阳性转化子的鉴定

重组子的鉴定1. 实验原理原理参考本书第二部分第四章。

本实验对上一实验通过抗性筛选得到的白色菌落，用LB扩增后，先用菌落PCR法初步确定菌体中是否含有重组质粒，检测结果呈阳性的转化子再利用电泳法和PCR法鉴定重组质粒。

电泳法鉴定即从转化子中利用碱裂解法提取质粒，通过琼脂糖凝胶电泳法测定它们的大小，并用BamH I和SacI双酶切后电泳进一步验证质粒的重组情况。

PCR鉴定是用碱裂解法提取的重组质粒为模板，利用原来设计的引物，进行PCR扩增，检测构建质粒是否是所期望的重组质粒。

2. 实验用品（1）材料实验（六）所得的白色菌落。

（2）试剂1)LB液体培养基：蛋白胨（tryptone）10g，酵母提取物（yeast extract）5g，NaCL10g，溶于800ml去离子水，用5MNaOH调pH至7.2-7.4，加水至总体积1L，灭菌；2)天根生化科技有限公司的质粒提取试剂盒DP103；3)10×TBE电泳缓冲液：称取Tris54g，硼酸27.5g，并加入0.5mol/LEDTA(pH8.0) 20mL，定容至1000mL；4)6×上样缓冲液：0.25%溴酚蓝，40%（w/v）蔗糖水溶液；5)EB溶液母液：将EB配制成10mg/mL，用铝箔或黑纸包裹；6)琼脂糖；7)BamHI及酶切通用缓冲液；8)SacI及酶切通用缓冲液；9)TaKaRa公司PCR反应试剂盒；10)上游引物、下游引物（设计后由公司合成）；11)石蜡油。

(3) 仪器摇床、超净工作台、高压灭菌锅、pH计、高速离心机、移液枪、水平电泳仪、电泳仪电源、紫外透射仪、电炉、涡旋仪、恒温水浴锅、PCR仪。

3. 实验步骤(1) 菌体培养挑选实验（六）所得形态饱满、生长良好的白斑3－5个，分别接种于5mL卡那霉素Kana（50µg/mL）的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜。

(2) 菌落PCR取菌液1mL，5000rpm离心3分钟后去上清，加500µL无菌水混匀后，100℃加热5min 破菌后的菌液作为模板（含DNA），进行PCR鉴定，以期找到能扩增出MTLD基因的菌株。

转化子筛选方法所谓转化子就是导入外源DNA后获得了新的遗传标志的细菌细胞或其他受体细胞。

进入细胞的DNA分子通过复制、表达，实现遗传信息的转移,使受体细胞表现新的遗传性状。

将经转化后的细胞在选择性培养基中培养,即可筛选出转化体（transformant)，即带有异源DNA分子的受体细胞。

一.a互补所谓基因内互补作用，在LacZ体系中，是指二个彼此互补的突变基因(突变体1缺失LacZ近操作基因区段LacI；突变体2带有完整的近操纵基因而无β-半乳糖苷酶活性），它们编码产生的无活性的多肽产物，但由于二个突变体之间通过α肽互补作用可呈现有功能的β—半乳糖苷酶活性, 进而可分解底物X—gal(5-溴-4-氯—3-吲哚-β—D—半乳糖苷）而产生半乳糖和深蓝色的底物5-溴—4—氯-青定蓝, 使菌落呈现出蓝色反应。

然而，当外源基因DNA片段插入载体中LacZ α肽区段的多克隆位点后，就会阻断α序列的读码结构，使其编码的α肽失去活性，使重组子所在的细菌不能完成α-互补，因此带有外源基因重组子的细菌形成白色菌落。

根据这种β-半乳糖苷酶的显色反应，可以检测和筛选出携有外源基因重组子克隆。

此法又称蓝白筛选法。

二.杂交筛选该法是从基因组文库中筛选目的基因的首选方法。

将噬菌体感染形成的噬菌斑影印在硝酸纤维膜上变性带有目的基因的放射性DNA或cDNA作探针进行杂交放射性自显影杂交信号（黑点）对应的噬菌斑即为阳性克隆。

菌落印迹原位杂交的优点是：适于高密度菌落的筛选,对于噬菌斑平板，它可以连续影印几张同样的硝酸纤维滤膜,获得数张同样的DNA印迹。

因此，能够进行重复筛选，效率高,可靠性强,而且可以连续使用两种或数种探针筛选同一套重组体DNA，是一种最常规的检测手段。

2。

斑点杂交1)重组体DNA或RNA抽提出来。

2）抽提纯化，蛋白质、杂DNA等减少，所以能得到更为确切的结果，既可用于定性,对拷贝数进行相对定量。

3。

Southern blot杂交法原位杂交与斑点杂交都只能鉴定整个重组子中是否会有与探针互补的同源片段, 而Southern blot杂交能将同源片断定位于基因.三.插入失活根据载体分子所提供的表型特征,选择重组体DNA 分子的遗传选择法,可适用于大量群体的筛选,因此是一种比较简单而又十分有效的方法。

罗伊乳酸杆菌高效电转化方法的建立孙琳;胡雄兵;王磊;黄亚娟;杨明明;陈玉林【摘要】【Objective】 This study was to develop a high transformation efficiency method of wild-type Lactobacillus reuteri in order to meet the genetic manipulation of L.reuteri.【Method】 The pretreatment of L.reuteri cells was performed with lithium acetate（LiAc） and dithiothreitol（DTT）at different time（0,10,20,30 min） of pretreatment and different cell concentrations（0.5×109,1.0×109,2.5×109,5.0×109,10.0×109 mL-1） of electrotransformation.The positive transformats with PCR and enzyme digestion were assayed.【Result】 The transformation efficiency improved as time and cell concentration increased.The optimizing time was 20 min and cell concentration was 10.0×109 mL-1.At this condition the transformation efficiency reached（32.60±7.12）×107 transformants/μg DNA,which was 104 times more than untreated cells.【Conclusion】 We established a new and high efficient transformation method and its transformation efficiency is（32.60±7.12）×107 transformants/μg DNA at the condition of 10.0×109 mL-1 cell concentration and 20 min pretreatment.%【目的】建立野生型罗伊乳酸杆菌的高效电转化方法,为乳酸杆菌工程菌的研究提供参考。

第1篇一、实验目的本实验旨在探究RNA干扰技术在抑制苹果多酚氧化酶（PPO）表达，从而减少苹果氧化褐变方面的应用效果。

通过对比实验组与对照组的褐变程度，评估该技术的可行性和有效性。

二、实验材料与仪器1. 实验材料：- 品种：‘北极苹果’（PPO表达量较高）- 试剂：RNA干扰试剂盒、TRIZOL试剂、RT-PCR试剂盒、DNA marker、引物等- 仪器：离心机、PCR仪、凝胶成像系统、电泳仪、超净工作台等2. 实验分组：- 实验组：通过RNA干扰技术抑制PPO表达- 对照组：未进行RNA干扰处理三、实验方法1. RNA提取：分别从实验组和对照组苹果中提取总RNA，并进行浓度和纯度测定。

2. cDNA合成：将提取的总RNA反转录为cDNA。

3. 引物设计：针对PPO基因设计特异性引物。

4. RT-PCR：以cDNA为模板，进行RT-PCR扩增PPO基因。

5. 实验组处理：按照RNA干扰试剂盒说明书进行操作，构建PPO基因的siRNA表达载体，转化苹果细胞，筛选阳性转化子。

6. 阳性转化子鉴定：通过PCR和测序鉴定阳性转化子。

7. 阳性转化子表达检测：采用RT-PCR方法检测PPO基因在阳性转化子中的表达水平。

8. 褐变程度评估：将实验组和对照组的苹果分别切成小块，置于相同条件下进行氧化处理，观察并记录褐变程度。

四、实验结果与分析1. RT-PCR结果：实验组PPO基因表达量显著低于对照组，表明RNA干扰技术能够有效抑制PPO表达。

2. 阳性转化子鉴定：成功筛选出阳性转化子，并经过PCR和测序验证。

3. 阳性转化子表达检测：PPO基因在阳性转化子中的表达量显著低于对照组，进一步证实RNA干扰技术的有效性。

4. 褐变程度评估：实验组苹果在氧化处理后的褐变程度明显低于对照组，表明RNA干扰技术能够有效抑制苹果氧化褐变。

五、结论本研究通过RNA干扰技术抑制苹果PPO表达，成功降低了苹果的氧化褐变程度。

氨氧化菌定量实验方法与材料1、DNA提取采用上海博彩生物试剂公司K717环境基因组DNA提取试剂盒提取样品DNA。

提取后的DNA经美国quawell Q3000超微量紫外分光光度计测量260nm、280nm处的吸光值、260/280比值和样品DNA浓度，比值范围在1.7-1.8之间说明提取DNA效果较好，能较好地用于定量PCR测量。

2、常规PCR扩增利用氨氧化菌特异性引物amoA-1F、amo-2R进行PCR扩增，引物序列和反应条件见表1。

反应体系25μl，其中1μl DNA模板加24μl反应液，反应液包括12.5μl Taq DNA聚合酶（TAKARA公司，大连），9.5μl PCR-buffer(Applied Biosystems应用生物系统公司，美国)、正反向引物各1μl。

引物均由上海生工生物工程技术有限公司合成。

PCR扩增产物经1.5%琼脂糖电泳检测后，结果如图1所示。

电泳结果显示目的基因条带不够清晰，有明显的二聚体产生。

而且含有目的基因的片段长度约465bp，试用该引物进行荧光定量PCR，扩增效果不理想，溶解曲线出现不规则的杂峰。

上述结果均说明该引物扩增产物长度较长，不适用于荧光定量PCR。

经分析试验后，采用另一组氨氧化菌特异性引物。

正向引物包括CTO189f A/B和CTO189fC，按2:1混合后使用；反向引物为RT1r，引物序列与PCR反应条件见表1。

使用该引物扩增后的PCR产物经电泳检测后均可得到清晰的目标条带，扩增的片段长度为116bp，电泳结果如图2所示。

表1 PCR扩增引物及反应条件引物名称序列反应条件amoA-1F GGGGTTTCTACTGGTGGT 95℃×3min; 95℃×15s, 52℃×30s,72℃×1min,30cycles; 72℃×5min amoA-2R CCCCTCKGSAAAGCCTTCTTCCTO 189f A/B b CTO 189f C b RT1r GGAGRAAAGCAGGGGATCG GGAGGAAAGTAGGGGATCG CGTCCTCTCAGACCARCTACTG94℃×3min; 94℃×15s,58℃×30s, 72℃×45s,30cycles; 72℃×4min465bp图1 amoA、amoB 引物PCR电泳结果116bp图2 CTO189f A/B、CTO189fC引物PCR电泳结果3、重组质粒的构建将含有目的基因的片段切下，用BIORAD公司DNA凝胶回收试剂盒回收纯化目的DNA片段，并测定其浓度。

・研究报告・生物技术通报BIOTECHNOLOGY BULLETIN2013年第12期酿酒酵母是最简单的真核生物，同时又具有类似原核生物的生长特性，便于培养和进行遗传操作的优点，是一种模式真核生物和模式实验系统，被称为真核生物的“大肠杆菌”［1］。

它与人类的关系极为密切，是人类实践中应用较早的一类微生物［2］，同时它也被广泛用作基因克隆和表达的宿主菌。

为了鉴定克隆到酵母细胞内的外源基因，可以通过提取酵母基因组后通过PCR 扩增目的基因、与特异性底物形成水解圈、荧光基团、挑取单克隆进收稿日期： 2013-06-30基金项目：广东省科技计划（2012B020311005）作者简介：武可婧，女，硕士研究生，研究方向：微生物功能蛋白；E -mail ：wu.kejing@ 通讯作者：林蒋海，博士，副研究员，研究方向：基因工程，代谢工程；E -mail ：jianghai.lin@一种高效快速鉴定酵母转化子的酵母菌落PCR 方法武可婧 吕一鸣 李晶博 肖文娟 龚映雪 刘泽寰 林蒋海（暨南大学生命科学技术学院，广州 510632）摘 要： 酵母是一种重要的基因工程宿主菌，但是由于其细胞壁结构复杂牢固，普通的菌落PCR 方法的成功率较低。

为解决此问题，提供一种快速、简单、高效的酵母菌落PCR 方法。

该方法先利用溶壁酶溶解酵母细胞壁，然后利用热涨裂解细胞并进行PCR 反应。

此方法将酵母细胞裂解和PCR 在同一个PCR 管中完成。

试验结果显示此方法能成功扩增目的基因且成功率高。

将此方法应用于外源性内切葡聚糖酶（endoglucanase，EG）的酿酒酵母转化子筛选，经与基因组PCR 比较，菌落PCR 与基因组PCR 结果一致。

结果证明此方法具有良好的稳定性，适用于酿酒酵母转化子的快速筛选。

关键词： 酿酒酵母 菌落PCR 转化子 阳性克隆A Rapid and Efficient Yeast Colony PCR Method to Identify PositiveTransformantsWu Kejing L ü Yiming Li Jingbo Xiao Wenjuan Gong Yingxue Liu Zehuan Lin Jianghai（School of Life Science and Technology ，Jinan University ，Guangzhou 510632）Abstract: Yeast is an important host microorganism in genetic engineering and molecular cloning. However, because of the complex structure of their cell wall, ordinary colony PCR method has a low success rate. To address this problem, a fast, simple and efficient yeast colony PCR method was provided. In the novel method, a commercial available cell wall degradation enzyme, lyticase, was used to disrupt yeast cell wall and the resulted protoblast was then bursted by heating. Into the lysis mixture, other PCR components were added and PCR reactions were performed. In the current constructed method, the yeast cell lysis and PCR reaction were performed in one single PCR tube, which is convenient and easy to implement. The success rate of the novel method was relatively high compared to traditional ones. Using this method, the Saccharomyces cerevisiae transformants of exogenous endoglucanase（EG）were screened. Compared to PCR using genomic DNA, the results of colony PCR were consistent with those from genomic PCR. The results indicated that the novel method was of good stability, repeatability and suitable for the rapid screening of the S. cerevisiae transformants.Key words: Saccharomyces cerevisiae Colony PCR Transformant Positive clone行菌落PCR 等一系列方法来鉴定酵母转化后的阳性克隆。

两种强启动子在枯草芽孢杆菌中调控表达研究周艳敬;常晓娇;吴子丹;伍松陵;孙长坡【摘要】通过玉米赤霉烯酮（ZEN）降解酶基因ZLHY6的表达水平及降解酶的活性评价，比较了两种组成型强启动子P43与PlapS调控异源基因表达的效果。

结果表明，在枯草芽孢杆菌（Bacillus sub-tilis）Bs 168中，PlapS调控的降解酶基因得到了高效表达，在发酵12 h时降解酶活性达到最高值，酶活为219．02 U／mL。

由启动子PlapS介导的ZEN降解酶基因表达载体pWBZ7可以在Bs 168中稳定遗传，为降解酶的高效分泌表达奠定了基础。

%The effect of two kinds of constitutive strong promoters P43 and PlapS on regulation of heterolo-gous gene was compared on the expression level of ZEN degrading enzyme gene ZLHY6 and the enzyme activity evaluation.The degrading enzyme gene regulated by PlapS received efficient expression in bacillus subtilis 168,and the degrading enzyme activity reached the highest level of 219.02 U/mL after fermentation for 12 h.Moreover,the genetic stability of ZEN degrading enzyme gene expression vector pWBZ7 regulated by PlapS in Bs 168 lays a foundation for efficient expression and secretion of degrading enzyme.【期刊名称】《粮油食品科技》【年(卷),期】2015(000)002【总页数】5页(P68-72)【关键词】玉米赤霉烯酮;枯草芽孢杆菌;启动子;高效表达系统【作者】周艳敬;常晓娇;吴子丹;伍松陵;孙长坡【作者单位】河南工业大学生物工程学院，河南郑州 450000; 国家粮食局科学研究院，北京 100037;国家粮食局科学研究院，北京 100037; 河南工业大学粮油食品学院，河南郑州 450000;国家粮食局科学研究院，北京 100037;国家粮食局科学研究院，北京 100037;国家粮食局科学研究院，北京 100037【正文语种】中文【中图分类】Q786玉米赤霉烯酮(Zearaleonoe，ZEN)是由禾谷镰刀菌产生的一种非甾体霉菌毒素，广泛存在于受污染的小麦、玉米、高粱等谷物及其制品中。

高级分子生物学1.试述利用基因工程的技术调控基因表达的主要方法原位杂交技术原位杂交(In Situ Hybridization,ISH)是用标记的核酸探针，经放射自显影或非放射检测体系，在组织、细胞、间期核及染色体上对核酸进行定位和相对定量研究的一种手段。

通常可以分为两大类：1、RNA原位杂交：用放射性或非放射性(如地高辛、生物素等)标记的特异性探针与被固定的组织切片反应，若细胞中存在与探针互补的mRNA分子，两者杂交产生双链RNA，就可以通过检测放射性标记或经酶促免疫显色，对该基因的表达产物在细胞水平上作出定性定量分析；2、荧光原位杂交(Fluorescence In Situ Hybridization,FISH)：首先对于寡核苷酸探针做特殊修饰和标记，然后用原位杂交法与靶染色体或DNA上特定的序列结合，再通过与荧光素分子相偶联的单克隆抗体来确定该DNA序列在染色体的位置。

定点突变技术定点突变是重组DNA进化的基础，该方法通过改变基因特定位点核苷酸序列来改变所编码的氨基酸序列，常用于研究某个氨基酸残基对蛋白质的结构、催化活性以及结合配体能力的影响，也可用于改造DNA调控元件特征序列、修饰表达载体、引入新的酶切位点等。

RNAi技术RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术利用双链小RNA高效、特异性降解细胞内同源mRNA，从而阻断体内靶基因表达，使细胞出现靶基因缺失的表型。

其过程一般为：1、在Dicer的参与下，细胞中的双链RNA首先被降解形成21-25个核苷酸的小片段双链RNA(siRNA)；2、siRNA中的反义链指导合成一种被称为RNA诱导的沉默复合体(RISC)的核蛋白体；3、RISC再介导切割目的mRNA分子中与siRNA反义链互补的区域，从而实现干扰基因表达的功能。

2.论述原核生物和真核生物基因表达调控的异同答：1、真核生物基因组大,染色体数量多,且结构复杂,存在基因家族和断裂基因；原核生物基因组小,染色体数量少,结构简单,有重叠基因和操纵子结构，基因表达调控可以在复制、扩增、基因激活、转录、转录后、翻译和翻译后等多级水平上进行,但转录水平调控是主要的。