重组体克隆的筛选和鉴定

实验八重组克隆筛选（酶切鉴定）【实验目的】1.掌握质粒提取的基本方法的原理；2.学习和掌握限制性内切酶的使用方法。

【实验原理】重组克隆的筛选和鉴定是基因工程中的重要环节之一。

不同的克隆载体和相应的宿主系统，其重组克隆的筛选和鉴定方法不尽相同。

从理论上说，重组克隆的筛选是排除自身环化的载体、未酶解完全的载体以及非目的DNA片断插入的载体所形成的克隆。

常用的筛选方法有两类。

一类是针对遗传表型改变筛选法，以－半乳糖苷酶系统筛选法为代表。

另一类是分析重组子结构特征的筛选法，包括快速裂解菌落鉴定质粒大小、限制酶图谱鉴定、Southern 印迹杂交、PCR、菌落（或噬菌斑）原位杂交等方法。

1．－半乳糖苷酶系统筛选法（蓝白斑筛选法）使用本方法的载体包括M13噬菌体、pUC质粒系列、pGEM质粒系列等。

这些载体的共同特征是载体上携带一段细菌的基因lacZ。

lacZ编码－半乳糖苷酶的一段146个氨基酸的肽，载体转化的宿主细胞为lacZ△M15基因型。

重组子由于外源片断的插入使肽基因失活不能形成互补作用，也就是说，宿主细胞表现为－半乳糖苷酶失活。

因此，在X-gal平板上，重组克隆为无色噬菌斑或菌落，非重组克隆为蓝色噬菌斑或菌落。

这种筛选方法操作简单，但当插入片断较短（小于500bp），且插入片断没有影响lacZ基因的读框时，有假阴性结果的出现。

2．快速裂解菌落鉴定质粒大小从平板中挑取菌落，过夜培养后裂解，直接进行凝胶电泳，与载体DNA比较，根据迁移率的减小初步判断是否有插入片断存在。

本方法适用于插入片断较大的重组子的初步筛选。

3．限制酶图谱鉴定对于初步筛选具有重组子的菌落，提纯重组质粒或重组噬菌体DNA，用相应的限制性内切酶（一种或两种）切割重组子释放出的插入片断，对于可能存在双向插入的重组子还可用适当的限制性内切酶消化鉴定插入方向，然后用凝胶电泳检测插入片断和载体的大小。

4．Southern 印迹杂交为确定DNA插入片断的正确性，在限制性内切酶消化重组子、凝胶电泳分离后，通过Southern 印迹转移将DNA移至硝酸纤维膜上，再用放射性同位素或非放射性标记的相应外源DNA片断作为探针，进行分子杂交，鉴定重组子中的插入片断是否是所需的靶基因片断。

重组dna克隆子的筛选及鉴定注意事项嘿，宝子们！今天咱们来唠唠这个《重组DNA克隆子的筛选及鉴定注意事项》呀。

首先呢，咱得知道啥是重组DNA克隆子哇。

这可是生物技术里超重要的东西呢！在筛选的时候呀，有好多要注意的点呢。

一、筛选方面的注意事项1. 选择合适的筛选标记呀！哎呀呀，这可太关键了呢。

比如说抗生素抗性标记，常见的像氨苄青霉素抗性、卡那霉素抗性等等。

你得确保这个标记是准确有效的哇，不然怎么能筛选出咱们想要的克隆子呢？要是标记弄错了，那可就像大海捞针一样乱套了呀！在选择的时候，一定要根据你的载体和宿主细胞的特性来确定呢，可不能瞎选哦！2. 筛选条件要精确呢。

比如说使用抗生素筛选的时候，抗生素的浓度一定要控制好哇！浓度低了呢，那些没有成功重组的细胞可能也会生长，这就达不到筛选的目的啦；浓度高了呢，可能会把一些好不容易重组成功的细胞也给抑制住了呀，这多可惜呢！所以呀，要通过预实验来确定最佳的抗生素浓度呢，这个步骤可不能偷懒哦！3. 筛选的时间也很重要呢！哇，你可别以为把细胞放在筛选培养基里就不管了。

时间太短，可能那些非重组子还没有完全被抑制住；时间太长呢，可能会导致重组子因为营养缺乏或者其他原因生长受到影响呢。

所以要时刻关注细胞的生长状态，确定合适的筛选时间呀。

二、鉴定方面的注意事项1. 酶切鉴定要小心哦。

在进行酶切鉴定的时候呢，首先要选择合适的限制性内切酶呀。

这就像开锁要用对钥匙一样呢。

要是酶选错了，可能就切不出你想要的条带啦，那怎么能鉴定出正确的克隆子呢？而且呀，酶切反应的体系一定要准确无误呢。

各种成分的量，像酶的量、缓冲液的浓度、DNA的量等等，都要严格按照说明书来操作呢，不然很容易出现酶切不完全或者酶切失败的情况呢！2. PCR鉴定也有不少讲究呢。

引物的设计那可是重中之重呀！哇，引物要是设计得不好，可能就扩增不出咱们想要的片段呢。

要确保引物的特异性，不能跟其他非目标序列结合呢。

还有呀，PCR反应的条件也要不断优化呢。

重组体的筛选方法1、重组体的基本筛选概念重组体（recombinant）指从不同生物系统中获取的非天然表达载体，以用于表达特定蛋白质或DNA片段，通常为了检测某种生物活性，以改良生物机理或更改特定特性。

重组体的筛选是对重组体表达的非天然蛋白质进行筛选的过程，可以用来鉴定新的蛋白质、表达具有特定生物活性的蛋白质，或确定新的重组体表达载体。

表达系统筛选通常包括利用基因工程技术在指定载体上表达特定基因编码片段，然后使用分子生物学、免疫学和生物化学方法进行在细胞水平或分子水平上进行分析和筛选，以鉴定具有特定生物活性的重组体表达系统。

2、方法（1）载体筛选。

在大多数重组体表达系统中，筛选的首要任务是识别具有最佳表达能力的载体，其中也可能涉及到大量的载体类型。

可以分别从细胞系、染色体、质粒、全基因组、融合蛋白等不同类型的载体中选择重组体。

有些载体可能会更有效地表达特定基因，而有些可能会产生低产蛋白，因此需要进行大量的筛选才能有效地识别最佳的表达系统载体。

（2）表达率筛选。

在细胞中表达的蛋白质必须具有最大的表达量才能产生最佳的活性，因此对重组蛋白质的表达量非常重要。

在大多数情况下，使用多种不同的表达系统技术来评估重组体表达质量，例如利用Western和Northern blotting、Immunoprecipitation、活性测定和流式细胞术等技术。

（3）特异性筛选。

在获得足够数量的蛋白质之后，必须进一步确定表达体的特异性，特异性不仅取决于重组蛋白质可以被正确表达和结构功能完整，而且应该是特异性，以使其产生预期的生物活性。

因而，重组体的筛选过程还必须包括一项评估表达蛋白质的特异性的步骤，释放的生物活性水平是最重要的特征，在此筛选步骤中，可以使用酶抑制试验、衍生物筛选、细胞学剂量响应性试验或免疫学、化学、物理学方法来评估重组表达体的活性。

3、结论重组体表达是一种实用技术，它旨在确定特定生物学活性的最佳表达系统，以获得有价值的蛋白质或未知活性的分子。

重组子的筛选方法一、引言重组子筛选是基因工程中的一项关键技术，用于识别和分离含有目的基因的克隆。

随着生物技术的不断发展，重组子筛选方法也日益多样化，为研究者提供了更多选择。

本文将对几种常见的重组子筛选方法进行详细介绍，并比较其优缺点。

二、常见重组子筛选方法1. 蓝白筛选法：蓝白筛选法是一种基于λ噬菌体载体和lacZ基因的筛选方法。

其基本原理是利用lacZ基因编码的β-半乳糖苷酶可以将无色底物X-gal转化为蓝色产物。

当载体上含有目的基因时，lacZ基因被破坏，无法产生β-半乳糖苷酶，菌落呈白色。

这种方法操作简便，适用于大量筛选。

2. 抗性筛选法：抗性筛选法是利用标记基因赋予宿主菌抗药性或营养缺陷型特性，从而筛选重组子的方法。

例如，利用卡那霉素抗性基因（neo）对细菌进行筛选。

当载体上含有目的基因时，neo基因被破坏，重组子对卡那霉素产生抗性。

这种方法成本低廉，适用于实验室条件。

3. 荧光标记筛选法：荧光标记筛选法是利用荧光标记探针与目的基因杂交，通过荧光显微镜观察荧光信号来筛选重组子的方法。

该方法灵敏度高，可实现自动化操作。

然而，荧光标记探针制备成本较高，且对实验操作要求较高。

4. 测序法：测序法是通过对目的基因进行测序，比对已知序列来确定重组子的方法。

该方法准确度高，适用于所有基因型重组子的筛选。

然而，测序法成本较高，操作复杂，不适合大量筛选。

三、比较与讨论蓝白筛选法、抗性筛选法和荧光标记筛选法各有优缺点。

蓝白筛选法操作简便、成本低廉，适用于大量筛选；但灵敏度较低，可能会漏掉一些弱阳性克隆。

抗性筛选法成本低、适用范围广；但标记基因可能会影响目的基因的表达，导致结果不准确。

荧光标记筛选法灵敏度高、可自动化操作；但成本较高，对实验操作要求严格。

测序法则准确度高，可适用于所有基因型重组子的筛选；但成本较高、操作复杂，不适合大量筛选。

因此，在选择重组子筛选方法时，应根据具体实验需求和条件进行综合考虑。

一、实验目的1. 学习重组载体的构建原理和方法；2. 掌握基因克隆、酶切、连接等基本操作；3. 鉴定重组载体的构建成功与否。

二、实验原理重组载体构建是指将目的基因插入到载体中，形成具有特定功能的重组DNA分子。

实验中，通过PCR扩增目的基因，将其与载体进行酶切连接，构建重组载体。

三、实验材料1. 基因组DNA（含有目的基因）；2. 载体DNA；3. 限制性内切酶；4. DNA连接酶；5. DNA标记物；6. 转化试剂；7. 载体宿主菌（如大肠杆菌）；8. PCR试剂；9. 电泳试剂；10. 实验器材。

四、实验步骤1. 目的基因的扩增：以基因组DNA为模板，设计特异性引物，利用PCR技术扩增目的基因。

2. 载体的酶切：分别对载体DNA和目的基因进行限制性内切酶酶切，获得具有相同黏性末端的DNA片段。

3. DNA连接：将酶切后的载体DNA和目的基因进行连接，形成重组载体。

4. 转化：将连接好的重组载体转化到载体宿主菌中。

5. 重组载体的筛选与鉴定：a. 抗生素筛选：在含有抗生素的培养基上接种转化菌，观察菌落生长情况；b. PCR鉴定：提取转化菌的DNA，进行PCR扩增，检测目的基因是否插入载体；c. 酶切鉴定：对PCR鉴定为阳性的转化菌进行酶切，观察酶切图谱与预期结果是否一致；d. 序列分析：对酶切鉴定为阳性的转化菌进行DNA测序，验证目的基因插入载体的正确性。

五、实验结果与分析1. PCR扩增：成功扩增出目的基因片段，大小与预期一致。

2. 酶切：载体DNA和目的基因分别进行酶切，获得具有相同黏性末端的DNA片段。

3. DNA连接：连接反应成功，形成重组载体。

4. 转化：转化菌在含有抗生素的培养基上生长良好。

5. 重组载体的筛选与鉴定：a. 抗生素筛选：转化菌在含有抗生素的培养基上生长，说明已成功转化；b. PCR鉴定：PCR扩增结果显示，转化菌中含有目的基因；c. 酶切鉴定：酶切图谱与预期结果一致，证明目的基因已插入载体；d. 序列分析：DNA测序结果与预期序列一致，验证目的基因插入载体的正确性。

鉴定重组子的方法
鉴定重组子的方法一般可分为以下几种：
1. PCR扩增法：通过聚合酶链式反应（PCR）在靶DNA序列的两端引入特定的引物，再通过PCR扩增得到重组子的DNA序列。

2. 限制性内切酶消化法：将待重组的DNA片段和载体DNA进行双酶切，然后通过连接酶将两者连接起来，最后通过转化到宿主细胞内进行复制和表达。

3. 嵌合PCR法：利用两对引物分别扩增待重组的DNA片段和载体DNA片段，两者的两端引物设计成互补序列，通过PCR扩增后，两个片段可通过重叠互补序列自行连接。

4. 策略引导融合法：通过引物设计，使待重组的DNA片段和载体DNA具有互补的序列，然后通过热变性和退火的方式使两者相互结合。

5. 基因组DNA文库筛选法：通过构建基因组DNA文库，然后通过探针的杂交和筛选，得到具有重组子的克隆。

以上是常见的鉴定重组子的方法，具体的选择可以根据实验需要和条件进行决定。