的乙酰胆碱与碱性羟胺反应，生成乙酰羟胺，然后，与三氯化铁在酸性溶液中反应，形成红色羟肟酸铁络合物。

颜色深度与剩余乙酰胆碱的量成正比。

在波长520 nm比色定量，由水解的乙酰胆碱的量计算胆碱酯酶活性。

3 仪器3.1分光光度计，10mm比色杯。

3.2比色管，10 mL。

3.3普通漏斗，40mm。

3.4恒温水浴箱，控温士0.5℃。

3.5采血针头。

3.6血色素吸管，有20μL刻度。

4试剂本标准所用试剂均为分析纯试剂。

4.1 实验用水，蒸馏水或具同等纯度的去离子水。

4.2 盐酸，=1.19 g/mL。

4.3 盐酸溶液(1+2)。

4.4 碱性羟胺溶液，临用前将139 g/L盐酸羟胺溶液和140 g/L氢氧化钠溶液等体积混合。

4.5 磷酸盐缓冲液(pH=7.20)，准确称取磷酸氢二钠()8.36g和磷酸二氢钾()1.36g，用水溶解并稀释到500mL，保存在冰箱内。

4.6 三氯化铁溶液，称取10 g三氯化铁()，加0.84 mL盐酸(4.2)，然后加水100mL。

贮存于棕色瓶中。

4.7 氯化乙酰胆碱标准液，精确称取乙酰胆碱1.2716g，用磷酸盐缓冲液(4.5)溶解，并稀释到100 mL，此溶液1mL相当于70μmol乙酰胆碱，为贮备液。

临用前，取此溶液用磷酸盐缓冲液(4.5)稀释10倍，此溶液1 mL相当于7μmol乙酰胆碱，为应用液。

实验五全血胆碱酯酶活性测定全血胆碱脂酶活性分光光度测定方法WS/T67—1996[原理]胆碱脂酶水解硫代乙酰胆碱（ASCH，acetyl-thilcholine）,生成硫代乙酰胆碱和乙酸。

硫代胆碱与硫基现色几剂，5,5-联硫代双-2-硝基苯甲酸[DTNB，dithio-bis-(nitribenzoic acid)]反应，形成黄色化合物5-巯基-2-硝基苯甲酸（TNB）。

在412nm长下比色定量。

[仪器]分光光度计，5mm比色杯；恒温水浴；离心机；血红蛋白吸管，20ul；刻度吸管，5.0ml, 2.0 ml；试管10ml；容量瓶，10ml。

[试剂]1．1/15mol/L磷酸盐缓冲液（PH 7.4）；生理盐水：氯化钠0.85/100ml；硫代乙酰胆碱（ASCh）溶液：称取ASCh 72.3mg，溶于生理盐水中并稀释成10ml。

置冰箱中保存。

临用时，以生理盐水稀释10倍；5,5-联硫代双-2-硝基苯甲酸（DTNB）溶液：称取DTMB19.8mg，滴加硫酸缓冲液并搅拌至完全溶解，溶液透明（约2ml）。

再用生理盐水稀释至10ml ，置冰箱中保存。

临用时，用生理盐水稀释10倍；出现黄色即弃取；毒扁豆碱溶液（抑制剂）：取毒扁豆碱约1mg，溶于1ml生理盐水中。

临用时配制。

严防污染其他试剂和器材。

2．巯基标准溶液：准确称取还原型谷胱甘肽3.07mg，用水（经煮沸并冷却的水）溶解并移入10ml容量瓶中，稀释至刻度。

此溶液1ml相当于1μmol谷胱甘肽。

因谷胱甘肽易氧化，故溶液应临用时配制。

[采样、运输和保存]取10ul末梢血滴入置有肝素钠或3ml磷酸缓冲液的小试管中，混匀，加塞。

置冰瓶中运送，于4℃冰箱内保存，尽快分析。

[分析步骤]1．标准曲线的绘制：取5支试管，按实习10—6配制标准。

以水为参比测定吸光度。

从各标准管的吸光度减去0管，以酶活性为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。

2．样品测定实习表10—6 标准管的配制管号0 1 2 3 4巯基标准溶液，ml 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4水，ml 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1缓冲溶液，ml 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 DTNB溶液，ml 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5胆碱酯酶活性，μmol/ml 0.0 20 40 60 801．将样品从冰箱中取出，使恢复到室温，混匀待用。

三氯化铁分光光度法测定全血胆碱酯酶原理：在血液胆碱酯酶作用下，乙酰胆碱发生水解；剩余的乙酰胆碱与碱性羟胺反应生成乙酰羟胺，后者在酸性条件下，与三氯化铁反应生成红棕色羟肟酸铁配合物，呈色强度与剩余乙酰胆碱的量成正比，在５２０ｎｍ波长处比色，间接测定血中胆碱酯酶活性。

此法最低检测浓度２.４μmol/L（20μl血样），测定范围2.4~1000.0μmol/L。

步骤：1、标准的配制：取6支比色管，分别加入0.0、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00ml，7μmol/ml的氯化乙酰胆碱标准溶液，加标准缓冲液（PBS）至1.0ml，各加1.0ml水，配制成乙酰胆碱含量为：0.0、1.4、2.8、4.2、5.6、7.0μmol标准溶液系列。

向各管中加入4.0ml 碱性羟胺，振摇2min。

加2.0ml盐酸溶液，振摇2min。

加2.0ml三氯化铁溶液，振摇。

溶液与520nm处，以第一管为参比，测定吸光度值。

以乙酰胆碱含量（μmol）对相应的吸光度值绘制标准曲线。

2、样品的处理：取4支比色管，分别为1（A,B）和2（A,B），向各管加入0.98mlPBS，20μl血样。

置于37℃水浴中预热5min。

向1和2的A管加入1.0ml乙酰胆碱标准溶液。

自加入乙酰胆碱开始计时，在37℃左右（正负0.5℃）准确反应30min，每间隔10min振摇1次，同时，向1和2的B管加入1.0ml乙酰胆碱标准溶液，充分振摇。

取出比色管，各管立即加入4.0ml碱性羟胺溶液，充分振摇2min。

然后，A和B管各加2.0ml盐酸溶液，振摇2min。

加2.0ml三氯化铁溶液，振摇后样品离心。

滤液与520nm处，以标准第一管为参比，测定吸光度。

分别用各管吸光度值计算其中乙酰胆碱剩余量，从而得出1,2号管胆碱酯酶活性。

实验数据及结果：标准曲线吸光度值如下表表1标准曲线吸光度值0 1.4 2.8 4.2 5.6 7.0胆碱酯酶溶液体积吸光度值0.004 0.139 0.260 0.395 0.475 0.600可得标准曲线为：y=0.081x+0.028 拟合方程为R2=0.994样品吸光度如下表表2样品吸光度1号2号A管0.576 0.555B管0.643 0.6561A中含有乙酰胆碱的量是6.7654 1B中含有7.5926 消耗乙酰胆碱为0.8272μmol2A中含有乙酰胆碱的量为6.5061 2B中含有7.7531 消耗乙酰胆碱量为1.247μmol由此数据可知2号管中乙酰胆碱消耗量大，估1号内乙酰胆碱酶活性被抑制为注射有有机磷农药的小鼠血样。

胆碱酯酶活性测定（干化学法）操作规程1.预期用途快速定性检测人血清、血浆中胆碱酯酶活性。

2.检验原理胆碱酯酶催化水解乙酰胆碱（Ach）生成乙酸和胆碱，乙酸能使指示剂溴百里香酚蓝（BTB）发生颜色变化，通过颜色的改变反映生成乙酸的量，乙酸量的多少即可表示酶活力的高低；反应结果可与胆碱酯酶活性测定比色表直接进行比色测定。

3.主要组成成份本产品系由乙酰胆碱(Ach)、溴百里香酚蓝等试剂固定在通过双面胶粘贴有中速滤纸的PVC板上，干燥后裁切成胆碱酯酶活性测定试纸。

4.样本要求4.1、在无菌条件下采集静脉血样本，尽快分离血清或血浆以避免溶血。

4.2、检测时应使用新鲜标本。

4.3、常规抗凝剂不影响检测结果。

5.检验方法在进行测试前必须先完整阅读使用说明书。

5.1、取测定试纸一片，放在培养皿中，向反应纸片中央加上8～10μl待测新鲜血清或血浆，盖上培养皿盖保持密封（保持一定的湿度以防血清蒸发，同时防外界酸碱影响），放置37℃水浴箱中并开始记时。

5.2、11分30秒后取出，所呈现色泽与胆碱酯酶活力比色表(见图一)比较，即得胆碱酯酶活力单位。

5.3、如无水浴箱，根据测定时室温，查附表确定反应所需时间，在到达反应所需时间后立即比色。

5.4、正常值30-80单位，如低于30单位的标本，欲求得较精确的结果，可将时间延长一倍，再观察结果。

附表：20～40℃内反应终点时间表6.结果判定阳性：胆碱酯酶活力单位小于30。

阴性：胆碱酯酶活力单位大于等于30。

无效：向胆碱酯酶活性测定试纸加上待测新鲜血清或血浆后不出现墨绿色，表明标本受污染或试纸失效。

7.检验结果的解释7.1、阳性结果表明胆碱酯酶活力降低，可能是由于有机磷农药中毒或肝实质性损害（如急性肝炎、慢性肝炎活动期、肝硬化失代偿期及肝癌等）造成。

7.2、阴性结果表明胆碱酯酶活性正常。

7.3、检验结果无效时应考虑标本是否受污染，如排除标本受污染，应换用其它批号胆碱酯酶活性试纸重新检测。