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12第五章 噬菌体载体

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基因克隆载体-噬菌体

基因克隆载体-噬菌体

细菌人工染色体载体BAC
在大肠杆菌F因子的基础上发展而来，容量 比YAC小，但具有YAC无可比拟的优点：
1. 可稳定遗传 2. 嵌合现象少 3. 操作容易
Thank You
YAC）。
酵利于基因克隆 包含的片段可以包含内含子和调控区 克隆的基因可以和酶、转录因子等相互作用
酵母人工染色体载体的不足
1. 存在嵌合现象
插入序列可能来自多个片段
2. 稳定性差
继代培养中容易丢失
3. 分离纯化操作难度大 4. 转化效率低
M13噬菌体载体
M13 噬菌体的增殖
在感染 E.coli 时，会产生临时的双链DNA分子。 双链DNA分子复制到一定数量时，停止复制，＋ 链指导合成相关蛋白，－链指导合成＋链DNA 。
M13噬菌体载体
M13噬菌体的构建策略 在间隔区（IS）添加选择标记基因和克隆位 点。
lacZ’ 基因
一、切去非必需区，抹去多余的限制性酶 切位点
用点突变或甲基化酶处理等方法使必须区内的
酶切位点失效，避免外源DNA插入非必须区。
λ类噬菌体载体的构建策略
二、加入选择标记基因
1. 包装容量 只有特定大小的片段才可以包装，大小选择 2. lac基因 颜色显示
λ类噬菌体载体的构建策略
三、体外包装系统
λ类噬菌体
溶源方式：
进入细菌的λDNA可整合入细菌的染色质DNA中， 细菌染色体DNA复制，传给细菌后代，这个稳定 潜伏在细菌染色质DNA中的λDNA称为原噬菌体， 含有原噬菌体的细菌称为溶源菌。 λDNA的整合是可逆的，原噬菌体可从宿主DNA 中切出，进入溶菌性方式的繁殖。
λ噬菌体载体的构建策略
λ类噬菌体
λ类噬菌体DNA全长48520bp

λ噬菌体载体名词解释

λ噬菌体载体名词解释

λ噬菌体载体是一种广泛应用于分子生物学和基因工程领域的载体，用于将外源DNA序列引入细菌细胞中。

噬菌体是一种寄生性病毒，可以感染细菌并在其内部复制。

而λ噬菌体是其中最为常见和常用的一种。

λ噬菌体载体通常由数万个碱基对的环状DNA组成，其中包含了多个重要的功能区域。

其中，最重要的功能区域是Origins of Replication（ORI），即复制起始点，负责引导DNA的复制。

此外，载体还包含了选择性标记基因，如抗生素抗性基因，以便在细菌培养基中筛选带有该载体的细菌。

λ噬菌体载体还含有多个限制内切酶切位点，这些切位点可以用于将外源DNA序列插入到载体的特定位置上。

通过将外源DNA与载体进行限制性内切酶切割，然后使用DNA连接酶进行连接，可以将外源DNA序列插入到载体的DNA链上。

这一过程称为重组。

一旦重组完成，λ噬菌体载体可以通过转化的方式引入到宿主细菌中。

转化是指将外源DNA 导入到细菌细胞中的过程。

一旦载体进入到细菌细胞中，它会在细菌细胞内部复制，并产生大量的噬菌体颗粒。

这些噬菌体颗粒可以感染其他细菌细胞，并将携带的外源DNA序列传递给它们。

λ噬菌体载体在分子生物学和基因工程研究中具有广泛的应用。

它可以用于构建基因文库，即将外源DNA序列插入到载体上，并通过转化的方式导入到细菌细胞中。

这样，研究人员就可以通过筛选和分析细菌细胞中的载体来获得感兴趣的外源DNA序列。

此外，λ噬菌体载体还可以用于基因表达，即将外源DNA序列插入到载体的表达位点上，以便在细菌细胞中大量产生特定的蛋白质。

总之，λ噬菌体载体是一种在分子生物学和基因工程领域中被广泛使用的载体。

它具有多个重要的功能区域，可以用于将外源DNA序列引入到细菌细胞中，并在其中进行复制和表达。

通过利用λ噬菌体载体，研究人员可以进行基因库构建、基因表达和其他相关研究，为生物技术的发展提供了重要的工具和平台。

12第五章 噬菌体载体

12第五章 噬菌体载体

234页



噬菌体：细菌病毒。 烈性噬菌体：感染寄主细胞后能进行复制、增殖，最后 引起细胞裂解的噬菌体。只有溶菌生长周期的噬菌体。 温和性噬菌体（溶原性噬菌体）：感染细菌后能使细菌 产生溶原性的噬菌体。既能进入溶菌生命周期又能进入 溶原生命周期的噬菌体。 溶原性：温和噬菌体感染细胞形成原噬菌体的过程。 原噬菌体：在溶原性细菌内存在的整合的或非整合的噬 菌体DNA。 溶原性细菌：细胞中含有以原噬菌体状态存在着的温和 噬菌体的细菌。 噬菌斑：在含细菌的固体培养基上，噬菌体使细菌细胞 裂解而形成的空斑。
(243页)
4. 噬菌体的溶源生命周期
Ⅱ、溶源周期的主要特征（以λ噬菌体为原型）： （1）噬菌体的DNA分子注入细菌细胞。 （2）经过短暂的转录。 （3）噬菌体的DNA分子插入到细菌染色体基因组 DNA上，变成原噬菌体。 （4）细菌继续生长、增殖，噬菌体的基因作为细 菌染色体的一部分进行复制。
(244页)

基因工程又称重组DNA技术 其实施至少要有四个必要的条件 1. 工具酶 2. 基因 3. 载体 4. 受体细胞

（《基因工程..》静国忠，85页）
(240页)
噬菌体定义： 是一类细菌病毒的总称。 噬菌体与质粒的区别 * 质粒：仅是一种含有复制起点的裸露的DNA分 子。 * 噬菌体：DNA分子除了复制起点之外，还有编 码外壳蛋白质的基因。
Ⅰ、若干基本概念

234页

噬菌体：细菌病毒。 烈性噬菌体：感染寄主细胞后能进行复制、增殖，最后 引起细胞裂解的噬菌体。只有溶菌生长周期的噬菌体。 温和性噬菌体（溶原性噬菌体）：感染细菌后能使细菌 产生溶原性的噬菌体。既能进入溶菌生命周期又能进入 溶原生命周期的噬菌体。 溶原性：温和噬菌体感染细胞形成原噬菌体的过程。 原噬菌体：在溶原性细菌内存在的整合的或非整合的噬 菌体DNA。 溶原性细菌：细胞中含有以原噬菌体状态存在着的温和 噬菌体的细菌。 噬菌斑：在含细菌的固体培养基上，噬菌体使细菌细胞 裂解而形成的空斑。

分子生物学-第5章-分子生物研究法(上)精选全文完整版

分子生物学-第5章-分子生物研究法(上)精选全文完整版

限制性核酸内切酶
限制性核酸内切酶(restriction endonuclease, RE)
一类能识别和切割双链DNA分子中特定碱基顺序的核酸 水解酶
Bam HⅠ
GGATCC CCTAGG
GCCTAG+
GATCC G
分类: Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ （基因工程技术中常用Ⅱ型）
命名
Hin dⅢ
Haemophilus influenzae 自主 复制能力的 DNA分子（ vector），如 病毒、噬菌体 和质粒等小分 子量复制子都 可以作为基因 导入的载体。
1970年Mandel和Higa发现，大肠杆菌细胞经适量氯化钙处 理后，能有效地吸收λ噬菌体DNA。
1972年，Cohen等人又报道，经氯化钙处理的大肠杆菌细 胞同样能够摄取质粒DNA。
把磷酸基团加到多聚核苷酸链的5'-OH末端（进行末端标记 实验或用来进行DNA的连接 在双链核酸的3'末端加上多聚单核苷酸
从DNA链的3'末端逐个切除单核苷酸
从DNA链的5'末端逐个切除单核苷酸 切除位于DNA链5'或3'末端的磷酸基团
1972 - Paul Berg,
Produced first recombinant DNA using
5.1 重组DNA技术回顾 5.2 DNA基本操作技术 5.3 RNA基本操作技术 5.4 SNP的理论与应用 5.5 基因克隆技术 5.6 蛋白质组与蛋白质组学技术
5.1 重组DNA技术回顾
三大成就 ：
1. 40年代确定了遗传信息的携带者，即基因的分子载体 是DNA而不是蛋白质，解决了遗传的物质基础问题；
• 基因工程是指在体外将核酸分子插入病毒、质粒 或其它载体分子，构成遗传物质的新组合，使之 进入原先没有这类分子的寄主细胞内并进行持续 稳定的繁殖和表达。

入噬菌体及质粒载体

入噬菌体及质粒载体

理想的质粒载体
(1)分子量小、多拷贝、松弛控制型; (2)具有多种常用的限制性内切酶的单切点; (3)能插入较大的外源DNA片段; (4)具有两个以上的遗传标记物，便于鉴定和 筛选。 (5)对宿主细胞无害。常用的质粒载体大小一 般在1kb至10kb之间，如PBR322、PUC系列、 PGEM系列和pBluescript(简称pBS)等。
Β-半乳糖苷酶失活的插入型载体
• 载体基因组中含有一个大肠杆菌的 lac5区段，编码着Β-半乳糖苷酶基因 lacZ。由这种载体感染到的大肠杆菌 lac-指示菌，涂布在添加IPTG和Xgal 的培养基上就会形成蓝色的噬菌斑。
替换型载体
• λ噬菌体的中央部分有一个可以被外源插入 的DNA分子所取代的DNA片段的克隆载体。
质粒载体的优缺点
• 质粒载体主要用于DNA分子的亚克隆，表达外源 蛋白，DNA序列的测定和基因的体外重新构建等。 • 1.与外源DNA重组操作简便； • 2.外源DNA在质粒载体中相对较稳定， • 3.质粒DNA的制备和纯化方便，快速简单，所以 得到广泛应用。 • 缺点： • 1.它容纳外源DNA片段有限，通常最多为15kb左 右，因为当质粒大于15kb时，转化效率明显下降。
质粒载体
质粒特点
• ①染色质外的双链共价闭合环形DNA（covalently closed
circuar DNA,cccDNA）可自然形成超螺旋结构，不同质 粒大小在2-300kb之间，＜15kb的小质粒比较容易分离纯
化，＞15kb的大质粒则不易提取。
• ②能自主复制，是能独立复制的复制子（autonomous
注 意
• λ噬菌体感染了寄主细胞之后，究竟是发生溶
菌反应还是溶源反应，这是由cI基因和cro基

噬菌体载体

噬菌体载体

第三章噬菌体载体一、填空题1．噬菌体之所以被选为基因工程载体，主要有两方面的原因：一是—-----------—；二是----------——。

2．第一个报道的全测序的单链DNA噬菌体是ФX174，DNA长5386个碱基对，共一个基因，为一环状DNA分子，基因组的最大特点是—----------—。

3．λ噬菌体的基因组DNA为———————kb，有——多个基因。

在体内，它有两种复制方式，扩增时(早期复制)按—-----—复制，成熟包装(晚期复制)则是按—--------—复制。

它有一个复制起点，进行—-------—向复制。

λ噬菌体的DNA既可以以线性存在又可以环状形式存在，并且能够自然成环。

其原因主要是在λ噬菌体线性DNA分子的两端各有一个——个碱基组成的天然黏性末端。

这种黏性末端可以自然成环。

成环后的黏性末端部位就叫做——————位点。

4．根据噬菌体的包装能力，将野生型λ噬菌体的基因组DNA改造成插入型载体，该载体的最小分子大小约为————kb，插入的外源片段最大不超过——————kb。

5．野生型的M13不适合用作基因工程载体，主要原因是————和--------------—。

6．黏粒(cosmid)是质粒—噬菌体杂合载体，它的复制子来自——、COS位点序列来自—--------—，最大的克隆片段达到—----------—kb。

7．有两类改造型的λ噬菌体载体，即插入型和取代型。

从酶切点看，插入型为——个，取代型为——个。

8．野生型的λ噬菌体DNA不宜作为基因工程载体，原因是：(1)---------------——(2)——————————(3)—---------------------—。

9． M13单链噬菌体的复制分为三个阶段：(1)————————(2)—-------------—，(3)———————————。

10．噬菌粒是由质粒和噬菌体DNA共同构成的，其中来自质粒的主要结构是—-----—，而来自噬菌体的主要结构是—-------------------—。

基因工程载体噬菌体载体课件


•24
（左右臂连接）
（三段自身连接） （插入片段）
•基因工程载体噬菌体载体
•25
（三）体外包装
λ噬菌体DNA体外重组后，一般必须经 过体外包装，然后以噬菌体感染的方式将
重组DNA导入E.coli细胞内。这是因为以感
染方式导入细胞的频率可达 106~108/μgDNA，而以转染（translation） 的方式导入的频率仅为103~105/ μgDNA。
特点是功能相近的基因在基 因组中聚集在一起。
•基因工程载体噬菌体载体
•12
λ噬菌体
组成特点：
双链线状DNA分子，
全长50kb，
含65个基因，
在其分子两端各含有12
个碱基的互补单链，是天
然的粘性末端，被称为
COS位点。
•基因工程载体噬菌体载体
•13
λ噬菌体感染细菌后的溶菌性生长和溶源性生长
溶菌性生长（lytic pathway） 噬菌体感染细菌后，借助其2个COS位点互补成环，在宿
主菌体内连续复制，合成大量基因产物，进而装配成噬菌体 颗粒，裂解宿主菌，释放出来的噬菌体又可感染其他细菌。 溶源性生长(lysogenic pathway)
噬菌体感染细菌后，可将自身DNA整合到细菌的染色体中 去，与之一起复制，并遗传给子代细胞，宿主细胞不被裂解 。
•基因工程载体噬菌体载体
•14
噬菌体
•41
•基因工程载体噬菌体载体
•42
Phage M13 replication in the host cell: Nicked by gene 2 protein
RNA pol +
RF DNA polIII
±
+

噬菌体载体


(刘志国，102-105页）
1. 噬菌体的结构及其核酸类型： 常用作基因工程的噬菌体： ◆双链噬菌体：λ噬菌体。 * 野生型λ噬菌体经过改造，已衍生出100多 种克隆载体。 *目前常用的有： EMBL系列、 λgt系列、 Charon系列。 ◆单链噬菌体：M13噬菌体。
2. 噬菌体的感染性


噬菌体或病毒DNA
噬菌体或病毒是一类非细胞微生物，能高效率、高 特异性地侵染宿主细胞，然后或自主复制繁殖，或整合
入宿主基因组中潜伏起来，而且在一定的条件下上述两
种状态还会相互转化。噬菌体或病毒的上述特性使得它
们的DNA能被开发成为基因工程的有用载体，因为：
高效率的感染性能使外源基因高效导入受体细胞；
(244页)
4. 噬菌体的溶源生命周期


另一种类型的溶源周期是以噬菌体T1为原 型。比较少见。 基本特征是：不存在噬菌体DNA分子的整 合作用体系，而是变成了一种进行独立复 制的环形的质粒DNA分子。
(243页)
4. 噬菌体的溶源生命周期
Ⅱ、溶源周期的主要特征（以λ噬菌体为原型）： （1）噬菌体的DNA分子注入细菌细胞。 （2）经过短暂的转录。 （3）噬菌体的DNA分子插入到细菌染色体基因组 DNA上，变成原噬菌体。 （4）细菌继续生长、增殖，噬菌体的基因作为细 菌染色体的一部分进行复制。
(244页)
(英含遗工词)


(241页)
2. 噬菌体的感染性



将少量的噬菌体颗粒加入到高浓度的细菌培养物中，并 在新形成的子代噬菌体导致寄主细胞发生第一次裂解之 前，将此培养物涂布在琼脂平板上，20-30分钟之内， 头一批感染的细菌细胞便会发生裂解，释放出子代噬菌 体颗粒。 由于在琼脂平板上长有许多细菌，所以释放出来的噬菌 体，便可迅速地吸附到邻近的细菌细胞上，重复发生感 染周期。 此种细菌的裂解反应是以最初被感染的细胞所在的位置 为中心，慢慢地向四周扩展，最后在琼脂平板上形成大 量的噬菌斑。

噬菌体载体复习题及答案.docx

噬菌体载体复习题及答案一、填空题1. 噬菌体之所以被选为基因工程载体，主要有两方面的原因：①它 在细菌中能够大量繁殖，这样有利于外源DNA 的扩增；②对某些噬菌 体(如入噬菌体)的遗传结构和功能研究的比较清楚，其大肠杆 宿主系统的遗传研究的比较详尽。

2. 入噬菌体基因组DNA 为48.5 kb,根据入噬菌体的包装能力，其 包装DNA 限度为37〜51 kb,为其本身基因组的75〜105 %。

将野生 型入噬菌体的基因组DNA 改造成插入型载体，如X ZAP II,该载体的 最小分子大小约为48.2kb,插入的外源片段最大不超过10. 2kb 。

构 建的入取代型载体XEMBL4,基因组大小为42. 36kb,填充DNA 片段为 14 kb,可容纳的外源DNA 分子最大为23 kb 。

3. 野生型的M13不适合用作基因工程载体，主要原因是没有合适的 限制性内切核酸酶识别位点和选 择标记。

4. 黏粒(cosmid)是质粒一噬菌体杂合载体，它的复制子来自质粒,大的克隆片段达到45 kb o 8.野生型的入噬菌体DNA 不宜作为基因工程载体，原因是：① 分子 质量大；②酶的多切点；③无选择标记。

cmCOS 位点序列来自入噬菌体，9. M13单链噬菌体的复制分为三个阶段：①SS-RF ；②RF-RF ；③ RF->SSo二、选择题（单选或多选）1.限制性内切核酸酶屁oR I在野生型的入噬菌体DNA中有5个切点，Hind III 有7 个切点，Banil I也有5个切点。

调整这些酶切位点的数量，主要通过（A ）。

A.体内突变B.完全酶切后连接C.部分酶切D.先用甲基化酶修饰后再酶切2.pBluescript M13载体在多克隆位点的两侧引入了T7和T3两个噬菌体的启动子，这样增加了该载体的功能，下述四种功能中哪一种是不正确的？（D ）A. 可以对插入到多克隆位点的外源片段进行转录分析B. 利用这两个启动子的通用引物进行PCR扩增C. 利用通用引物进行序列分析D.利用这两个启动子进行定点突变3. 下面关于细菌人工染色体（BAC）的特征描述，除了（C ）外都是正确的。

基因工程原理讲义：噬菌体载体与柯斯载体

第七讲噬菌体载体与柯斯载体中国科学院遗传与发育生物学研究所2017年8月目录一、噬菌体的一般问题1．何谓噬菌体2．噬菌体效价测定与双层平板法3．噬菌体的生命周期4．噬菌体的溶源生命周期5．超感染免疫6．溶源性的诱发7．Campbell模型二、λ噬菌体载体1．λ噬菌体的生物学概述2．λ噬菌体载体的构建(1)λ噬菌体载体构建的基本原理(2)插入型载体(3)替换型载体3．λ噬菌体载体的改良(1)Spi-正选择的λ噬菌体载体(2)具有内删除特性的λ噬菌体载体4．λ重组体DNA分子的体外包装(1)λ重组体DNA的转染作用(2)λ噬菌体的体外包装5．λ噬菌体DNA的包装限制问题(1)包装限制的概念(2)包装限制与λ噬菌体的克隆能力(3)包装限制的生物学意义6．λ重组体分子的选择方法(1)cI基因功能选择法(2)lacZ基因功能选择法(3)Spi-选择法三、柯斯质粒载体1．柯斯质粒的定义及其构建(1) 噬菌体的克隆能力(2)柯斯质粒载体定义(3)柯斯质粒pHC79的构建(4)柯斯质粒克隆能力及其组成2．柯斯质粒载体的特点3．柯斯质粒载体的改良4．柯斯克隆(1)定义(2)理论依据(3)柯斯质粒包装条件(4)柯斯克隆程序(5)柯斯克隆的优点5．柯斯克隆的改良(1)柯斯克隆的局限性及其克服办法(2)Ish-Horowicz-Burke克隆方案(3)Bates-Swift克隆方案噬菌体载体与柯斯质粒载体一、噬菌体的一般问题1．何谓噬菌体？(1)定义噬菌体英文名为Bacteriophage，简称phage，来源于希腊文“phages”，系指吞食之意，乃是一类细菌病毒的总称需要指出的是，“phage”这个英文单词既是单数又是复数形式。

作单数使用时是指一个噬菌体，如试管中含1个T4 phage；而用作复数使用时，则是指同一种噬菌体的众多颗粒，如试管中含有上百个的T4 phage。

“phages”是噬菌体的复数词，是指多种不同的噬菌体。

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1. λ噬菌体的分子生物学概述
(249页)
（1）基因组的结构： 碱基对数：48502。 cos位点：线性双链DNA分子的两端各有一条由12个核 苷酸组成的彼此完全互补的5’单链突出序列，即粘性末 端。注入到感染寄主细胞内的λ噬菌体的线性DNA分子， 会迅速地通过粘性末端之间的互补作用，形成双链 DNA分子。随后在DNA连接酶的作用下，将相邻的5’P和3’-OH基团封闭起来，并进一步超盘旋化。由这种 粘性末端结合形成的双链区称为cos位点。 cos位点： λ噬菌体线性双链DNA分子的两端各12个完 全互补的核苷酸粘性末端结合形成的双链区。
(240页)
1. 噬菌体的结构及其核酸类型： 噬菌体的核酸： 最常见的是：双链线性DNA。 还有双链环形DNA、 单链环形DNA、 单链线形DNA、 单链RNA。 有些噬菌体DNA碱基不是由标准的A、T、 C、G四种碱基组成。 如T4噬菌体DNA中没有C，取代的是5-羟甲 基胞嘧啶（HMC）。
(248页)
第二节 λ噬菌体载体

(248页)
λ噬菌体： * 分子量为31 x 106 dal。 * 中等大小的温和噬菌体。 * 已定位的基因至少有61个。 一半左右为必要基因：参与生命周期的活动。 另一部分为非必要基因：被外源基因取代后，不影 响噬菌体的生命功能。 人们可以根据需要改变 l-DNA 或宿主细胞的性质，使 噬菌体或处于溶源状态，或处于溶菌状态。（张)
在电子显微镜下观察正在复制的DNA， 复制的区域如一只眼睛（张玉静，101）
（张玉静，141）
（张玉静，141）
2. λ噬菌体载体的构建及其主要类型
(253页)
（1）构建的基本原理：野生型λ噬菌体DNA，一 种酶的酶切位点多。不适合作基因克隆的载体。 基本原理：删除多余限制位点。 构建的λ噬菌体的派生载体： * 插入型载体：只具有一个可供外源DNA插入的 克隆位点。也有一些具有两个克隆位点，但彼此 靠近。 * 替换型载体：具有成对的克隆位点，在这两个 位点之间的λDNA区段可以被外源插入的DNA片 段所取代。
5. 重组噬菌体的分离
外源DNA片段 + 噬菌体DNA分子 ↓ 重组的噬菌体DNA分子感染寄主细胞 ↓ 用32P标记的探针做噬菌斑放射自显影杂交 ↓ 获得阳性克隆 ↓ 分离大量的重组体噬菌体DNA， 实现克隆基因的扩增
(247页)
(247页)
5. 重组噬菌体的分离
接种针粘取噬菌体颗粒
↓ 新鲜的细菌培养基中 ↓ 在细胞内大量增殖 ↓ 氯化铯密度梯度离心 （噬菌体介于纯DNA与纯蛋白质之间） ↓ 纯化重组体噬菌体DNA


(250页)
(251页)
（2）λ噬菌体DNA的复制 在λ噬菌体感染的早期，环形的λDNA分子按θ 形式从双向进行复制。


到了晚期，控制滚环复制机理的开关被启动了， 合成出由一系列线性排列的λ基因组DNA组成的 长多连体分子。 多连体分子经过核酸酶的切割作用，从cos位点 将它分离成单体分子之后，才能够包装。
(英含遗工词)


(241页)
2. 噬菌体的感染性



将少量的噬菌体颗粒加入到高浓度的细菌培养物中，并 在新形成的子代噬菌体导致寄主细胞发生第一次裂解之 前，将此培养物涂布在琼脂平板上，20-30分钟之内， 头一批感染的细菌细胞便会发生裂解，释放出子代噬菌 体颗粒。 由于在琼脂平板上长有许多细菌，所以释放出来的噬菌 体，便可迅速地吸附到邻近的细菌细胞上，重复发生感 染周期。 此种细菌的裂解反应是以最初被感染的细胞所在的位置 为中心，慢慢地向四周扩展，最后在琼脂平板上形成大 量的噬菌斑。

噬菌体或病毒DNA
噬菌体或病毒是一类非细胞微生物，能高效率、高 特异性地侵染宿主细胞，然后或自主复制繁殖，或整合
入宿主基因组中潜伏起来，而且在一定的条件下上述两
种状态还会相互转化。噬菌体或病毒的上述特性使得它
们的DNA能被开发成为基因工程的有用载体，因为：
高效率的感染性能使外源基因高效导入受体细胞；
2. 噬菌体的感染性
噬菌体对寄主细胞的感染作用： 烈性噬菌体的生命周期： 噬菌体同敏感细胞接触，尾部粘到细胞壁上 ↓ DNA注入到被感染的细菌细胞 ↓ 噬菌体DNA复制 ↓ 合成出新的头部及尾部蛋白质 ↓ 组装成子代噬菌体颗粒 ↓ 寄主细胞壁被破坏并发生溶菌 ↓ 释放出子代噬菌体颗粒
(241页)
(243页)
4. 噬菌体的溶源生命周期
Ⅱ、溶源周期的主要特征（以λ噬菌体为原型）： （1）噬菌体的DNA分子注入细菌细胞。 （2）经过短暂的转录。 （3）噬菌体的DNA分子插入到细菌染色体基因组 DNA上，变成原噬菌体。 （4）细菌继续生长、增殖，噬菌体的基因作为细 菌染色体的一部分进行复制。
(244页)
自主复制繁殖性能使外源基因在受体细胞中高效扩增。
第一节 噬菌体的一般生物学特性
噬菌体依赖寄主细胞进行生长与增殖。 1. 噬菌体的结构及其核酸类型： * 一般分为三种类型： 无尾部结构的二十面体型。 具尾部结构的二十面体型。 线状体型。 * 大多数噬菌体都属于第二种类型。

(240页)
(241页)

基因工程又称重组DNA技术 其实施至少要有四个必要的条件 1. 工具酶 2. 基因 3. 载体 4. 受体细胞

（《基因工程..》静国忠，85页）
(240页)
噬菌体定义： 是一类细菌病毒的总称。 噬菌体与质粒的区别 * 质粒：仅是一种含有复制起点的裸露的DNA分 子。 * 噬菌体：DNA分子除了复制起点之外，还有编 码外壳蛋白质的基因。
(244页)
4. 噬菌体的溶源生命周期


另一种类型的溶源周期是以噬菌体T1为原 型。比较少见。 基本特征是：不存在噬菌体DNA分子的整 合作用体系，而是变成了一种进行独立复 制的环形的质粒DNA分子。
4. 噬菌体的溶源生命周期
(245页)
Ⅲ、超感染免疫性： 溶源性细菌有两个重要特点： （1）超感染免疫性：溶源性细菌不能够被头一次 感染并使之溶源化的同种噬菌体再感染。溶源性 这种抗御同种噬菌体再感染的特性，叫做超感染 免疫性。 （2）溶源性细菌的诱发：经过许多世代之后，溶 源性的细菌便能够开始进入溶菌周期。
Ⅰ、若干基本概念

234页

噬菌体：细菌病毒。 烈性噬菌体：感染寄主细胞后能进行复制、增殖，最后 引起细胞裂解的噬菌体。只有溶菌生长周期的噬菌体。 温和性噬菌体（溶原性噬菌体）：感染细菌后能使细菌 产生溶原性的噬菌体。既能进入溶菌生命周期又能进入 溶原生命周期的噬菌体。 溶原性：温和噬菌体感染细胞形成原噬菌体的过程。 原噬菌体：在溶原性细菌内存在的整合的或非整合的噬 菌体DNA。 溶原性细菌：细胞中含有以原噬菌体状态存在着的温和 噬菌体的细菌。 噬菌斑：在含细菌的固体培养基上，噬菌体使细菌细胞 裂解而形成的空斑。
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插入型载体：只能承受较小分子量(一般在 10kb以内)的外源DNA片段的插入，广泛用 于cDNA及小片段DNA的克隆。
替换型载体：可承受较大分子量的外源 DNA片段的插入，适用于克隆高等真核生 物的染色体。

（2）λ噬菌体载体的主要类型 Ⅰ、插入型载体： 插入失活效应：外源的DNA 克隆到插入型的λ噬 菌体载体分子上，会使噬菌体的某种生物功能丧 失效力。 免疫功能失活的插入型载体：在基因组的免疫区 中插入外源DNA片段，载体所具有的合成活性 阻遏物的功能遭受破坏，而不能进入溶源周期。 只能形成清晰的噬菌斑。 * 有外源DNA插入：清晰的噬菌斑。 * 没有外源DNA插入：亲本噬菌体可以进入溶源 状态，形成浑浊的噬菌斑。 β-半乳糖苷酶失活的插入型载体：（下页）
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β-半乳糖苷酶失活的插入型载体：

(256Байду номын сангаас)




这类载体的基因组中含有一个大肠杆菌的lac5区段，其 中有编码β-半乳糖苷酶的基因lacZ。 这种载体感染的大肠杆菌lac-指示菌，涂布在加有IPTG 和Xgal的培养基平板上，会形成蓝色的噬菌斑。 如果外源DNA插入到lac5区段上，阻断了β-半乳糖苷酶 基因lacZ的编码序列，那么由这种λ重组体感染的lac-指 示菌，由于不能合成β-半乳糖苷酶，只能形成无色的噬 菌斑。 如使用大肠杆菌Lac+指示菌，无论有无外源DNA插入， 都形成蓝色噬菌斑。 可以应用Xgal-IPTG显色技术检测转化子。


DNA重组技术一般需要l噬菌体进入溶菌状态。(张)
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λ噬菌体：

作为基因克隆载体的一个重要特性： 由外源基因取代非必要基因所形成的重组 噬菌体DNA，可以随着寄主大肠杆菌细胞 一道复制和增殖，而且在其溶源周期中， 它们的DNA是整合在大肠杆菌的染色体 DNA上，成为后者的一个组成部分。
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3. 噬菌体的溶菌生命周期
噬菌体的生命周期分为： 溶菌周期。 溶源周期。 两种类型的噬菌体： 烈性噬菌体：只有溶菌周期。 温和噬菌体：具有溶源周期的噬菌体。
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3. 噬菌体的溶菌生命周期 基本过程为：
（1）吸附：噬菌体颗粒吸附到细胞表面的特殊接受器上。 （2）注入：噬菌体DNA穿过细胞壁注入寄主细胞。 （3）转变：被感染的细菌成为制造噬菌体颗粒的场所。 （4）合成：功能发生了转变的寄主细胞合成噬菌体的核 酸和蛋白质。 （5）组装：包装了DNA的头部和尾部组装成噬菌体颗粒。 （6）释放：新合成的子代噬菌体颗粒从寄主细胞内释放 出来。
Xgal-IPTG显色反应（285页）


具有功能活性的β-半乳糖苷酶是四聚体。 Xgal（5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactoside) ：无色化合物。 β-半乳糖苷酶能将无色的Xgal切割成半乳糖和深蓝色的 底物5-溴-4-氯靛蓝。因此，Xgal可作为检测β-半乳糖苷 酶的一种指示剂。 IPTG：一种含硫的乳糖类似物。在不存在底物乳糖的 条件下，它可以诱导细胞合成β-半乳糖苷酶。 称IPTG为β-半乳糖苷酶的安慰诱导物。 乳糖诱导物IPTG（372页）