重组克隆的筛选和鉴定

实验八重组克隆筛选（酶切鉴定）【实验目的】1.掌握质粒提取的基本方法的原理；2.学习和掌握限制性内切酶的使用方法。

【实验原理】重组克隆的筛选和鉴定是基因工程中的重要环节之一。

不同的克隆载体和相应的宿主系统，其重组克隆的筛选和鉴定方法不尽相同。

从理论上说，重组克隆的筛选是排除自身环化的载体、未酶解完全的载体以及非目的DNA片断插入的载体所形成的克隆。

常用的筛选方法有两类。

一类是针对遗传表型改变筛选法，以－半乳糖苷酶系统筛选法为代表。

另一类是分析重组子结构特征的筛选法，包括快速裂解菌落鉴定质粒大小、限制酶图谱鉴定、Southern 印迹杂交、PCR、菌落（或噬菌斑）原位杂交等方法。

1．－半乳糖苷酶系统筛选法（蓝白斑筛选法）使用本方法的载体包括M13噬菌体、pUC质粒系列、pGEM质粒系列等。

这些载体的共同特征是载体上携带一段细菌的基因lacZ。

lacZ编码－半乳糖苷酶的一段146个氨基酸的肽，载体转化的宿主细胞为lacZ△M15基因型。

重组子由于外源片断的插入使肽基因失活不能形成互补作用，也就是说，宿主细胞表现为－半乳糖苷酶失活。

因此，在X-gal平板上，重组克隆为无色噬菌斑或菌落，非重组克隆为蓝色噬菌斑或菌落。

这种筛选方法操作简单，但当插入片断较短（小于500bp），且插入片断没有影响lacZ基因的读框时，有假阴性结果的出现。

2．快速裂解菌落鉴定质粒大小从平板中挑取菌落，过夜培养后裂解，直接进行凝胶电泳，与载体DNA比较，根据迁移率的减小初步判断是否有插入片断存在。

本方法适用于插入片断较大的重组子的初步筛选。

3．限制酶图谱鉴定对于初步筛选具有重组子的菌落，提纯重组质粒或重组噬菌体DNA，用相应的限制性内切酶（一种或两种）切割重组子释放出的插入片断，对于可能存在双向插入的重组子还可用适当的限制性内切酶消化鉴定插入方向，然后用凝胶电泳检测插入片断和载体的大小。

4．Southern 印迹杂交为确定DNA插入片断的正确性，在限制性内切酶消化重组子、凝胶电泳分离后，通过Southern 印迹转移将DNA移至硝酸纤维膜上，再用放射性同位素或非放射性标记的相应外源DNA片断作为探针，进行分子杂交，鉴定重组子中的插入片断是否是所需的靶基因片断。

重组dna克隆子的筛选及鉴定注意事项嘿，宝子们！今天咱们来唠唠这个《重组DNA克隆子的筛选及鉴定注意事项》呀。

首先呢，咱得知道啥是重组DNA克隆子哇。

这可是生物技术里超重要的东西呢！在筛选的时候呀，有好多要注意的点呢。

一、筛选方面的注意事项1. 选择合适的筛选标记呀！哎呀呀，这可太关键了呢。

比如说抗生素抗性标记，常见的像氨苄青霉素抗性、卡那霉素抗性等等。

你得确保这个标记是准确有效的哇，不然怎么能筛选出咱们想要的克隆子呢？要是标记弄错了，那可就像大海捞针一样乱套了呀！在选择的时候，一定要根据你的载体和宿主细胞的特性来确定呢，可不能瞎选哦！2. 筛选条件要精确呢。

比如说使用抗生素筛选的时候，抗生素的浓度一定要控制好哇！浓度低了呢，那些没有成功重组的细胞可能也会生长，这就达不到筛选的目的啦；浓度高了呢，可能会把一些好不容易重组成功的细胞也给抑制住了呀，这多可惜呢！所以呀，要通过预实验来确定最佳的抗生素浓度呢，这个步骤可不能偷懒哦！3. 筛选的时间也很重要呢！哇，你可别以为把细胞放在筛选培养基里就不管了。

时间太短，可能那些非重组子还没有完全被抑制住；时间太长呢，可能会导致重组子因为营养缺乏或者其他原因生长受到影响呢。

所以要时刻关注细胞的生长状态，确定合适的筛选时间呀。

二、鉴定方面的注意事项1. 酶切鉴定要小心哦。

在进行酶切鉴定的时候呢，首先要选择合适的限制性内切酶呀。

这就像开锁要用对钥匙一样呢。

要是酶选错了，可能就切不出你想要的条带啦，那怎么能鉴定出正确的克隆子呢？而且呀，酶切反应的体系一定要准确无误呢。

各种成分的量，像酶的量、缓冲液的浓度、DNA的量等等，都要严格按照说明书来操作呢，不然很容易出现酶切不完全或者酶切失败的情况呢！2. PCR鉴定也有不少讲究呢。

引物的设计那可是重中之重呀！哇，引物要是设计得不好，可能就扩增不出咱们想要的片段呢。

要确保引物的特异性，不能跟其他非目标序列结合呢。

还有呀，PCR反应的条件也要不断优化呢。

转化子的筛选和重组子的鉴定在重组DNA分子的转化、转染或转导过程中，并非所有的受体细胞都能被导入重组DNA 分子，一般仅有少数重组DNA分子能进入受体细胞。

再者，在这些被转化的受体细胞中，除部分含有我们期待的DNA分子外，另外一些还可能是由于载体自身或一个载体与多个外源DNA片段形成的非期待重组DNA分子导入所致。

因此，需要采取必要的方法将重组子从大量的受体细胞中筛选出来。

一、基本定义：1、转化子：导入外源DNA分子后能稳定存在的受体细胞称为转化子。

2、重组子：含有重组DNA分子的转化子称为重组子。

3、阳性克隆子（期望重组子）：含有外源目的基因的重组子称为阳性克隆子或期望重组子。

4、筛选（选择）：经过各种方法将外源DNA分子导入受体细胞后，获得所需阳性克隆子的过程称为克隆子的筛选或选择。

二、将目的基因克隆到大肠杆菌细胞中的操作步骤：1．获得目的基因和质粒载体；2．形成重组质粒；3．制备感受态细胞，用重组质粒转化大肠杆菌细胞；4．培养大肠杆菌，让重组质粒及外源目的基因形成大量拷贝；5三、转化子的筛选1、根据载体标记基因筛选转化子。

（1）方法：将转化处理后的受体细胞接种在含适量选择药物的培养基上，在最适生长温度条件下培养一段时间，根据菌落生长情况挑选出转化子。

（2）举例：抗药性标记插入失活选择法、根据载体除草剂抗性基因、β-半乳糖苷酶显色反应选择法、根据生长调节剂非依赖型筛选转化子、根据核苷酸合成代谢相关酶基因的缺失互补筛选。

2、根据报告基因筛选转化子。

（1）报告基因的定义：一个编码可被检测的蛋白质或酶的基因，即表达产物易被鉴定的基因。

由于受体细胞内报告基因的表达，出现新的遗传性状，以此来识别被转化的细胞或未被转化的细胞。

（2）成为报告基因的条件：报告基因的表达产物应是便于检测、定量和灵敏毒高的基因。

如：gus葡醛糖酸酶基因、Lus荧光虫荧光素酶基因、Gfp绿色荧光蛋白基因。

3、根据形成噬菌斑筛选转化子。

目的基因序列克隆的筛选与鉴定目的序列与载体DNA正确连接的效率、重组导入细胞的效率都不是百分之百的，因而最后生长繁殖出来的细胞并不同都带有目的序列。

一般一个载体只携带某一段外源DNA，一个细胞只接受一个重组DNA分子。

最后培养出来的细胞群中只有一部分、甚至只有很小一部分是含有目的序列的重组体（recombinant）。

将目的重组体筛选出来就等于获得了目的序列的克隆，所以筛选(dcreening)是基因克隆的重要步骤。

在构建载体，选择宿主细胞、设计分子克隆方案时都必须仔细考虑筛选的问题。

以下就常用技术的基本原理加以介绍。

一、根据重组载体的标志作筛选最常见的载体携带的标志是抗药性标志，如抗氨芐青霉素（anpr）、抗四环素(terr)、抗卡那霉素(kanr)、G418等。

当培养基中含有抗生素时，只有携带相应抗药性基因载体的细胞才能生存繁殖，这就把凡未能接受载体DNA的细胞全部筛除掉了。

如果外源目的序列是插入在载体的抗药性基因中间使这抗药性基因失活，这个抗药性标志就会消失。

例如质粒pBR322含有anpr、和terr两个抗药基因，若将目的序列插入terr基因序列中，转化大肠杆菌，让细菌放在含氨芐青霉素或四环素培养基中，凡未接受质粒DNA的细胞都不能生长；凡在含氨芐青霉素和四环素中都能生长的细菌是含有质粒pBR322的，但其pBR322未插入目的序列，凡在氨芐青霉素中能生长、而在四环素中不能生长的细菌就很可能是含有目的序列的重组质粒。

载体含有lacZ’的蓝白筛选法，近年更被广泛应用。

例如将目的序列插入前面述及的质粒pUC19的多克隆位点，转化大肠杆菌，放入含氨芐青霉素、IPTG、X-gal的培养基中培养，凡能生长并呈白色的菌落，其细菌中就很可能含有插入目的序列的重组质粒，这样就很容易获得目的序列的克隆。

根据重组载体的标志来筛选，可以筛选去大量的非目的重组体，但还只是粗筛，例如细菌可能发生变异而引起抗药性的改变，却并不代表目的序列的插入，所以需要做进一步细致的筛选。

重组子的筛选方法一、引言重组子筛选是基因工程中的一项关键技术，用于识别和分离含有目的基因的克隆。

随着生物技术的不断发展，重组子筛选方法也日益多样化，为研究者提供了更多选择。

本文将对几种常见的重组子筛选方法进行详细介绍，并比较其优缺点。

二、常见重组子筛选方法1. 蓝白筛选法：蓝白筛选法是一种基于λ噬菌体载体和lacZ基因的筛选方法。

其基本原理是利用lacZ基因编码的β-半乳糖苷酶可以将无色底物X-gal转化为蓝色产物。

当载体上含有目的基因时，lacZ基因被破坏，无法产生β-半乳糖苷酶，菌落呈白色。

这种方法操作简便，适用于大量筛选。

2. 抗性筛选法：抗性筛选法是利用标记基因赋予宿主菌抗药性或营养缺陷型特性，从而筛选重组子的方法。

例如，利用卡那霉素抗性基因（neo）对细菌进行筛选。

当载体上含有目的基因时，neo基因被破坏，重组子对卡那霉素产生抗性。

这种方法成本低廉，适用于实验室条件。

3. 荧光标记筛选法：荧光标记筛选法是利用荧光标记探针与目的基因杂交，通过荧光显微镜观察荧光信号来筛选重组子的方法。

该方法灵敏度高，可实现自动化操作。

然而，荧光标记探针制备成本较高，且对实验操作要求较高。

4. 测序法：测序法是通过对目的基因进行测序，比对已知序列来确定重组子的方法。

该方法准确度高，适用于所有基因型重组子的筛选。

然而，测序法成本较高，操作复杂，不适合大量筛选。

三、比较与讨论蓝白筛选法、抗性筛选法和荧光标记筛选法各有优缺点。

蓝白筛选法操作简便、成本低廉，适用于大量筛选；但灵敏度较低，可能会漏掉一些弱阳性克隆。

抗性筛选法成本低、适用范围广；但标记基因可能会影响目的基因的表达，导致结果不准确。

荧光标记筛选法灵敏度高、可自动化操作；但成本较高，对实验操作要求严格。

测序法则准确度高，可适用于所有基因型重组子的筛选；但成本较高、操作复杂，不适合大量筛选。

因此，在选择重组子筛选方法时，应根据具体实验需求和条件进行综合考虑。

dna 克隆的基本过程DNA克隆的基本过程DNA克隆是指通过人工手段将一个DNA分子复制成许多完全相同的DNA分子的过程。

这一技术的应用非常广泛，可以用于基因工程、医学研究、生物学研究等领域。

下面将介绍DNA克隆的基本过程。

第一步：DNA提取DNA克隆的第一步是从细胞中提取DNA。

细胞可以来自任何生物体，包括人类、动物、植物等。

DNA提取可以通过多种方法进行，常用的方法是利用细胞裂解酶和蛋白酶将细胞膜和细胞核膜破坏，释放出DNA分子。

第二步：DNA片段的制备在DNA克隆中，需要将待克隆的DNA分子切割成较小的片段。

这可以通过限制性内切酶进行，限制性内切酶能够识别特定的DNA序列并切割DNA链。

切割后的DNA片段可以是几百到几千个碱基对长。

第三步：载体的选择在进行DNA克隆时，需要选择一个合适的载体来携带待克隆的DNA 片段。

常用的载体包括质粒和噬菌体。

质粒是一种环状的DNA分子，可以在细菌中自主复制。

噬菌体是一种病毒，可以感染细菌并将其DNA插入到细菌染色体中。

第四步：DNA连接将DNA片段和载体进行连接是DNA克隆的关键步骤。

这一步骤需要使用DNA连接酶，该酶能够将DNA片段的末端与载体的末端连接起来，形成一个完整的DNA分子。

连接后的DNA分子被称为重组DNA。

第五步：转化将重组DNA引入到宿主细胞中是进行DNA克隆的下一步。

转化可以通过多种方法进行，包括热冲击法、电穿孔法和化学法等。

这些方法都能够使宿主细胞吸收外源DNA，并将其整合到细胞染色体中。

第六步：筛选和鉴定为了确定哪些细胞成功地转化了重组DNA，需要进行筛选和鉴定。

常用的筛选方法是将转化后的细胞培养在含有特定抗生素的培养基上，只有带有重组DNA的细胞才能生长下来。

鉴定可以通过PCR扩增和DNA测序等方法进行。

第七步：扩增成功鉴定后，可以通过培养和扩增来获得大量的重组DNA。

重组DNA 可以在细胞中自主复制，从而得到足够多的DNA分子。

基因克隆实验流程基因克隆技术，又称重组 DNA 技术，是将目的基因与具有自主复制能力的载体DNA 进行体外重组，获得新的重组DNA后导入受体细胞中表达相应蛋白，以研究蛋白结构与功能及其与其他分子的相互作用。

一、获取目的基因目的基因就是需要研究的特定基因或DNA片段。

获取目的基因的主要方法： 1、用限制性内切酶解染色体DNA，构建基因组文库，再从基因组文库中筛选目的基因。

该法的优点是获得的目的基因的组织结构与天然基因完全相同，在结构基因中也含有内含子序列，但是也正因为这一点构成了该法最大缺点，即含有内含子的基因在原核细胞中不能表达。

原因是原核细胞不能识别并剪切插入顺序(内含子)，因而也不能表达出正确的基因产物。

2、分离纯化细胞中的mRNA，以mRNA为模板，在反转录酶作用下生成cDNA第一链，再以cDNA第一链为模板在DNA聚合酶作用下生成双链cDNA,构建cDNA文库，从中筛选所需的目的基因。

此法仅用于筛选为蛋白质编码的结构基因。

因成熟的mRNA分子中已经切除了内含子序列，具有完整的阅读框架，可在原核细胞中正确表达。

3、人工体外合成基因：由于当前人工体外合成DNA的长度有限，此法仅用于制备小分子生物活性多肽基因和小分子量蛋白基因。

在基因较大情况下，常需先合成多个DNA片段，然后拼接成完整的基因，此法还要求目的基因的全部碱基顺序已被阐明。

4、PCR法扩增基因：PCR(聚合酶链式反应)技术的出现和发展，为目的基因的寻找提供了有力技术工具。

用PCR法可选择性扩增基因组中所要研究的个别基因或DNA片段，或用反向PCR技术，先将特定mRNA反转录为cDNA第一链，然后再进行扩增。

用PCR法筛选基因，需要对目的基因的DNA序列至少有部分了解。

二、选择适当的载体按上述方法制备的目的基因如果没有合适的载体协助，很难进入受体细胞，即使能进入，往往也不能进行复制和表达，因为这些外源性DNA一般不带有复制调控系统。

为了保证目的基因或外源DNA片段能在细胞内克隆，必须将它们与适当的载体连接。

克隆基因的筛选原理是什么克隆基因的筛选原理是指通过人工手段从大量基因样本中筛选出具有特定功能的基因，并将其放入宿主细胞中进行进一步研究和应用。

克隆基因的筛选原理主要包括基因文库构建、基因识别和筛选、基因克隆和鉴定几个关键步骤。

基因文库构建是克隆基因筛选的第一步。

基因文库是将一个生物体的全基因组按照一定的方法嵌入到携带载体中，使得携带载体中每一个片段都代表原生的一部分基因组。

构建基因文库的关键在于获取高质量的DNA样本和选择合适的携带载体。

DNA样本可通过提取原生生物体中的基因组DNA获得，或者从cDNA 文库中选择目标基因进行片段化、并连接载体。

选取合适的携带载体要考虑到质粒大小、复制能力、选择标记以及宿主菌的特点等因素。

构建好的基因文库可进一步用于基因识别和筛选。

基因识别和筛选是克隆基因筛选的关键环节。

通过基因识别和筛选可以找到含有特定功能基因的片段。

常用的基因识别和筛选方法包括杂交筛选、PCR筛选、亚克隆筛选等。

杂交筛选是目前常用的筛选方法之一，它是利用目标DNA序列与抗原DNA进行互相杂交，然后用标记技术检测杂交融合的特定单链DNA。

PCR筛选是利用特异引物进行PCR扩增，通过扩增产物的特异性确认目标基因。

亚克隆筛选是通过对目标基因片段进行酶切、分离纯化、与载体连接等操作，用于提取目标基因并确认其准确性和特异性。

基因克隆是克隆基因筛选的核心步骤。

基因克隆是将目标基因提取出来，并与携带载体连接，将得到的重组载体导入宿主细胞中进行繁殖。

常用的基因克隆技术包括限制性内切酶切割、连接酶连接、DNA凝胶电泳纯化等。

限制性内切酶切割是将目标基因和携带载体通过限制性内切酶在特定位点进行酶切，然后通过连接酶将两者进行连接。

DNA凝胶电泳纯化是通过凝胶电泳将目标基因和携带载体分离，然后提取纯化后的DNA进行进一步实验。

基因鉴定是克隆基因筛选的最后一步。

通过基因鉴定可以确认克隆的基因是否与目标基因一致，并确定其序列和功能。

鉴定重组子的方法
鉴定重组子的方法一般可分为以下几种：
1. PCR扩增法：通过聚合酶链式反应（PCR）在靶DNA序列的两端引入特定的引物，再通过PCR扩增得到重组子的DNA序列。

2. 限制性内切酶消化法：将待重组的DNA片段和载体DNA进行双酶切，然后通过连接酶将两者连接起来，最后通过转化到宿主细胞内进行复制和表达。

3. 嵌合PCR法：利用两对引物分别扩增待重组的DNA片段和载体DNA片段，两者的两端引物设计成互补序列，通过PCR扩增后，两个片段可通过重叠互补序列自行连接。

4. 策略引导融合法：通过引物设计，使待重组的DNA片段和载体DNA具有互补的序列，然后通过热变性和退火的方式使两者相互结合。

5. 基因组DNA文库筛选法：通过构建基因组DNA文库，然后通过探针的杂交和筛选，得到具有重组子的克隆。

以上是常见的鉴定重组子的方法，具体的选择可以根据实验需要和条件进行决定。