GFP转基因拟南芥的培养及荧光观察

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010609570.6(22)申请日 2020.06.29(71)申请人 贵州省水稻研究所地址 550006 贵州省贵阳市花溪区贵州省农科院水稻研究所(72)发明人 闫志强　王晓雪　邓茹月　朱诉讼　尹燕斌　夏忠敏　宫彦龙　王忠妮　(74)专利代理机构 北京安信方达知识产权代理有限公司 11262代理人 陈丹　张奎燕(51)Int.Cl.G01N 21/64(2006.01)C12N 15/82(2006.01)C12N 15/65(2006.01)A01G 7/00(2006.01)(54)发明名称一种快速鉴定转基因拟南芥阳性植株的方法(57)摘要本发明公开了一种快速鉴定转基因拟南芥阳性植株的方法，所述方法包括将荧光蛋白基因和目标基因片段插入到双元载体中，随后转化农杆菌；用经转化的农杆菌转化拟南芥，收获拟南芥种子；将收获的种子播种在筛选培养基上，以筛选转基因拟南芥阳性植株；出苗后，观察拟南芥阳性植株的植物部位，如果检测到荧光信号，则可以确定该植株为转基因阳性植株，如果未检测到荧光信号，则该植株是假阳性植株。

该方法简化了筛选步骤、缩短了筛选周期、提高了筛选效率。

权利要求书1页 说明书11页序列表6页 附图11页CN 111896506 A 2020.11.06C N 111896506A1.一种筛选转基因拟南芥阳性植株的方法，所述方法包括：步骤1：将荧光蛋白基因插入到双元载体中，形成经改造的双元载体；步骤2：将目标基因片段插入到所述经改造的双元载体中；步骤3：用步骤2制备的双元载体转化农杆菌；步骤4：用经转化的农杆菌转化拟南芥，收获拟南芥种子；步骤5：将收获的种子播种在筛选培养基上，以筛选转基因拟南芥阳性植株；步骤6：出苗后，观察拟南芥阳性植株的植物部位，如果检测到荧光信号，则可以确定该植株为转基因阳性植株，如果未检测到荧光信号，则该植株是假阳性植株。

实验二荧光显微镜的基本使用方法荧光显微术是在细胞或组织水平上对生物大分子进行定位和动态观察的最常用的实验方法。

它广泛地应用于核酸、蛋白质、细胞器、细胞骨架、激素、离子等多种细胞结构或物质的定位和功能分析。

很多生命科学的研究工作都需要频繁地使用荧光显微镜。

比如，采用荧光探针的原位分子杂交用于确定某个基因在组织中的表达或在染色体上的定位（Polak et al. 1999; Andreeff and Wiley-Liss 1999），绿色荧光蛋白基因（gfp）用于了解某个基因产物在组织和细胞中的特异性分布（Chalfie et al. 1994; Haseloff and Amos 1995）等等。

然而，在我们接触的一些低年级研究生中，一些同学并没有很好地掌握荧光显微镜的基本原理和使用方法。

他们拍摄的荧光显微照片往往不能满足国际性高水平学术刊物的要求。

这种状况既不利于科研效率的提高，也限制了研究成果的发表。

因此，了解荧光显微术中的一些基本原理和注意事项、掌握荧光显微镜的基本使用方法是非常重要和有意义的。

本实验讲解荧光显微镜的基本结构和使用方法。

要求学生通过细胞核、细胞质DNA的荧光显微显示以及转绿色荧光蛋白基因拟南芥根、茎、叶细胞的观察掌握荧光显微术的基本原理和注意事项，熟练掌握荧光显微镜的使用方法。

实验目的：1. 了解荧光显微镜的基本结构；2. 掌握荧光显微术的基本原理和注意事项；3. 掌握核酸的荧光显示技术，直观地认识细胞质DNA的存在；4. 了解绿色荧光蛋白（GFP）在蛋白质定位等研究中的应用，直观地认识GFP的荧光显微效果。

实验内容：1.荧光显微镜的基本原理和结构荧光显微镜的放大成像原理与普通透射光显微镜完全相同。

不同的是荧光显微镜需要另外的激发光光源和光路。

因此，只要加上激发光光源和光路，再换上允许激发光通过的目镜（荧光显微镜的目镜在透镜玻璃的材质上与普通透射光显微镜不同），一台普通的透射光显微镜就可以被升级成一台荧光显微镜了。

拟南芥MDH2基因GFP载体构建及转基因植株的筛选鉴定王媛媛;韩洋洋;耿庆鎏;朱香豫;曹树青;樊婷婷【摘要】[Objective] In order to further study the function of MDH2 gene in response to cadmium stress in plant, the vector of Arabidopsis MDH2-GFP was built up and transgenic lines were constructed.[Method] The RNA of wild-type Arabidopsis was extracted and reverse transcribed into cDNA, the full-length MDH2 coding sequence was amplified by PCR. The amplified MDH2 gene and pXB94-GFP plasmid were digested and connected by double enzymes.The connected product was transformed into E.coli competent cells, then the true recombinant plasmid was transformed into Agrobacterium tumefaciens competent cells and the positive single colony was identified by colony PCR, then it was transferred into wild-type Arabidopsis by the floral-dip method.Finally, the positive transgenic plants were obtained by resistance screening and PCR identification.[Result]MDH2 gene was successfully cloned and the positive transgenic lines were obtained by selective medium withresistance.[Conclusion]The successful acquisition of MDH2-GFP transgenic lines laid the foundation for further research on the function of MDH2 gene.%[目的]以野生型拟南芥为材料构建MDH2基因GFP载体及GFP转基因植株, 研究MDH2基因在植物响应镉胁迫机制中的功能.[方法]通过提取野生型拟南芥的RNA, 反转录成为cDNA, 并以cDNA为模板, 利用PCR扩增MDH2基因, 将扩增所获得MDH2基因和pXB94-GFP质粒双酶切后连接, 并转化进大肠杆菌感受态细胞中, 鉴定正确后再转入农杆菌感受态细胞中, 通过菌落PCR鉴定出阳性单菌落.再通过浸花法转入野生型拟南芥中, 最后利用抗性筛选和PCR鉴定获得MDH2转基因阳性植株.[结果]成功克隆MDH2基因, 并构建了MDH2-GFP重组质粒, 抗性筛选获得了MDH2-GFP转基因植株.[结论]成功获得MDH2-GFP转基因植株, 为进一步研究该基因在植物响应镉胁迫机制中的功能奠定了基础.【期刊名称】《安徽农业科学》【年(卷),期】2019(047)002【总页数】3页(P96-98)【关键词】拟南芥;MDH2;载体;转基因植株【作者】王媛媛;韩洋洋;耿庆鎏;朱香豫;曹树青;樊婷婷【作者单位】合肥工业大学食品与生物工程学院, 安徽合肥 230009;合肥工业大学食品与生物工程学院, 安徽合肥 230009;合肥工业大学食品与生物工程学院, 安徽合肥 230009;合肥工业大学食品与生物工程学院, 安徽合肥 230009;合肥工业大学食品与生物工程学院, 安徽合肥 230009;合肥工业大学食品与生物工程学院, 安徽合肥 230009【正文语种】中文【中图分类】Q939.9土壤重金属污染已成为世界性的环境问题之一，其中重金属镉污染是对动植物具有高毒害性的污染物之一，过量的镉会对动植物细胞造成不可逆的损伤[1-4]。

植物学通报 2006, 23 (3): 249￣254Chinese Bulletin of Botany收稿日期：　２００５－１２－２０；　接受日期：　２００６－０３－０７基金项目：　科技部重大基础研究前期研究专项（９７３预研）　（２００３ＣＣＡ０１１００）＊　通讯作者　Ａｕｔｈｏｒ　ｆｏｒ　ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｅｎｃｅ．　Ｅ－ｍａｉｌ：　ｚｎｙａｎｇ＠ｓｈｎｕ．ｅｄｕ．ｃｎ．研究报告．拟南芥中一个未知功能蛋白的叶绿体亚细胞定位研究王鹏程１ 王晨１ 米华玲２ 周根余１ 杨仲南１＊（１上海师范大学生命与环境科学学院 上海 ２００２３４）（２中国科学院上海植物生理生态研究所 上海 ２０００３２）摘要 生物信息学分析表明，　模式植物拟南芥叶绿体中含有大约４　０００多种蛋白质，　目前只分离得到１　０００多种，　其他预测的叶绿体蛋白的实验验证对叶绿体功能研究有重要意义。

本文对一个预测的叶绿体未知功能蛋白ＡＴ５Ｇ４８７９０进行了亚细胞定位研究。

我们克隆了该基因５＇端长１７８　ｂｐ的ＤＮＡ片段，　与绿色荧光蛋白（ＧＦＰ）基因构建重组载体ｐＭＯＮ５３０－ｃＴＰ－ＧＦＰ。

转基因植株通过激光共聚焦显微镜观察，　ＧＦＰ只在叶绿体中特异表达。

实验结果表明，　ＡＴ５Ｇ４８７９０的确为叶绿体蛋白。

本实验方法也可用于其他预测的蛋白质的实验验证。

关键词 融合蛋白，　亚细胞定位，　转运肽Study of Subcellular Localization of the Expressed Protein inArabidopsis thalianaＰｅｎｇｃｈｅｎｇ　Ｗａｎｇ１，　Ｃｈｅｎ　Ｗａｎｇ１，　Ｈｕａｌｉｎｇ　Ｍｉ２，　Ｇｅｎｙｕ　Ｚｈｏｕ１，　Ｚｈｏｎｇｎａｎ　Ｙａｎｇ１＊１（Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｌｉｆｅ　ａｎｄ　Ｅｎｖｉｏｎｍｅｎｔ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，　Ｓｈａｎｇｈａｉ　Ｎｏｒｍａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，　Ｓｈａｎｇｈａｉ　２００２３４）２（Ｓｈａｎｇｈａｉ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｅｃｏｌｏｇｙ，　Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，　Ｓｈａｎｇｈａｉ，　２０００３２）Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｈａｓ　ｒｅｖｅａｌｅｄ　ａｂｏｕｔ　４　０００　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｉｎ　ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔｓ；　ｈｏｗｅｖｅｒ，　ｏｎｌｙａｂｏｕｔ　１　０００　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｈａｖｅ　ｂｅｅｎ　ｖａｌｉｄａｔｅｄ．　Ｔｈｕｓ，　ｗｅ　ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ　ａｎ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　ｓｙｓｔｅｍ　ｔｏ　ｖｅｒｉｆｙｐｒｅｄｉｃｔｅｄ　ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ．　Ａｔ５ｇ４８７９０　ｗａｓ　ｐｒｅｄｉｃｔｅｄ　ｔｏ　ｂｅ　ａｎ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｔｈｅ　１７８　ｂｐ　ｓｅｇｍｅｎｔ　ｏｆ　ｔｈｅ　５＇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｆ　ｔｈｉｓ　ｇｅｎｅ　ｗａｓ　ｃｌｏｎｅｄ　ａｎｄ　ｆｕｓｅｄ　ｗｉｔｈ　ＧＦＰ　ｔｏ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ　ａｂｉｎａｒｙ　ｖｅｃｔｏｒ　ｐＭＯＮ５３０－ｃＴＰ－ＧＦＰ　ｆｏｒ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ．　Ｏｎ　ｃｏｎｆｏｃａｌ　ｌａｓｅｒ－ｓｃａｎｎｉｎｇ　ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ，ｇｒｅｅｎ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ｓｉｇｎａｌｓ　ｗｅｒｅ　ｌｏｃａｌｉｚｅｄ　ｉｎ　ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔｓ　ｉｎ　ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｐｌａｎｔｓ．　Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓｓｕｇｇｅｓｔ　ｔｈａｔ　Ａｔ５ｇ４８７９０　ｅｎｃｏｄｅｓ　ａ　ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ．　Ｔｈｉｓ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ　ｃａｎ　ａｌｓｏ　ｂｅ　ｕｓｅｄ　ｔｏ　ｉｎｖｅｓｔｉ－ｇａｔｅ　ｏｔｈｅｒ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｐｒｅｄｉｃｔｅｄ　ｔｏ　ｂｅ　ｌｏｃａｔｅｄ　ｉｎ　ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔｓ　ｉｎ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ．Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ ｆｕｓｉｏｎ　ｐｒｏｔｅｉｎ，　ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ　ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ， ｔｒａｎｓｉｔ　ｐｅｐｔｉｄｅ叶绿体是高等植物以及藻类中的一类重要的细胞器，　由叶绿体膜、类囊体和基质３部分构成，　其主要功能是进行光合作用，　另外还参与氨基酸、脂肪酸的生物合成（Ｍｏｔｏｈａｓｈｉ　ｅｔ　ａｌ．，２００１）。

第1篇一、实验目的1. 掌握拟南芥转基因技术的基本原理和方法。

2. 熟悉转基因操作流程，包括目的基因的克隆、转化、筛选和鉴定等步骤。

3. 了解转基因技术在植物基因功能研究中的应用。

二、实验原理拟南芥（Arabidopsis thaliana）是一种广泛应用的植物模式生物，具有生长周期短、繁殖速度快、基因组序列已完全解析等特点，使其成为研究植物生长发育、基因调控和生物技术的理想材料。

转基因技术是将外源基因导入植物基因组中，使其在植物细胞中表达，从而改变植物性状或赋予其新的功能。

本实验采用农杆菌介导的转基因方法，将目的基因导入拟南芥基因组中。

实验流程包括以下步骤：1. 目的基因的克隆：从基因库或基因组DNA中提取目的基因，通过PCR技术扩增目的基因片段。

2. 载体构建：将目的基因克隆到载体上，如T载体或pBI121载体。

3. 农杆菌转化：将重组载体与农杆菌共培养，使农杆菌感染拟南芥细胞。

4. 植物再生：将感染了重组载体的拟南芥叶片接种到含有抗生素的培养基上，筛选出含有目的基因的转基因植株。

5. 鉴定：通过PCR、Southern blotting等方法对转基因植株进行鉴定。

三、实验材料1. 拟南芥野生型植株（Col-0）2. 农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）菌株E. coli JM1093. 目的基因片段4. T载体或pBI121载体5. PCR试剂、限制性内切酶、DNA连接酶等6. 培养基、抗生素、琼脂糖等四、实验步骤1. 目的基因的克隆：根据目的基因的序列设计引物，进行PCR扩增。

将扩增产物与T载体连接，转化E. coli JM109感受态细胞，筛选阳性克隆。

2. 载体构建：将目的基因克隆到pBI121载体上，进行酶切和连接反应。

将连接产物转化E. coli JM109感受态细胞，筛选阳性克隆。

3. 农杆菌转化：将重组载体与农杆菌共培养，使农杆菌感染拟南芥叶片。

将感染后的叶片接种到含有抗生素的培养基上，筛选出含有目的基因的转基因植株。

一、实验目的本实验旨在通过农杆菌介导法对拟南芥（Arabidopsis thaliana）进行遗传转化，将目的基因导入拟南芥基因组中，并通过筛选和鉴定得到转基因植株。

二、实验材料1. 拟南芥（T0代）植株2. 根癌土壤杆菌（Agrobacterium tumefaciens）GV3101菌株3. 目的基因质粒（含有荧光素酶基因）4. 抗生素：卡那霉素、氯霉素5. 培养基：MS培养基、N6培养基、再生培养基6. 仪器：离心机、PCR仪、荧光显微镜等三、实验方法1. 构建重组表达载体将荧光素酶基因插入到农杆菌转化载体pCAMBIA1300中，构建重组表达载体pC1300-FRT::GUS。

2. 农杆菌转化将重组表达载体转化根癌土壤杆菌GV3101菌株，通过平板划线法筛选阳性克隆。

3. 拟南芥转化将阳性克隆的农杆菌悬浮液与拟南芥（T0代）花序进行蘸花处理，将蘸花后的拟南芥放入MS培养基中培养。

4. 筛选和鉴定在含有卡那霉素的培养基上筛选转基因植株，通过PCR检测和荧光显微镜观察GUS 基因的表达情况，鉴定转基因植株。

5. 再生和繁殖将转基因植株移栽至N6培养基中培养，待植株生长稳定后，收集种子进行繁殖。

四、实验结果1. 构建重组表达载体成功构建了含有荧光素酶基因的重组表达载体pC1300-FRT::GUS。

2. 农杆菌转化通过平板划线法筛选到阳性克隆，表明重组表达载体已成功转化根癌土壤杆菌GV3101菌株。

3. 拟南芥转化蘸花处理后，部分拟南芥植株在含有卡那霉素的培养基上生长，表明转基因植株已成功筛选。

4. 筛选和鉴定通过PCR检测和荧光显微镜观察，发现部分转基因植株GUS基因表达阳性，荧光素酶活性明显。

5. 再生和繁殖将转基因植株移栽至N6培养基中培养，植株生长良好，繁殖成功。

五、实验讨论1. 本实验通过农杆菌介导法成功将荧光素酶基因导入拟南芥基因组中，获得了转基因植株。

2. 在实验过程中，农杆菌转化和拟南芥转化效果良好，表明该实验方法适用于拟南芥遗传转化。

拟南芥高叶绿素荧光突变体的筛选及基因定位拟南芥高叶绿素荧光突变体的筛选及基因定位摘要：拟南芥（Arabidopsis thaliana）作为广泛应用于植物遗传学研究的模式植物，其高叶绿素荧光突变体的筛选和基因定位，对于深入理解植物生长发育和光能利用机制具有重要意义。

本研究通过化学诱变的方法，筛选得到了一批具有高叶绿素荧光的突变体，并通过遗传学分析和基因定位技术，成功地将其突变基因位点进行了精确定位。

进一步的研究表明，这些突变基因在拟南芥的叶绿素合成和光能利用过程中起到重要的调控作用。

1. 引言拟南芥是一种广泛应用于植物遗传学研究的小型模式植物，由于其基因组小、生命周期短、易于培养和遗传转化等特点，成为了研究植物生物学和发育生物学的理想模式。

2. 实验方法本研究采用化学诱变的方法，通过处理拟南芥种子或幼苗，引发基因突变的发生。

随后，对得到的突变体进行高叶绿素荧光筛选。

将荧光强度明显高于野生型的突变体进行收集和保存，以进一步研究其突变基因的特性。

3. 筛选结果经过筛选，我们获得了一批荧光强度较高的突变体。

通过对这些突变体进行高通量测序和遗传学分析，我们成功地将其突变基因位点定位到染色体上的特定区域。

4. 突变基因的特性进一步对这些突变体进行了功能验证和表型分析，发现突变基因在叶绿素的合成和光能利用过程中起到重要的调控作用。

部分突变体表现出叶绿素合成受阻或过度积累的特征，说明突变基因可能是相关代谢途径中的重要调控基因。

5. 基因定位技术本研究采用了CRISPR/Cas9和T-DNA插入等基因定位技术，成功地将突变基因位点精确定位到拟南芥基因组中。

这些定位结果为进一步研究突变基因的功能和调控机制提供了基础。

6. 结论通过化学诱变筛选和基因定位技术，我们成功地获得了一批拟南芥高叶绿素荧光突变体，并将其突变基因的位点进行了定位。

这些突变体对于深入研究植物叶绿素合成和光能利用机制非常重要，为植物生长发育和农作物的遗传改良提供了有力的工具。

第1篇一、实验目的1. 掌握转基因技术的基本原理和操作流程。

2. 学习拟南芥转基因方法，包括农杆菌介导转化和基因枪法。

3. 鉴定转基因植株，并分析其遗传稳定性。

二、实验材料与试剂1. 拟南芥植株（野生型、突变型）2. 农杆菌菌株（如Agrobacterium tumefaciens C58）3. 转基因载体（含目的基因、抗生素抗性基因）4. 培养基、抗生素、除草剂等5. PCR试剂盒、DNA提取试剂盒、DNA测序仪等三、实验方法1. 目的基因克隆：根据目的基因序列设计引物，从基因库中克隆目的基因，并进行测序验证。

2. 构建转基因载体：将目的基因克隆到载体上，并插入抗生素抗性基因作为筛选标记。

3. 农杆菌转化：将转基因载体转化农杆菌，制备转化介质。

4. 转基因植株的筛选：将转化介质喷洒或浸泡拟南芥植株，筛选出转基因植株。

5. PCR检测：提取转基因植株DNA，进行PCR扩增，检测目的基因是否成功插入。

6. 转基因植株的遗传稳定性分析：通过自交、回交等手段，分析转基因植株的遗传稳定性。

四、实验结果与分析1. 目的基因克隆：成功克隆目的基因，并进行测序验证。

2. 构建转基因载体：成功构建转基因载体，并插入抗生素抗性基因。

3. 农杆菌转化：成功转化农杆菌，制备转化介质。

4. 转基因植株的筛选：通过喷洒或浸泡转化介质，成功筛选出转基因植株。

5. PCR检测：提取转基因植株DNA，进行PCR扩增，成功检测到目的基因。

6. 转基因植株的遗传稳定性分析：通过自交、回交等手段，分析转基因植株的遗传稳定性，结果表明转基因植株遗传稳定性良好。

五、实验讨论1. 农杆菌转化法是一种常用的植物转基因方法，具有操作简便、转化效率高等优点。

2. 在转基因过程中，抗生素抗性基因作为筛选标记，可以有效筛选出转基因植株。

3. PCR检测是鉴定转基因植株的重要手段，可以快速、准确地检测目的基因是否成功插入。

4. 遗传稳定性分析是评估转基因植株遗传特性的重要环节，有助于确保转基因植物的安全性。

gfp 实验步骤GFP实验步骤GFP（绿色荧光蛋白）是一种广泛应用于生物学研究中的荧光标记物质，它可以通过荧光显微镜观察到其在细胞或组织中的分布情况。

下面将介绍GFP实验的步骤。

1. GFP基因的克隆需要将GFP基因克隆到感兴趣的载体中。

通常，可以使用限制性内切酶对GFP基因和载体进行酶切，并通过连接酶将两者连接在一起。

连接后的重组载体可以通过大肠杆菌的转化来复制。

2. 细胞培养接下来，将含有重组载体的大肠杆菌进行培养，以扩增GFP基因。

培养条件要求适当的温度和培养基。

当细菌生长到一定程度时，可以进行提取。

3. GFP的纯化提取细菌后，需要进行GFP的纯化。

纯化步骤可以使用亲和层析、离心、电泳等方法。

通过这些步骤，可以得到高纯度的GFP。

4. GFP的表达将纯化后的GFP溶液加入到感兴趣的细胞中，使其表达GFP。

可以通过转染、转化等方法将GFP引入到细胞中。

在细胞培养的过程中，可以观察到GFP表达的情况。

5. 荧光显微镜观察使用荧光显微镜观察GFP在细胞中的分布情况。

荧光显微镜可以通过激发光源激发GFP发出的绿色荧光，并通过镜头观察到荧光现象。

可以通过调节显微镜的对焦、放大倍数等参数来观察GFP的细节。

6. 数据分析观察到GFP的荧光后，可以进行数据分析。

可以计算GFP的表达量、观察GFP在细胞中的定位、动力学等。

通过数据分析，可以得到关于GFP在细胞中的信息。

7. 应用GFP广泛应用于生物学研究中。

例如，在细胞生物学中，可以利用GFP标记蛋白质、细胞器等，观察它们在细胞中的动态变化；在遗传学研究中，可以利用GFP标记基因，观察其在不同组织中的表达情况。

总结：GFP实验的步骤包括GFP基因的克隆、细胞培养、GFP的纯化、GFP的表达、荧光显微镜观察、数据分析和应用。

通过这些步骤，可以获得GFP在生物体内的相关信息，为生物学研究提供重要的实验手段。

GFP作为一种荧光标记物质，在生物学研究中具有广泛的应用前景。

拟南芥SPM12基因GFP载体构建及转基因植株筛选方雪;徐洁娜;孟杏楠;曹树青;樊婷婷【摘要】[Objective] To further study the function of the SPM12 gene, the SPM12 gene GFP vector and its transgenic plants were constructed by wild-type Arabidopsis thaliana with genetic background in Columbia (Columbia, Col). [Method] The full-length CDS sequence of SPM12 gene was amplified by PCR from the cDNA template which was reverse transcription from the RNA of wild-type Arabidopsis thaliana, and ligated it with the plasmid of GFP vector; then transformed the recombinant plasmid which was successfully constructed into the cells of E. coli DH5α, picked the positive colonies and identified it by PCR, and then transformed its plasmid into the competent cells of Agrobacterium GV3101, the positive colonies were identified by PCR, then it was transferred into wild-type Arabidopsis thaliana through inflorescence-infiltrated method. After receiving the seeds, the positive plants were screened by selective medium with resistance. [Result] The CDS fragment of SPM12 gene and SPM12-GFP recombinant plasmid was obtained, the vector of SPM12-GFP and its transgenic plant was got. [Conclusion] The transgenic plants SPM12-GFP in Arabidopsis thaliana were successfully obtained, which laid a foundation for further study of the function and molecular mechanism of SPM12 gene in Arabidopsis thaliana.%[目的]为了进一步研究SPM12基因的功能, 利用哥伦比亚 (Columbia, Col) 遗传背景的野生型拟南芥材料构建SPM12基因GFP载体及其转基因植株.[方法]以野生型拟南芥的RNA反转录成的cDNA为模板, PCR扩增出SPM12基因的CDS全长序列, 将其连接到GFP载体的质粒上;然后将构建成功的重组质粒转化到大肠杆菌DH5α受态细胞中, 挑取阳性菌落经PCR鉴定并测序后, 将其质粒转入农杆菌GV3101感受态细胞中.PCR鉴定出阳性菌落后, 通过浸花法将其转入野生型拟南芥植株中.收种子后, 使用带有抗性的选择性培养基筛选出阳性植株.[结果]通过SPM12基因CDS片段和SPM12-GFP重组质粒的获得, 构建了SPM12-GFP载体和其转基因植株.[结论]成功获得拟南芥SPM12-GFP转基因植株, 为进一步研究拟南芥SPM12基因的功能与分子机制奠定了基础.【期刊名称】《安徽农业科学》【年(卷),期】2019(047)002【总页数】3页(P86-88)【关键词】拟南芥;SPM12;载体;GFP转基因植株【作者】方雪;徐洁娜;孟杏楠;曹树青;樊婷婷【作者单位】合肥工业大学食品与生物工程学院, 安徽合肥 230009;合肥工业大学食品与生物工程学院, 安徽合肥 230009;合肥工业大学食品与生物工程学院, 安徽合肥 230009;合肥工业大学食品与生物工程学院, 安徽合肥 230009;合肥工业大学食品与生物工程学院, 安徽合肥 230009【正文语种】中文【中图分类】Q939.9植物在其自然栖息地中经常面临过多的非生物和生物胁迫。

GFP转基因拟南芥的培养及荧光观察实验原理：1.GFP报告基因全称为绿色荧光蛋白（Green fluorescent protein，GFP），简称GFP，20世纪60年代在水母中发现的发光蛋白。

由238氨基酸组成的单链多肽，在蓝光或紫外光激发下发出绿色荧光，用于蛋白质在活细胞中的准确定位及动态变化观察（分泌蛋白的分选、亚细胞定位）2.目的基因MAP65-1，是一种微管结合蛋白，可以根据拟南芥叶片表皮细胞、保卫细胞，下胚轴和根部细胞中微管骨架的分布情况来推断目的基因是否存在。

3.表达载体：⏹植物表达载体的构建→导入农杆菌自我复制→浸染花粉转入拟南芥；⏹卡那霉素抗性培养基筛选，⏹卡那霉素:抗生素影响植物细胞叶绿体和线粒体的蛋白合成,引起植株黄化死亡.⏹卡那霉素能对转基因植物进行筛选实质上是通过卡那霉素抗性基因起作用的。

转基因植物由于含有卡那霉素抗性基因而抑制了卡那霉素的作用，所以通过卡那霉素,转化体就很容易从非转化体中筛选出来。

GFP转基因植株野生型植株GFP转基因植株转基因植株1/2MS培养基1/2MS卡那抗性培养基实验材料：GFP转基因拟南芥种子及野生型种子；1/2MS培养基；1/2MS卡那抗性培养基；75％乙醇；10％NaClO；无菌水。

实验步骤：1.种子春化（加蒸馏水放入4℃冰箱中过夜）；2.75％乙醇消毒1min（混匀，尽量将液体吸净，动作要快）；3.10％NaClO消毒10min （混匀，尽量将液体吸净，动作要快）；4. 无菌水洗三遍，用牙签将种子点在培养基表面（每皿4-5颗种子尽量均匀）；5.封膜，做好标记，平放于培养架上培养。

实验结果：黄化正常拟南芥下胚轴的叶绿体从数量和正常黄化苗在叶肉细胞和保卫细胞中，转基因拟南芥观察到绿色荧光标记，但在野生型中未观测到该少等长势不优良的现象，是因为野生型不存在卡那抗性基因，而转基因植株存在卡那抗性基因，所以可以将转基因植株在卡那抗性培养基中筛选出来；在转基因拟南芥中，荧光标记在不同位置亮度效果不同，我们认为可能是与不同位置微管分布情况和微管结合蛋白对不同位置的结合效果不同有关。

绿色荧光蛋白转入拟南芥愈伤组织引言：拟南芥(Arabidopsis thaliana)属于十字花科，与甘蓝、白菜和油菜同科。

由于拟南芥具有植株很小(株高约15 Cllfl)、生活周期很短(42～56 d)、种子丰富(每株3000粒以上)、易于繁殖和人工诱变等优点，早在1943年它就被选为模式植物进行研究；1980年公布了它的遗传图谱；1997年公布了拟南芥线粒体基因组，这是有花植物中第1个完整的线粒体基因组分析；2000年拟南芥国际合作组织完成了其核基因组全长测定，是迄今唯一完成全部基因组序列测定的植物。

拟南芥在植物进化中处于相当高的位置，在拟南芥中发现的一些重要调节基因都能在其他植物中找到它们的同源基因。

因此，如果从比较容易的拟南芥人手，获得的基因研究成果可以更容易地向农作物转化，表现出可观的经济效益。

绿色荧光蛋白（GFP）最早是由Shimomura等[1]从多管水母中分离出来的一种荧光蛋白。

主要存在与水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内。

其特点在于发光无需底物或辅助因子，其发光的主要原因是因为其独特的一级结构[2]。

GFP作为一种报告基因还具有无种属特异性、分子量小、容易与其他蛋白形成融合蛋白、不损害细胞、易检测、可用于活体观察等特点[3]。

本实验就是利用了其荧光和活体检测的优点对转化效率进行评测。

目前有关于GFP的研究多见于其在细胞中的瞬时表达[4,5]，但是它本身的发光是依赖于其特有的氨基酸序列，而且很容易和其他蛋白进行融合表达，因此可以将GFP蛋白和目的蛋白进行融合表达，通过荧光显微镜对目的蛋白在细胞或组织中的表达情况进行直接观察。

这种方法相与传统的免疫荧光方法相比可以直接进行活体观察，且样品处理及观察更加简便。

一、实验原理1.培养拟南芥愈伤组织1.1配制培养基时，为了使用方便和用量准确，通常采用母液法进行配制，即将所选培养基配方中各试剂的用量，扩大若干倍后再准确称量，分别先配制成一系列的母液置于冰箱中保存，使用时按比例吸取母液进行稀释配制即可。