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第六章 重组体克隆的筛选和鉴定

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重组体筛选和鉴定PPT课件

重组体筛选和鉴定PPT课件
通过在培养基中添加抗生素或 其他抗性标记物，筛选出含有 目的基因的重组细胞或菌落。
标志基因筛选
免疫学筛选
利用载体上的标志基因对重组 体进行筛选，如利用lacZ基因进 行β-半乳糖苷酶活性检测。
利用抗体与目的蛋白的特异性 结合，通过免疫学方法对重组 体进行筛选。
荧光标记筛选
利用荧光标记的目的基因或蛋 白质进行筛选，通过荧光检测 仪检测荧光信号。
重组体在生物工程中的应用
生物制药
利用重组技术生产具有治疗价 值的重组蛋白、抗体或细胞因 子等生物药物。
基因工程菌构建
通过基因重组技术构建具有特 定功能的基因工程菌，用于工 业微生物发酵和物质转化。
农作物改良
通过基因重组技术改良农作物 性状，提高产量、抗逆性和品 质等。
重组体在医学中的应用
诊断试剂开发
剂的安全性。
05
重组体的未来发展
重组体技术的发展趋势
基因编辑技术的进步
随着CRISPR等基因编辑技术的不断完善，重组体的构建将更加高 效和精确。
人工智能与大数据的结合
人工智能和大数据技术的应用将有助于提高重组体筛选和鉴定的准 确性和效率。
细胞工厂的构建
利用重组技术构建细胞工厂，实现微生物生产的高效转化，为生物 制药等领域提供有力支持体的环境安全性评估
评估重组体在环境中的存活、繁殖和扩散能力，以及可能对生态环 境造成的影响。
重组体的食品安全性评估
对重组体作为食品或食品添加剂的安全性进行评估，确保其食用安 全。
重组体的安全性检测方法
02
01
03
生物学检测
通过生物学实验检测重组体的生物学特性、遗传稳定 性等。
环境适应性检测
检测重组体在环境中的存活、繁殖和扩散能力。

重组体克隆的筛选和鉴定

重组体克隆的筛选和鉴定

抗性筛选
通过载体上的抗性基因，如Amp抗性 基因，对重组体克隆进行筛选，重组 的克隆具有抗性。
筛选流程
转化
将目的基因和载体DNA共转化到大肠杆菌中 。
克隆筛选
根据筛选方法，从转化子中筛选出重组体克 隆。
培养和扩增
将筛选出的重组体克隆进行培养和扩增，以 备后续鉴定。
筛选中的注意事项
避免假阳性
在筛选过程中要严格控制条件，避免出现假阳 性结果。
生物化学鉴定法
通过检测表达产物的生化性质， 如酶活性等，判断目的基因是否 成功表达。
鉴定流程
构建重组体克隆
将目的基因与载体DNA连接， 形成重组体克隆。
转化受体细胞
将重组体克隆导入受体细胞中 ，使目的基因在受体细胞中表 达。
筛选阳性克隆
通过抗性筛选、PCR鉴定等方 法筛选出含有目的基因的阳性 克隆。
生物信息学技术
通过生物信息学技术，可以对重组体克隆进行全面的分析和鉴定，包 括基因组、转录组和蛋白质组等多个层面。
重组体克隆在其他领域的应用前景
生物制药
重组体克隆技术在生物制药领域具有广泛的应用前景，可用于生 产高纯度、高质量的药物。
生物能源
利用重组体克隆技术可以改良微生物，提高生物燃料的生产效率。
在生物制药领域的应用
药物靶点发现
01
通过筛选重组体克隆，可以发现新的药物靶点，为新药研发提
供基础。
药物作用机制研究
02
通过鉴定重组体克隆，可以深入了解药物的作用机制，为药物
优化提供依据。
药物筛选
03
利用重组体克隆进行高通量药物筛选，提高药物发现的效率。
在基因治疗领域的应用
基因功能研究

重组dna克隆子的筛选及鉴定注意事项

重组dna克隆子的筛选及鉴定注意事项

重组dna克隆子的筛选及鉴定注意事项嘿，宝子们！今天咱们来唠唠这个《重组DNA克隆子的筛选及鉴定注意事项》呀。

首先呢，咱得知道啥是重组DNA克隆子哇。

这可是生物技术里超重要的东西呢！在筛选的时候呀，有好多要注意的点呢。

一、筛选方面的注意事项1. 选择合适的筛选标记呀！哎呀呀，这可太关键了呢。

比如说抗生素抗性标记，常见的像氨苄青霉素抗性、卡那霉素抗性等等。

你得确保这个标记是准确有效的哇，不然怎么能筛选出咱们想要的克隆子呢？要是标记弄错了，那可就像大海捞针一样乱套了呀！在选择的时候，一定要根据你的载体和宿主细胞的特性来确定呢，可不能瞎选哦！2. 筛选条件要精确呢。

比如说使用抗生素筛选的时候，抗生素的浓度一定要控制好哇！浓度低了呢，那些没有成功重组的细胞可能也会生长，这就达不到筛选的目的啦；浓度高了呢，可能会把一些好不容易重组成功的细胞也给抑制住了呀，这多可惜呢！所以呀，要通过预实验来确定最佳的抗生素浓度呢，这个步骤可不能偷懒哦！3. 筛选的时间也很重要呢！哇，你可别以为把细胞放在筛选培养基里就不管了。

时间太短，可能那些非重组子还没有完全被抑制住；时间太长呢，可能会导致重组子因为营养缺乏或者其他原因生长受到影响呢。

所以要时刻关注细胞的生长状态，确定合适的筛选时间呀。

二、鉴定方面的注意事项1. 酶切鉴定要小心哦。

在进行酶切鉴定的时候呢，首先要选择合适的限制性内切酶呀。

这就像开锁要用对钥匙一样呢。

要是酶选错了，可能就切不出你想要的条带啦，那怎么能鉴定出正确的克隆子呢？而且呀，酶切反应的体系一定要准确无误呢。

各种成分的量，像酶的量、缓冲液的浓度、DNA的量等等，都要严格按照说明书来操作呢，不然很容易出现酶切不完全或者酶切失败的情况呢！2. PCR鉴定也有不少讲究呢。

引物的设计那可是重中之重呀！哇，引物要是设计得不好，可能就扩增不出咱们想要的片段呢。

要确保引物的特异性，不能跟其他非目标序列结合呢。

还有呀，PCR反应的条件也要不断优化呢。

重组子的筛选与鉴定

重组子的筛选与鉴定
氨苄青霉素抗性基因：
产生-内酰胺酶，使氨苄青霉素转变为青霉酮 酸，使碘-青霉素指示液（I2-KI-Aampicillin） （蓝灰色）褪色。
2020/7/30
（1）四环素抗性插入失活
当外源DNA限制片段插入pBR322质粒的BamH I和Sal I位点时，抗 四环素基因失活，重组体转化子必定具有Ampr Tets表型。将转化 菌先涂布在含有Ampr的琼脂平板上并将存活的Ampr菌落原位影印 到另一个含有Tet的琼脂平板上，凡是在Ampr平板上生长，而不在 Tet平板亡生长的菌落，就必定是已经插入了外源DNA限制片段的重 组质粒2020转/7/3化0 子克隆。
2020/7/30
第二节 核酸分子杂交检测法 • 1 原理 • 2 核酸杂交检测方法
2020/7/30
• 利用碱基配对的原理进行分子杂交是核酸分析的重要手 段，也是鉴定基因重组体的常用方法。杂交的双方是待 测的核酸序列和由插入片段基因制备的DNA或RNA探针 。
• 这些方法都是通过一定的物理方法将菌落(噬菌斑)或提 取的DNA从平板或凝胶上转移到固体支持物上，然后同 液体中的探针进行杂交。菌落(噬菌斑)或DNA从平板或 凝胶向滤膜转移的过程称为印迹，故这些杂交又都称为 印迹(blotting)杂交。
2020/7/30
1、原理： 1.1 核酸杂交 重组克隆与探针杂交。 1.2 检测用的探针 与外源DNA插入片断互补的序列。 1.3 识别标记
-半乳糖苷酶 Xgal
2020/7/30
半乳糖 5-溴-4-氯靛蓝
载体上LacZ’的5’端有一段多克隆位点(MCS)区，本身 虽不干扰LacZ’的合成，但插入外源基因就会阻止 LacZ’的合成。不能互补。
2020/7/30

克隆鉴定

克隆鉴定
第六章第六章重组体的筛选和鉴定重组体的筛选和鉴定菌落杂交筛选法菌落杂交筛选法pcrpcr法鉴定克隆法鉴定克隆酶切鉴定克隆酶切鉴定克隆核苷酸序列的测定核苷酸序列的测定克隆基因的表达验证克隆基因的表达验证菌落杂交筛选法菌落杂交筛选法挑克隆挑克隆pcrpcr法鉴定克隆法鉴定克隆100l100l培养物中加入培养物中加入500l500l水水2mllb372mllb37223h3h离心保留沉淀离心保留沉淀重悬于重悬于500l500l水中煮沸水中煮沸pcrpcr测序测序电泳电泳酶切鉴定克隆酶切鉴定克隆挑克隆挑克隆2mllb372mllb37过夜培养过夜培养质粒提取质粒提取酶切质粒酶切质粒电泳电泳测序测序转染转染克隆基因的表达鉴定克隆基因的表达鉴定收集细胞并裂解收集细胞并裂解sdssdspagesdssdspagepagepagewesternblotwesternblotadam8151719cdnapcdna31v5hek293cellsdspagewesternblotv5antibodyhrpproteingsubstract?v5tag?gkpipnpllgldst?hglylysproileproasnproleuleuglyleuaspserthroh?thissequenceisfromthecterminal?thissequenceisfromthecterminalsequenceofthepandvproteinsofsimianvirus5?hrphorseradishperoxidase辣根过氧化物酶教学要求?掌握
• V5 tag • GKPIPNPLLGLDST • H - Gly - Lys - Pro - Ile - Pro - Asn - Pro Leu - Leu - Gly - Leu - Asp - Ser - Thr – OH • This sequence is from the C-terminal sequence of the P and V proteins of Simian Virus 5 • HRP (horse radish peroxidase,辣根过氧化 物酶 )

(参考)基因工程 第六章 DNA重组的操作

(参考)基因工程 第六章 DNA重组的操作
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(三) 酶联免疫吸附测定（ELISA） Enzyme-linked immunosorbant assay 1. 原理：
一抗（primary antibody）: 与目标分子的特异结合。 二抗（secondary antibody）： 与一抗的特异性结合。
2. 酶联（enzyme-link）： 二抗上携带一种酶能催 化无色底物转变为有色的物质（或发光），再通 过比色测定有色物质的含量（或光强度），从而
其中载体介导的转化方法是目前植物基因工程中使用最多、 机制最清楚、技术最成熟的一种转化方法，而转化载体中 又以Ti质粒转化载体最为重要。
26
（三）重组DNA导入动物细胞
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 磷酸钙沉淀法 脂质体介导感染法 显微注射法 病毒感染法 DEAE葡聚糖转染技术 电击法 血影细胞介导法
为了克服以上弊端，目前对平末端连接常采用同 聚物加尾法、衔接物连接法和DNA接头连接法等改 进方法。
9
三、PCR产物的连接
PCR扩增是获得目的基因的重要途径 PCR产物的连接是基因工程实验中经常性的工作， 其主要方法有：
引入酶切位点克隆法、T-A克隆法和平末端克隆法等
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（一）引入酶切位点连接法
21
电转化的原理图（引自孙明，2006）
22
（二）感染 将以λ噬菌体DNA为载体的DNA重组分子包装成病毒 颗粒，使其感染受体菌的过程称为感染，由噬菌体 和细胞病毒介导的遗传信息转移过程也称为转导 （transduction）
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二、重组DNA导入真核细胞的方法
常用的方法有电击法、磷酸钙沉淀法、脂质体 介导法等； 进入细胞的DNA可以被整合至宿主细胞的基 因组中，也可以在染色体外存在和表达。

第六章重组体的筛选与鉴定

第六章重组体的筛选与鉴定

一、根据载体表型特征的筛选 （一）抗药性标记插入失活筛选法 检测外源DNA插入作用的一种通用方法是插入失活效应。 检测外源DNA插入作用的一种通用方法是插入失活效应。 DNA插入作用的一种通用方法是插入失活效应
1.以 1.以pBR322质粒为例 质粒为例
（1）pBR322质粒的一般特性 质粒的一般特性 在pBR322质粒上有两个抗生素基因，Ampr基因内有 pBR322质粒上有两个抗生素基因， 质粒上有两个抗生素基因 一个PstⅠ限制性核酸内切酶的唯一识别位点， PstⅠ限制性核酸内切酶的唯一识别位点 一个PstⅠ限制性核酸内切酶的唯一识别位点，Tetr基 因内有BamHⅠ和SalⅠ两种限制性核酸内切酶单一识别 因内有BamHⅠ和SalⅠ两种限制性核酸内切酶单一识别 BamHⅠ 两种限制性核酸内切酶单一 位点。 位点。
如下图所示
一、根据载体表特征的筛选 （一）抗药性标记插入失活筛选法
Ampr pBR322 Tetr AmprTetr
菌落原位影印
pBR322
+
pBR322
AmprTets
Amp琼脂平板 琼脂平板
Tet琼脂平板 琼脂平板
图 应用抗生素抗性基因插入失活筛选重组体
一、根据载体表特征的筛选 （二）β-半乳糖苷酶显色反应筛选法 1.乳糖操纵子的结构 1.乳糖操纵子的结构
二、根据插入基因遗传性状的筛选 (一)原理 重组体DNA分子转化到大肠杆菌受体细胞后, DNA分子转化到大肠杆菌受体细胞后 重组体DNA分子转化到大肠杆菌受体细胞后,如果 插入在载体分子上的外源基因能够实现其功能性的表 插入在载体分子上的外源基因能够实现其功能性的表 达,而且表达的产物能与大肠杆菌菌株的营养缺陷突变 形成互补,那么就可以利用营养突变株进行筛选. 形成互补,那么就可以利用营养突变株进行筛选. 互补 (二)举例 当外源目的基因为合成亮氨酸的基因时 当外源目的基因为合成亮氨酸的基因时,将该基因 亮氨酸的基因 重组后转入缺少亮氨酸合成酶基因的菌株中,在仅仅缺 缺少亮氨酸合成酶基因的菌株中 重组后转入缺少亮氨酸合成酶基因的菌株中,在仅仅缺 亮氨酸的基本培养基上筛选,只有能利用 能利用表达产物亮 少亮氨酸的基本培养基上筛选,只有能利用表达产物亮 氨酸的细菌才能生长 因此,获得的转化子都是重组子 生长, 转化子都是重组子. 氨酸的细菌才能生长,因此,获得的转化子都是重组子.

实验17-重组体筛选与鉴定

实验17-重组体筛选与鉴定

受体菌：his外源基因：his+
在不含组氨酸的 培养基中生长
2. 增加新性状
使被转化的受体菌表现出外源基因的表型。 例： 小鼠的二轻叶酸还原酶（DHFR）对三甲氧 苄二氨嘧啶有抗性。
DHFR 载体
转化受 连接 体菌
三甲氧苄二氨嘧 啶培养基平板
含DHFR的克隆才能生长
三 DNA电泳检测法
利用有插入片段的重组载体的分子量比 野生型载体分子量大。
无环丝氨酸培养基
（2）氨苄青霉素抗性插入失活选择过程
如果Ampr上插入外源DNA，导致氨苄 青霉素抗性基因失活，可用碘-青霉素 指示液选择。
二 根据插入基因的表型选择
利用插入的外源基因的表达产物特性进行直 接选择。（只在特定条件下）。
一、原理：
1.弥补缺陷
转化进来的外源基因产物能够弥补受 体菌株的突变型缺陷。
只有带有插入片断的重组载体才能 与探针杂交，在底片上曝光显示。
酶切前
酶切后
载体
插入片断
Southern blot 筛选 结果
（1）原位杂交筛选
特点： 对应的菌斑或噬菌斑位置不变， 可以直接找出阳性菌落。
（2）R-环检测法
1）原理： DNA-RNA杂交。
2）选择过程
用外源基因的mRNA与重组载体杂交。
2.取其中500ul菌液于一含50mlLB培养液的锥形瓶中，37℃振摇 培养至OD600值达到0.5-0.6之间
3. 取50ml菌液置于离心管内，4 ℃ 4500g离心5分钟
4. 加入30ml ,100mM的冰冷CaCl2溶液，摇荡重悬细胞，冰浴 30分钟
5. 4℃ 4500g离心5分钟收集细胞后，加2 ml ,100mM的冰冷 CaCl2溶液轻轻悬浮细胞,冰上放置几分钟,即成感受态细胞悬

基因工程6重组体克隆的筛选与鉴定.pptx

基因工程6重组体克隆的筛选与鉴定.pptx

此外，在pBR322质粒的Ampr基因序列中， 也有一个Pst I限制酶的唯一识别位点。Ampr基 因正常情况下表达产生-内酰胺酶，在其作用 下青霉素会变成青霉酮酸，当加入碘-青霉素指 示液（30% I2，1.5% KI，5%青霉素G，0.05M 的pH 6.4的磷酸缓冲液），AmprTetr菌落为无 色透明。但当pBR322质粒的Ampr基因插入失 活后，AmpsTetr菌落在碘-青霉素指示液中不褪 色，仍呈碘的蓝灰色。根据菌落周围指示液颜
先将含有DHFR-mRNA的小鼠总mRNA制 嘧啶呈 现抗性这种性状特征，将转化的细菌生长在含 有三甲氧苄二氨嘧啶的培养基中（其含量水平 为可以抑制大肠杆菌的DHFR的活性），选择 转化子。这样分离出来的抗性克隆，显然都是 由于具有小鼠DHFR基因的克隆片段，赋予寄 主细胞新的抗性表型所致。
6.1.3 利用噬菌斑形态选择重组体分子
把DNA包装成有活性的噬菌体颗粒，主 要取决于两个因素：一是要具有能被噬菌体 包装蛋白和头部前体所识别的区域，即cos区； 二是DNA的长度，只有重组体DNA是野生型 DNA的75~105%的长度时，才能在培养平板上 形成清晰的噬菌斑，而单一的载体DNA是不 会包装成பைடு நூலகம்的噬菌体颗粒的。
对于这些由混合的DNA制剂转化而来的大 量的克隆群体，需要采用特殊的方法，才能选 择和鉴定出可能含有目的基因的重组体克隆。 目前已发展和应用了一系列重组体克隆检测法， 包括遗传检测法、物理检测法、使用特异性探
针的核酸杂交法，以及免疫化学法等。
6.1 利用表型特征选择（遗传检测法）
表型是指机体遗传组成同环境相互作用 所产生的外观或其他特征。这里所说的供筛 选用的表型特征来自两个方面：一个是克隆 载体提供的，另一方面是插入的外源DNA序 列提供的，前者应用较多。

重组克隆的筛选与鉴定.ppt

重组克隆的筛选与鉴定.ppt
②然后再通过检测-半乳糖苷酶的活性， 来选择重组子，如果既能抗氨苄青霉素， 又能合成-半乳糖苷酶的细胞，就是重 组子细胞。
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③-半乳糖苷酶分解X-gal的显色反应很 灵敏。当在含有氨卡青霉素、X-gal、 IPDG的培养基中，那些能合成完整的 -半乳糖苷酶的非重组子克隆，会因它 能分解X-gal而变成蓝色；④而重组子 克隆因Lac Z基因被破坏，不能合成完 整的-半乳糖苷酶，故不能分解X-gal而 呈白色。
②用一个牙签接触培养基的表面，将沾有不 同菌落的牙签，放到另一含有四环素的固体 培养基表面接触一下。
③适温培养，有的克隆生长，有的不生长。 ④根据不会生长的位置，再回到带氨苄的培
养基上去找那些原始的克隆。 ⑤这些克隆因为丧失了对四环素的抗性，就
是含有重组pBR322质粒的重组子。
6
图 pBR322的结构图
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2. 同源序列
不同来源的核酸单链只要彼此之间有一 定程度的互补顺序，即某种程度的同源 性，就可形成杂交双链。
分子杂交可在DNA与DNA（Southern blot）、RNA与DNA（Northern blot） 或RNA与RNA（In situ）的二条单链之 间进行。
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3. 分子杂交法
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第四节 核酸的分子杂交
核酸杂交技术由Hall、Nygaard等于70 年代建立，应用DNA或RNA探针，与 靶序列在溶液中杂交，检测固定在硝酸 纤维素（NC）膜上的核酸序列的技术。
核酸杂交法利用标记的核酸探针，与转 化细胞的DNA进行杂交，可以直接筛选 将转化后生长的菌落，复 印到硝酸纤维膜上，再用碱裂细菌菌落， 释放的DNA就吸附在膜上，再与标记的 核酸探针温育杂交，核酸探针就结合在 含有目的序列的菌落DNA上。

重组体的筛选和鉴定

重组体的筛选和鉴定

1975年，英国Southern创建
针对DNA的杂交，即将DNA电泳、转印到固相支持物上，用探 针进行检测的方法。
原理：将重组菌的基因组或质粒DNA提取出来，经合适的限制
性内切酶酶切后，进行琼脂糖凝胶电泳分离，把定位在凝胶 中的DNA碱变性处理，使其双链DNA分开，再将凝胶中变性的 DNA转移到硝酸纤维素膜上，用制备的标记探针与其充分混合， 进行同源性DNA杂交。
为Tcr表型．而质粒为Tcs表型。

转化菌涂在Tc平板上，只有含有外源DNA插入片段
的阳性重组子的转化菌能生长成菌落。
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（3）显色反应筛选：蓝白斑筛选
乳糖 -半乳糖苷酶 X-gal 半乳糖 + 葡萄糖 + 5-溴-4-氯靛蓝 α-互补 深蓝色 （酶活）
半乳糖
β—半乳 糖苷酶
α链（lacZα） ：四聚体装配
A
T T
表型筛选加酶切筛选
T A A T
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二、目的克隆的鉴定
（一）核酸分子杂交(nucleic acid hybridization) 原理

具有一定同源性的两条核酸单链在一定条件下(适宜的温 度和离子强度)可按碱基互补的原则退火形成双链.
杂交分子可在DNA和DNA、DNA和RNA、RNA和RNA以及人工合
18

19
20
pUC18/19
5’
lacZ’
EcoRI SacI
EcoRI SacI
KpnI SmalI BamHI XbaI SalI
pUC18
PstI
SphI Hind III
ATGACCATGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTGGCACTG

重组体的筛选与鉴定优秀课件

重组体的筛选与鉴定优秀课件
法
1. 原理： pBR322质粒上有两个抗菌素抗性基因: Tetr和Ampr。 Tetr上有插入位点BamH I和Sal I; Ampr上有插入位点Pst I。
pBR322
2. pBR322抗菌素标记选择
（1）四环素：
抑制细菌生长，但不杀死细菌。
或用合适的内切酶切下插入片断，再用 其它酶切这个片断，电泳后比较结果是 否符合预计的结果。
酶切前
酶切后
载体
插入片断
A
B
A或B
不同克隆的酶切结果
筛选A 过A程T T
TA AT
表型筛选加酶切筛选
用EcoRI和HindⅢ分别切割同一来源的染色体DNA,并 进行克隆,在前者的克隆 中筛选到A基因,但在后者的克 隆中未筛选到A基因,请说明原因.
2. 受体细胞
受体细胞除了具备限制重组缺陷性状外，还与所转化载体 DNA性质相匹配
3. 转化操作方面
受体细胞的预处理 感受态细胞的制备
如：Ca2+诱导的转化细胞与菌 龄、氯化钙处理时间（12~24h） 感受态的保存期、热脉冲时间等
4. 转化后重组子的整合与表达
筛选的两层含义：将携带有外源插入DNA片段的克隆挑选出来，将携 带有外源插入片段的重组体挑选出来
Tetr失活的菌生长被四环素抑制，不被环 丝氨酸杀死，保留下来； Tetr不失活的菌抗四环素，能分裂生长， 反而被环丝氨酸杀死。
无环丝氨酸培养基
（2）氨苄青霉素抗性插入失活选择过程
如果Ampr上插入外源DNA，导致氨苄 青霉素抗性基因失活，可用碘-青霉素 指示液选择。
二、-半乳糖苷酶显色反应选择法
受体菌：his外源基因：his+
在不含组氨酸的 培养基中生长
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孔底
（2）一抗结合 加入一抗，反应后冲洗掉未结合的抗体。 一抗
（3）二抗结合 加入二抗，与一抗结合后再将未结合的二 抗冲洗掉。二抗只识别一抗。 二抗
二抗上联着一种酶（碱性磷酸酶、过氧化物 酶、脲酶等）。
（4）显色反应
加入无色的底物，被二抗上所带的酶催 化反应转变成有色物质（或发光）。
（5）比色
1.原理：
（1）SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳
（SDS-PAGE）： ① SDS:
是蛋白质的变性剂，使煮沸变性的 蛋白质维持线性状态，并与蛋白质 结合，使蛋白质带上负电荷。
② 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）： （Polyacrylamide gel electrophoresis）
在电场的作用下线性 蛋白质链在聚丙烯酰 胺凝胶介质中向正极 移动，移动的速率主 要取决于其分子量大 小（链的长短），从 而把不同分子量的肽 链分开。
4）清洗掉未结合的二抗。 5）用HRPO的底物浸泡膜。 6）暗室里曝光，冲洗胶片。
Immuno Blotting
④结果 单抗blotting 结果
多克隆抗体 Blotting的 结果
第六节 转译筛选法
借助无细胞翻译系统，通过表达或抑制所选 择的克隆载体上的外源基因的转录，来筛选 其产物是否符合预期。
第五节 免疫化学检测法
对表达产物的检测。蛋白——蛋白“杂交” 利用抗体作为“探针”来检测转入受体菌并 且表达出相应的蛋白质的外源基因。 一、放射性抗体检测法
1. 抗体与产物的结合方式 根据第一抗体（一抗）和第二抗体（二抗） 的性质可分为几种作用方式：
固相支 持滤膜
一抗
待测基因 产物蛋白
125I标记的二抗
A
B
A或B
不同克隆的酶切结果
筛选A 过A程T T
TA AT
表型筛选加酶切筛选
三、PCR扩增检测法
1. 原理 PCR能在模板序列上扩增出预期DNA片断。 2. 过程
（1）从重组克隆中提取质粒（或DNA）。 （2）用外源DNA插入片断引物作PCR。 （3）电泳PCR产物。 （4）检查是否有PCR产物。 （5）PCR产物的长度是否与外源基因一致。
2. 选择过程
假阳性： 如果插入的外源DNA正好是3的倍数并且没有 中止密码；（不破坏肽）。
-半乳糖苷酶使Xgal分解成兰色产物。
第二节 根据插入基因的表型选择
利用插入的外源基因的表达产物特性进行直 接选择。（只在特定条件下）。
一、原理：
1.弥补缺陷
转化进来的外源基因产物能够弥补受 体菌株的突变型缺陷。
一、直接电泳检测法
从转化后的菌体克隆
中分离质粒，电泳、
比较其分子量。
重
分子量
组 克
Marker 隆
载体
二、酶切电泳筛选法 1. 原理： 根据已知的外源DNA序列的限制性酶切 图谱，选择一两种内切酶切割质粒，电 泳后比较电泳结果（DNA带数和长度）。
或用合适的内切酶切下插入片断，再用 其它酶切这个片断，电泳后比较结果是 否符合预计的结果。
第六章 重组体克隆的筛选和鉴定
第一节 载体表型选择法
一、抗药性标记及其插入失活选择法 1. 原理：
pBR322质粒上有两个抗菌素抗性基因: Tetr和Ampr。 Tetr上有插入位点BamH I和Sal I; Ampr上有插入位点Pst I。
pBR322
2. pBR322抗菌素标记选择
（1）四环素： 抑制细菌生长，但不杀死细菌。
酶连（enzyme-linke）： 二抗上携带一种酶能催化一种反应将无
色的底物转变为有色的物质（或发光），再 通过比色测定有色物质的含量（或光强度）， 从而推测目标分子的含量。
待测基因 产物蛋白
一抗
待测基因 产物蛋白
一抗 二抗
酶
二抗
酶
无色的底物
有色的产物
比色观察 19
2. ELISA检测的一般步骤 （1）固定样品 将待测样品加入96孔微量滴定板 （microtiter plate）的孔中，干燥后 就被固定在孔底。
受体菌：his外源基因：his+
在不含组氨酸的 培养基中生长
2. 增加新性状
使被转化的受体菌表现出外源基因的表型。 例： 小鼠的二轻叶酸还原酶（DHFR）对三甲氧 苄二氨嘧啶有抗性。
DHFR 载体
转化受 连接 体菌
三甲氧苄二氨嘧 啶培养基平板
含DHFR的克隆才能生长
第三节 DNA电泳检测法
利用有插入片段的重组载体的分子量比 野生型载体分子量大。
固相支 持滤膜
一抗
待测基因 产物蛋白
二抗
125I 标记的二 抗结合蛋白
固相支 持滤膜
待测基因 产物蛋白
一抗 125I标记的二抗
固相支 持滤膜
待测基因 产物蛋白
一抗 二抗
125I 标记的二抗 结合蛋白
2. 放射性抗体检测法过程
3. Broome-Gilbert双位点检测法 检测融合蛋白。 既检测外源基因产物又检测载体基因产物。
乳糖 Xgal
-半乳糖苷酶
1. 原理：
半乳糖 半乳糖
+ 葡萄糖 + 5-溴-4-氯靛蓝
深蓝色
载体上有一段-半乳糖苷酶基因（Lac Z）的片段 （氨基端），其上有外源DNA的插入位点。 受体菌 基因组中有突变的-半乳糖苷酶基因（ 片段缺 失）。可以被IPTG诱导表达。 载体和受体菌基因组 可以互补形成完整有功能的-半乳糖苷酶。
（1）TK选择原理
①四氢叶酸的必要性
真核细胞核苷酸的合成需要四氢叶酸
提供甲基。
二氢叶酸
DHFR
四氢叶酸
二氢叶酸还原酶（dihydrofolate reductase，DHFR）
②氨甲喋啉（Methotrexate）的抑制作用
氨甲喋啉（或氨基喋啉）是叶酸的类似 物。 能抑制二氢叶酸还原酶，从而阻 断dATP、dCTP和dTTP的合成：
电泳buffer
电泳buffer
点样
电泳方向
③蛋白质电泳的分子
Da
量标准
已知分子量的蛋白质 混合液，与待测样品 一起电泳，为样品蛋 白质提供分子量估计。
商品化供应
道尔顿(质量单位, 等于 一氧原子质量的十六分 之一。 一克约为6×1023道尔顿
Dalton SDS PAGE
④凝胶中的蛋白质染色： 1）直接染色 考马斯亮蓝： 灵敏度底、只能检出>0.3-1μg/带，但可 褪色回收。
（2）TK选择过程
① HAT培养基：
含次黄嘌呤、氨基喋啉和胸苷的培养基。 (hypoxanthine，aminopterin，thiymidine） ② 宿主细胞
在特殊的分光光度仪（酶标仪）上比色，打 印出结果。
3.ELISA的局限性 有效，但准确性稍差（主要取决于一抗 的特异性）。 必须与其他方法一起综合考虑。
最好用单克隆抗体（monoclonal antibody）
临床检验常用的单抗
四、免疫印迹（western blotting）法 在蛋白质凝胶电泳以后，用转膜和免疫的方 法检测胶上的蛋白质泳带。
在70%甲酰胺中，把DNA双链变性，复 性的时候，DNA-RNA杂交分子比DNADNA双链更稳定。电镜下可见一种R-环 形结构。
缺点：需要电镜！
2. Northern blotting
用DNA（或RNA） 探针检测RNA样 品。
主要检测插入片 断是否被转录。
从宿主细胞中提 取RNA，再用探 针杂交。
专门设计检测能同DNA特异结合的蛋 白质因子。
硝 待测蛋白质
酸
能与蛋白质结 合的DNA序列
放射性标记
纤
维
硝
素
酸
滤
纤
膜
维
素 滤
待测蛋白质
能与蛋白质结 合的DNA序列
放射性标记
膜
一般克隆与筛选策略
第七节 几种常用的真核生物重组基因选择方法
一、哺乳动物基因转移的选择标记
1. 胸苷激酶（thymidine kinase, tk）
只有带有插入片断的重组载体才能 与探针杂交，在底片上曝光显示。
酶切前
酶切后
载体
插入片断
Southern blot 筛选
结果
（1）原位杂交筛选
特点： 对应的菌斑或噬菌斑位置不变， 可以直接找出阳性菌落。
（2）R-环检测法
1）原理： DNA-RNA杂交。
2）选择过程
用外源基因的mRNA与重组载体杂交。
质粒基因A 插入基因B
重组质粒
表达 融合蛋白 质粒蛋白A 外源蛋白B
固相支 持滤膜
抗A抗体 质粒蛋白A
外源蛋白B
固相支 持滤膜
125I标记的
抗A抗体质粒蛋白A 外源蛋白B 抗B抗体
发光，底片曝光
二、免疫沉淀检测法
检测分泌型产物。
1. 原理 抗原——抗体凝集反应。
2. 方法
把非放射性抗体加到平板培养基中， 当插入基因的表达产物被细菌分泌到 菌落周围时，就会与抗体反应形成“沉 淀圈”。
Western装置
② Blotting 原理与ELISA相同。 PAGE胶 待测蛋白
硝酸纤 待测蛋白 一抗 二抗
维素膜
辣根过氧
化物酶
底物
产物， 并发出光
辣根过氧化物酶：HRPO 底片曝光
③ Blotting过程
1）先用一抗（待测蛋白的单克隆抗体）与 膜上的蛋白结合。
2）洗去未结合的一抗。
3）用二抗与一抗结合（二抗上带有HRPO）。
放射自显影
三、杂交抑制转译法
1. 原理 mRNA一旦与DNA杂交成RNA-DNA双链 后就不能被核糖体翻译出蛋白质（转译被 抑制）。
核糖体 小亚基