重组体克隆的筛选和鉴定

重组子的筛选和鉴定
重组子可通过酶切进行鉴定，也可以利用扩增引物通过PCR 进行鉴定，阳性重组子能切出所需要的片段或得到相应片段的PCR 产物。

1. 用牙签挑取平板上的菌落接种于2ml 含适当抗生素的LB 培养基中，37℃摇床培养过夜。

2. 次日取菌液0.2-0.5ml，12,000rpm×3min 离心，弃上清，加入20μl ddH2O 和20μl 酚/ 氯仿，震荡混匀，12,000rpm×5min 离心。

3. 取上清进行琼脂糖电泳，加入载体质粒DNA 作为阴性对照，根据质粒大小初步筛选重组子，重组子的泳动速度应该慢于载体质粒。

4. 用碱法小量制备可能是重组子的质粒DNA。

5. 选取适当的酶，对重组子进行酶切分析，酶切体积均为10μl 体系。

酶切样品进行琼脂糖电泳鉴定是否有所需片段。

6. 酶切分析正确的重组子分成两份，一份进行测序反应，另外一份保种。

7. 若用PCR 法鉴定，则在第 2 步时每个样本取0.5-1.0μl 菌液为模板进行PCR 反应，每管反应体系最低可少至10μl ，PCR 产物电泳，能得到所需条带的样本进一步提取质粒酶切鉴定或送样品测序。

实验八重组克隆筛选（酶切鉴定）【实验目的】1.掌握质粒提取的基本方法的原理；2.学习和掌握限制性内切酶的使用方法。

【实验原理】重组克隆的筛选和鉴定是基因工程中的重要环节之一。

不同的克隆载体和相应的宿主系统，其重组克隆的筛选和鉴定方法不尽相同。

从理论上说，重组克隆的筛选是排除自身环化的载体、未酶解完全的载体以及非目的DNA片断插入的载体所形成的克隆。

常用的筛选方法有两类。

一类是针对遗传表型改变筛选法，以－半乳糖苷酶系统筛选法为代表。

另一类是分析重组子结构特征的筛选法，包括快速裂解菌落鉴定质粒大小、限制酶图谱鉴定、Southern 印迹杂交、PCR、菌落（或噬菌斑）原位杂交等方法。

1．－半乳糖苷酶系统筛选法（蓝白斑筛选法）使用本方法的载体包括M13噬菌体、pUC质粒系列、pGEM质粒系列等。

这些载体的共同特征是载体上携带一段细菌的基因lacZ。

lacZ编码－半乳糖苷酶的一段146个氨基酸的肽，载体转化的宿主细胞为lacZ△M15基因型。

重组子由于外源片断的插入使肽基因失活不能形成互补作用，也就是说，宿主细胞表现为－半乳糖苷酶失活。

因此，在X-gal平板上，重组克隆为无色噬菌斑或菌落，非重组克隆为蓝色噬菌斑或菌落。

这种筛选方法操作简单，但当插入片断较短（小于500bp），且插入片断没有影响lacZ基因的读框时，有假阴性结果的出现。

2．快速裂解菌落鉴定质粒大小从平板中挑取菌落，过夜培养后裂解，直接进行凝胶电泳，与载体DNA比较，根据迁移率的减小初步判断是否有插入片断存在。

本方法适用于插入片断较大的重组子的初步筛选。

3．限制酶图谱鉴定对于初步筛选具有重组子的菌落，提纯重组质粒或重组噬菌体DNA，用相应的限制性内切酶（一种或两种）切割重组子释放出的插入片断，对于可能存在双向插入的重组子还可用适当的限制性内切酶消化鉴定插入方向，然后用凝胶电泳检测插入片断和载体的大小。

4．Southern 印迹杂交为确定DNA插入片断的正确性，在限制性内切酶消化重组子、凝胶电泳分离后，通过Southern 印迹转移将DNA移至硝酸纤维膜上，再用放射性同位素或非放射性标记的相应外源DNA片断作为探针，进行分子杂交，鉴定重组子中的插入片断是否是所需的靶基因片断。

重组子的筛选方法一、引言重组子筛选是基因工程中的一项关键技术，用于识别和分离含有目的基因的克隆。

随着生物技术的不断发展，重组子筛选方法也日益多样化，为研究者提供了更多选择。

本文将对几种常见的重组子筛选方法进行详细介绍，并比较其优缺点。

二、常见重组子筛选方法1. 蓝白筛选法：蓝白筛选法是一种基于λ噬菌体载体和lacZ基因的筛选方法。

其基本原理是利用lacZ基因编码的β-半乳糖苷酶可以将无色底物X-gal转化为蓝色产物。

当载体上含有目的基因时，lacZ基因被破坏，无法产生β-半乳糖苷酶，菌落呈白色。

这种方法操作简便，适用于大量筛选。

2. 抗性筛选法：抗性筛选法是利用标记基因赋予宿主菌抗药性或营养缺陷型特性，从而筛选重组子的方法。

例如，利用卡那霉素抗性基因（neo）对细菌进行筛选。

当载体上含有目的基因时，neo基因被破坏，重组子对卡那霉素产生抗性。

这种方法成本低廉，适用于实验室条件。

3. 荧光标记筛选法：荧光标记筛选法是利用荧光标记探针与目的基因杂交，通过荧光显微镜观察荧光信号来筛选重组子的方法。

该方法灵敏度高，可实现自动化操作。

然而，荧光标记探针制备成本较高，且对实验操作要求较高。

4. 测序法：测序法是通过对目的基因进行测序，比对已知序列来确定重组子的方法。

该方法准确度高，适用于所有基因型重组子的筛选。

然而，测序法成本较高，操作复杂，不适合大量筛选。

三、比较与讨论蓝白筛选法、抗性筛选法和荧光标记筛选法各有优缺点。

蓝白筛选法操作简便、成本低廉，适用于大量筛选；但灵敏度较低，可能会漏掉一些弱阳性克隆。

抗性筛选法成本低、适用范围广；但标记基因可能会影响目的基因的表达，导致结果不准确。

荧光标记筛选法灵敏度高、可自动化操作；但成本较高，对实验操作要求严格。

测序法则准确度高，可适用于所有基因型重组子的筛选；但成本较高、操作复杂，不适合大量筛选。

因此，在选择重组子筛选方法时，应根据具体实验需求和条件进行综合考虑。

基因克隆实验流程基因克隆技术，又称重组 DNA 技术，是将目的基因与具有自主复制能力的载体DNA 进行体外重组，获得新的重组DNA后导入受体细胞中表达相应蛋白，以研究蛋白结构与功能及其与其他分子的相互作用。

一、获取目的基因目的基因就是需要研究的特定基因或DNA片段。

获取目的基因的主要方法： 1、用限制性内切酶解染色体DNA，构建基因组文库，再从基因组文库中筛选目的基因。

该法的优点是获得的目的基因的组织结构与天然基因完全相同，在结构基因中也含有内含子序列，但是也正因为这一点构成了该法最大缺点，即含有内含子的基因在原核细胞中不能表达。

原因是原核细胞不能识别并剪切插入顺序(内含子)，因而也不能表达出正确的基因产物。

2、分离纯化细胞中的mRNA，以mRNA为模板，在反转录酶作用下生成cDNA第一链，再以cDNA第一链为模板在DNA聚合酶作用下生成双链cDNA,构建cDNA文库，从中筛选所需的目的基因。

此法仅用于筛选为蛋白质编码的结构基因。

因成熟的mRNA分子中已经切除了内含子序列，具有完整的阅读框架，可在原核细胞中正确表达。

3、人工体外合成基因：由于当前人工体外合成DNA的长度有限，此法仅用于制备小分子生物活性多肽基因和小分子量蛋白基因。

在基因较大情况下，常需先合成多个DNA片段，然后拼接成完整的基因，此法还要求目的基因的全部碱基顺序已被阐明。

4、PCR法扩增基因：PCR(聚合酶链式反应)技术的出现和发展，为目的基因的寻找提供了有力技术工具。

用PCR法可选择性扩增基因组中所要研究的个别基因或DNA片段，或用反向PCR技术，先将特定mRNA反转录为cDNA第一链，然后再进行扩增。

用PCR法筛选基因，需要对目的基因的DNA序列至少有部分了解。

二、选择适当的载体按上述方法制备的目的基因如果没有合适的载体协助，很难进入受体细胞，即使能进入，往往也不能进行复制和表达，因为这些外源性DNA一般不带有复制调控系统。

为了保证目的基因或外源DNA片段能在细胞内克隆，必须将它们与适当的载体连接。

克隆基因的筛选原理是什么克隆基因的筛选原理是指通过人工手段从大量基因样本中筛选出具有特定功能的基因，并将其放入宿主细胞中进行进一步研究和应用。

克隆基因的筛选原理主要包括基因文库构建、基因识别和筛选、基因克隆和鉴定几个关键步骤。

基因文库构建是克隆基因筛选的第一步。

基因文库是将一个生物体的全基因组按照一定的方法嵌入到携带载体中，使得携带载体中每一个片段都代表原生的一部分基因组。

构建基因文库的关键在于获取高质量的DNA样本和选择合适的携带载体。

DNA样本可通过提取原生生物体中的基因组DNA获得，或者从cDNA 文库中选择目标基因进行片段化、并连接载体。

选取合适的携带载体要考虑到质粒大小、复制能力、选择标记以及宿主菌的特点等因素。

构建好的基因文库可进一步用于基因识别和筛选。

基因识别和筛选是克隆基因筛选的关键环节。

通过基因识别和筛选可以找到含有特定功能基因的片段。

常用的基因识别和筛选方法包括杂交筛选、PCR筛选、亚克隆筛选等。

杂交筛选是目前常用的筛选方法之一，它是利用目标DNA序列与抗原DNA进行互相杂交，然后用标记技术检测杂交融合的特定单链DNA。

PCR筛选是利用特异引物进行PCR扩增，通过扩增产物的特异性确认目标基因。

亚克隆筛选是通过对目标基因片段进行酶切、分离纯化、与载体连接等操作，用于提取目标基因并确认其准确性和特异性。

基因克隆是克隆基因筛选的核心步骤。

基因克隆是将目标基因提取出来，并与携带载体连接，将得到的重组载体导入宿主细胞中进行繁殖。

常用的基因克隆技术包括限制性内切酶切割、连接酶连接、DNA凝胶电泳纯化等。

限制性内切酶切割是将目标基因和携带载体通过限制性内切酶在特定位点进行酶切，然后通过连接酶将两者进行连接。

DNA凝胶电泳纯化是通过凝胶电泳将目标基因和携带载体分离，然后提取纯化后的DNA进行进一步实验。

基因鉴定是克隆基因筛选的最后一步。

通过基因鉴定可以确认克隆的基因是否与目标基因一致，并确定其序列和功能。

鉴定重组子的方法
鉴定重组子的方法一般可分为以下几种：
1. PCR扩增法：通过聚合酶链式反应（PCR）在靶DNA序列的两端引入特定的引物，再通过PCR扩增得到重组子的DNA序列。

2. 限制性内切酶消化法：将待重组的DNA片段和载体DNA进行双酶切，然后通过连接酶将两者连接起来，最后通过转化到宿主细胞内进行复制和表达。

3. 嵌合PCR法：利用两对引物分别扩增待重组的DNA片段和载体DNA片段，两者的两端引物设计成互补序列，通过PCR扩增后，两个片段可通过重叠互补序列自行连接。

4. 策略引导融合法：通过引物设计，使待重组的DNA片段和载体DNA具有互补的序列，然后通过热变性和退火的方式使两者相互结合。

5. 基因组DNA文库筛选法：通过构建基因组DNA文库，然后通过探针的杂交和筛选，得到具有重组子的克隆。

以上是常见的鉴定重组子的方法，具体的选择可以根据实验需要和条件进行决定。