神奇的转基因荧光生物

AI14转基因小鼠是通过基因工程技术将人类基因或突变基因导入小鼠胚胎中，使其成为转基因小鼠。

该转基因小鼠带有荧光标记，可以发出绿色荧光，便于研究人员直观地观察和研究小鼠体内特定细胞类型的活动。

AI14转基因小鼠的主要基因改造是在葡萄糖激活的胰岛素样生长因子2（IGF2）基因上插入了一个荧光蛋白基因。

这个荧光蛋白基因能够产生一种绿色荧光蛋白，使得转基因小鼠的细胞和组织能够发出绿色荧光。

这个基因改造使得研究人员能够直观地观察和研究小鼠体内特定细胞类型的活动，特别是神经元的活动。

AI14转基因小鼠的荧光标记基因是由一个启动子控制的，这个启动子是人类神经元特异性磷酸酶碱性酶（NSE）基因的启动子。

这意味着，只有表达了NSE基因的细胞才会产生荧光蛋白。

NSE基因主要在神经元中高表达，因此AI14转基因小鼠的神经元会发出明亮的绿色荧光。

这种标记可以帮助科学家更容易地追踪和研究小鼠的神经元活动和连接情况。

因此，AI14转基因小鼠是一种重要的实验动物模型，为科学家们研究人类疾病和基因功能提供了有力的工具。

它们不仅可以用于研究神经元的功能和行为，还可以用于研究其他疾病的发生和发展机制，以及测试新药物的疗效和安全性。

以上信息仅供参考，如需了解更多信息，请查阅相关书籍或咨询专业人士。

十大神奇转基因动物荧光鼠蜘蛛羊•我们所有人都听说过蜘蛛侠，但是你听过蜘蛛山羊吗？这种转基因山羊是独一无二的，因为它们能产生普通的蜘蛛丝。

这种构成蜘蛛网的同样物质由它们的乳腺产生。

抗癌老鼠•这些老鼠内产生的一种蛋白质是未来疗法的关键，它能消灭肿瘤细胞，却不会伤害体内的健康组织。

通常情况下，一般的癌症治疗会使患者出现疼痛、恶心和掉头发等情况。

科学家们希望有朝一日把这种蛋白质用于癌症患者身上，使他们摆脱这些痛苦。

翡翠海参•翡翠海参看起来更像一片树叶，而不是黏滑的腹足软体动物，但它却是已知第一种在自然演化过程中发生转基因现象的物种。

这种生物令很多科学家大惑不解。

就像缅因大学的玛丽-朗波发现，它们居然能够利用水藻食物中的叶绿体进行光合作用以产生能量。

没有任何其他动物能够这样利用叶绿体。

荧光鱼•斑马鱼是一种常见的观赏鱼，身上有黑白相间的条纹。

荧光斑马鱼被分别转入了水母绿色荧光蛋白或者珊瑚虫红色荧光蛋白的基因，在紫外线的照射下，能够发出绿光或红光。

荧光鱼作为观赏鱼在市场上销售，是第一种上市的转基因动物。

转基因蚊子•伦敦帝国学院的科研小组培育了一种转基因蚊子，其中的雄性具有荧光睾丸，很容易被识别，然后令其不育。

研究者称，可以将大量这样的转基因蚊子放到野外与普通的雌蚊交配，减少疟蚊的产卵量，从而慢慢减少疟蚊的数目。

这种转基因蚊子没有生育能力，所以不会将基因遗传给野生蚊子。

超级老鼠•一种超级老鼠可以不知疲倦地奔跑数小时、寿命更长、拥有更强繁殖能力、吃得更多而不增加体重……美国科学家培育出的这种转基因老鼠震撼了世界.超级老鼠主要利用脂肪转化能量，体内只产生非常微量的乳酸，这种老鼠不吃不喝最多能连续不间断奔跑5个小时甚至更多。

科学家说，这相当于一个人不间断地高速骑自行车翻越阿尔卑斯山，只有人类顶级运动员可以做到，比如环法自行车赛七冠王兰斯-阿姆斯特朗。

产药的小鸡•曾培育出世界上第一只克隆羊“多利”的英国罗斯林研究所，近日又取得了一项重大的科学突破：该研究所的科学家成功培育出世界上第一批能下“神奇鸡蛋”的小鸡。

1、转基因超级鼠：向生物体的基因组转移（或植入）外源基因的过程，叫转基因。

一般都认为，成功的转基因工作是从1981年开始的。

1982年，英国的《自然》杂志发表了一篇文章，两个美国实验小组共同研制出转基因超级鼠。

2、转基因鲤鱼：中科院水生生物研究所鱼类转基因工程组的科学家们，在朱作言院士的领导下，将草鱼的生长激素基因注入鲤鱼的受精卵，培育出一种带有草鱼生长激素基因的转基因鲤鱼F1代和另一种具有草鱼生长激素基因的转基因三倍体鲤鱼“吉鲤”。

3、转基因山羊：中国首例转基因山羊“连连”、“田田”和“云云”于2000年12月25日精彩亮相，为外人所知。

它们的身上都转有人的od-抗胰蛋白酶基因。

它们产出的羊奶可以提取出al-抗胰蛋白酶。

4、转基因奶牛：它是一种转基因动物，是科学家通过转基因技术对奶牛胚胎进行基因改造，从而达到预期效果的奶牛品种。

斑马鱼是荧光探针用于分子成像的理想脊椎动物模型Sung-Kyun Ko,a Xiaoqiang Chen,bc Juyoung Yoon*b and Injae Shin*a1.引言分子成像技术能可视化细胞、组织和器官中的（生物）分子和离子，从而得到有关目标分子的生物学信息及其生物功能。

荧光探针如有机染料、荧光蛋白和量子点等已经成为分子成像的重要工具，是因其具有灵敏度高，操作简单，不需要复杂精密的仪器设备等优点1-8。

事实上，荧光探针除了因灵敏度高和选择性好而用于监测生物分子和与生命活动相关的物种外，还广泛用于以时空检测的方式来探测各种生命活动。

在目前大多数情况下，将荧光探针应用于分子成像还处在细胞实验阶段。

然而，对活细胞内的作用对象的成像并不能完全反映出作用目标关于生物功能的全部信息。

与之对比的是，对活体动物的荧光成像能提供更为全面的生物功能信息。

此外，利用与人体具有基因相近的有机体作为载体来研究目标分子生物功能的荧光成像已愈来愈引起人们的关注（图1）。

小鼠是一个较好的动物模型，但对其活体成像需要专业性要求较高的技术和复杂的操作。

而斑马鱼（Danio rerio）已经被证明是一个极有价值的动物模型9。

事实上，斑马鱼用于活体成像有许多优点。

其一，来源简单，无论幼年斑马鱼或成年斑马鱼均能方便获得。

其二，斑马鱼在培育的初期是光透明的，这极大地方便了光学成像技术的运用。

其三，斑马鱼的受精属于体外受精，这使得我们可以方便的观察胚胎发育的各个时期的荧光成像。

此外，斑马鱼与哺乳类动物具有高度的同源性。

基于上述特征，以斑马鱼作模型得到的实验结果可以间接了解目标分子在高级动物中的生物功能。

但是，需要注意的是，由于斑马鱼与哺乳动物毕竟在很大程度上是两类不同的物种，所以由斑马鱼得到的实验结果来外推得到的在哺乳动物上的结果不一定完全可靠。

例如，虽然斑马鱼与哺乳动物在基因上有相似性，但两者在换气和呼吸功能上却截然不同。

高中生物荧光标记法的例子
荧光标记法在教材中的例子有很多，例如：人教版必修2“基因是有遗传效应的DNA片段”中，在鼠的DNA分子上联接一个取自于海蜇的绿色荧光蛋白的基因，使转基因小白鼠在紫外线的照射下能够发出绿色的荧光，从而可以说明基因与DNA的关系；还有人教版必修2中“基因在染色体上”提及的，把一个特定DNA分子与染色体上某一个特定的基因相互结合，而这个DNA分子又能被带有荧光标记的物质所识别，通过荧光显示，就可以确切的知道基因在染色体上的位置。

同样同位素标记法可以引入的例子有：人教版必修2“噬菌体侵染细菌的实验”中用35S和32P分别标记噬菌体外壳和DNA、人教版选修3“DNA分子杂交技术”中用放射性同位素32P标记的探针进行目的基因的检测等等。

通过这样的比较学习，稍加巩固后学生可以清楚地掌握荧光标记法和同位素标记法的概念、原理、应用等。

课堂设计是教学过程中一个重要阶段，需要仔细捋清知识点逻辑关系，从易至难，逐步引导学生去学习和掌握。

对待不同的学生需要对症下药，让他们各自的学习优势发挥出来，弥补不足的地方。

十大转基因动物
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本文概述：通过转基因技术，将其他动物的基因注入某种动物的DNA之内，各种神奇古怪的动物便纷纷涌现。

科学家创造出所谓的“转基因动物”来研究疾病治疗、制造自然物质和拓展科研领域。

那么十大转基因动物是什么呢？小编会告诉您答案。

科学家创造出所谓的“转基因动物”来研究疾病治疗、制造自然物质和拓展科研领域。

那么十大转基因动物是什么呢?动物转基因有害吗?小编会告诉您答案。

十大转基因动物是：荧光鼠、蜘蛛羊、抗癌老鼠、翡翠海参、荧光鱼、转基因蚊子、超级老鼠、产药的小鸡、无所畏惧的老鼠、有利于改善环境的基因猪。

下面我将转基因动物可能存在的危害分两个方面概括：1.转基因动物对人体的危害;2.转基因动物对生态环境的危害。

转基因动物对人体的危害包括以下四个方面：
一、毒性问题
基因化食品能产生不可预见的生物突变，会在食品中产生较高水平和新的毒素。

Losey,J.E.等报道，在一种植物马利筋叶片上撒有转基因Bt玉米花粉后，普累克西普斑蝶食用叶片就少，长得慢，4天的幼虫的死亡率44%。

而对照组(饲喂不撒。

生物发光及其在分子植物育种中的应用生物发光及其在分子植物育种中的应用引言：生物发光是一种神奇的现象，广泛存在于自然界中的许多生物体中，如萤火虫、火鸟和水母等。

生物发光现象的发现和研究对于深入了解生物体的发育和生理过程具有重要意义。

在分子植物育种领域中，利用生物发光技术可以实现对植物基因的追踪和表达，进而加速育种过程，提高植物品质和抗逆能力。

本文将着重探讨生物发光的基本原理、在植物育种中的应用以及未来的发展方向。

一、生物发光的基本原理生物发光是一种称为生物发光反应（bioluminescence）的化学过程。

该过程需要特定的底物和催化剂，通常为一种生物发光蛋白（bioluminescent protein）和一种可观察的荧光底物。

这种荧光底物通常是一种称为荧光色素（luciferin）的有机物，而生物发光蛋白则可以是一种称为荧光酶（luciferase）的酶。

在生物发光反应中，荧光底物与荧光酶催化下发生氧化反应，产生光能。

这一催化过程通常需要供能分子（例如三磷酸腺苷，ATP）和辅助因子（例如二氧化硫，O2）。

荧光色素和荧光酶的结合形式各异，不同生物体中的生物发光反应机制也有所不同。

二、生物发光在植物育种中的应用2.1 基因追踪和表达利用生物发光技术，研究人员可以将荧光酶基因转入目标植物的基因组中，实现对目标基因的追踪和表达。

这种基因追踪和表达方案广泛应用于研究植物发育、代谢途径和抗病性等方面。

通过将荧光酶基因与目标基因共转入植物，研究人员可以实现对目标基因的追踪和定位，揭示植物的发育轨迹和代谢通路。

2.2 高通量筛选生物发光技术还可以用于植物杂交种群的高通量筛选。

通过将荧光酶基因与目标基因组成的转基因植物进行自交或杂交，可以筛选出具有特定基因型的后代植株。

通过检测后代植株产生的荧光信号，可以快速、高效地筛选出目标基因型，加速育种进程。

2.3 抗逆性筛选生物发光技术还可以应用于植物对逆境的抗性筛选。

[宝典]转基因斑马鱼构建与果蝇幼虫荧光基因的瞬时表达打印版转基因斑马鱼构建与果蝇幼虫荧光基因的瞬时表达蒋驭天(生命科学学院 2008级生物技术 2008300113)同组人:王诗婕吕晓霞刘楚怡一.摘要:本实验对斑马鱼和果蝇幼虫分别导入含EGFP和DFP的质粒，观察其在2中动物体内的表达情况，在斑马鱼体内，绿色荧光蛋白从原肠胚到出苗期均能在荧光显微镜下观察的绿色荧光;在果蝇幼虫体内，才3-4小时时也能观察到红色荧光蛋白基因的瞬时表达。

关键字:转基因斑马鱼果蝇幼虫二.实验器材与试剂:仪器:试管、试管架、可调式微量加样器、电泳仪、电泳槽、染色缸;42?恒温水浴箱、冰浴、恒温振荡箱，超净工作台、手动显微注射器、体式显微镜，硼硅酸玻璃毛细管、倒置显微镜、摄像系统(CCD)、自动水循环系统一套，孵化水槽、培养皿、解剖镜、小规模质粒提取试剂盒。

试剂:EGFP绿色荧光蛋白基因 DFP红色荧光蛋白基因 pEGFP-N2载体 E coli三.实验步骤:转基因斑马鱼构建:1.转染细菌的培养(1)培养基的制备:称取胰蛋白胨3 g，酵母提取物1.5g，NaCl 3g，于一500 mL的三角瓶中，加入蒸馏水至300 mL溶解.若配制固体培养基，则需加入4.5 g 琼脂(1.5%)，然后用NaOH调pH至7.5。

分装于3个250 mL的三角瓶中，加塞，包扎。

(2)培养基的灭菌与消毒: 在灭菌锅中，加入适当的水，放入已包扎好的培养基，盖好盖子，加热。

当压力升至0.05 MPa时，打开放汽阀，排除冷空气，当压力回到0时，关闭放汽阀，当压力升至1.034 MPa时保持15-30分钟后，停止加热，压力降为0时，打开放汽阀排汽取物。

(3)含Amp的LB固体培养基:将配好的LB固体培养基高压灭菌后冷却至60?左右，加入Amp(氨苄青霉素)储存液,使终浓度为50 μg/mL,摇匀后铺板。

(4)接种加甘油保存的分别含质粒的E coli.，每管接种体积为10 微升(5)37 ?摇床过夜培养24h.2.质粒的小量提取提取步骤:(1). 样本处理:收集已培养12,16 小时的菌液13ml，12000rpm 离心1 分钟，尽量吸除上清。

红色荧光小鼠（mCherry转基因小鼠）介绍
GFP小鼠作为一种工具小鼠，已经成为再生、发育、免疫(肿瘤免疫、移植免疫和免疫系统相互作用机制等)、细胞生物学等研究必不可少的实验材料，广泛地应用于生物学的各个领域。

C57BL/6小鼠为生物医学研究中最常用的小鼠品系之一。

GFP融合蛋白前为beta-Actin启动子，表达方式为全身表达，除红细胞和毛发外，其余细胞可以直接在激发光下看到荧光。

小鼠表皮发绿，自然光下也可看到。

红色荧光小鼠(mCherry转基因小鼠）
mCherry转基因小鼠是一种红色荧光工具鼠。

该小鼠用CAG启动子驱动mCherry编码序列在小鼠过表达体内过表达，在激光下可以观察到荧光。

可用于再生、发育、免疫(肿瘤免疫、移植免疫和免疫系统相互作用机制等)、细胞生物学等方面的研究。

荧光鼠的概念荧光鼠是一种通过基因工程技术而产生的特殊鼠类，它们具有发出荧光的能力。

荧光鼠的概念源于20世纪80年代，当时科学家发现了一种发光蛋白质，被称为绿色荧光蛋白（Green Fluorescent Protein, GFP），这种蛋白质能够发出绿色的荧光。

后来，科学家们成功地将这个基因导入了小鼠的基因组中，从而培育出了第一只荧光鼠。

荧光鼠的发光原理是通过绿色荧光蛋白质的基因在小鼠的细胞中表达产生的。

在细胞中，这个基因会被转录成mRNA，然后被翻译成具有荧光特性的蛋白质。

这种荧光蛋白质可以发出绿色的光，并且在体内的组织、器官和细胞中都可以观察到。

荧光鼠的出现对于生命科学研究具有重要的意义。

首先，荧光鼠能够提供实时、非侵入性的观察动物活体细胞和组织的能力。

传统的研究方法通常需要对动物进行献身性研究，而荧光鼠可以直接观察到生物过程的发生和发展，避免了传统研究方法的种种限制。

其次，荧光鼠也被广泛应用于遗传学研究。

通过将不同的荧光基因导入小鼠体内，科学家可以观察到这些基因在不同组织和器官中的表达情况。

荧光鼠为研究基因表达的时空调控提供了有力的工具，有助于揭示基因调控网络的机制。

荧光鼠的利用还扩展到了其他领域。

在医学上，荧光鼠被用作疾病研究的模型动物。

通过将与疾病相关的基因导入荧光鼠体内，科学家可以观察到这些基因在疾病发展过程中的表达和变化。

这有助于深入理解疾病的发生机制，并为药物开发提供了新的思路。

除了科学研究，荧光鼠还在教育和艺术等方面发挥作用。

荧光鼠的存在使得许多复杂的科学概念和原理可以通过直观的方式向公众传达。

同时，荧光鼠也成为了艺术作品的创作对象，通过将其放置在不同的环境中，艺术家们创造出了许多有趣的作品。

然而，荧光鼠的出现也引发了一些伦理和道德的争议。

有人认为荧光鼠的制造过程涉及到动物的基因改造和操控，违背了动物的自然状态。

此外，荧光鼠的商业化也引发了一些担忧，人们担心它们会被用于不道德的目的，比如生产荧光宠物。

转基因动物实例1，透明的金鱼鱼有许多不同的类型和种类，每一种鱼可能都有其独特之处，但只有极少数的鱼，通过自然进化，可以看到它们透明的形态。

在我们的印象中，金鱼是一种美丽而又神秘的生物，它拥有迷人的外形，鲜艳的色彩以及令人着迷的身体结构。

因此，人们对其进行着各种研究。

金鱼就是其中之一。

但这种鱼并没有将金鱼种类列入其中。

为此，日本科学家想到了制作金鱼透视的方法，并取得了成功。

日本三重大学和名古屋大学制作了这些透明金鱼。

肉眼观察，由于鳞片和皮肤没有色素，可以直接看到金鱼的心脏等器官。

2.环保猪从外在的角度看，猪为地球人类所做的肉类是吃得最多的，显得过于平凡，根本无法造成危害。

但事实上，猪并不是一个简单的生物个体，它也有一些特殊之处：例如，它们可以利用粪便来进行发电；而且它们还能通过排泄粪便中的某些物质来获得能量。

但是这种认识并不正确，特别是由于其体内存在一种潜在的危险化学物质——磷。

这种反应是猪消化食物后自然产生的，在排便后释放到世界各地。

如果植物中的营养成分过多，就会成为污染物，多余的就可能流入溪流和湖泊。

而如果这些营养物质被动物吸收后再用来喂养牲畜，那么就有可能导致严重的后果。

目前，人类面临着这样一个难题：如何让动物吃到更多营养丰富的食物呢？因此，科学家们不得不为这一问题而努力，而环保猪正是为此而培养起来的。

经过特殊培育后，环保猪排粪含磷量明显降低。

3，转基因荧光鱼转基因荧光鱼的产生并非偶然。

科学家们希望鱼能发出特殊色彩的光，并从种类角度出发，利用水母中提取的荧光蛋白使斑马鱼发光，于是转基因荧光鱼应运而生。

按照计划，它们的确闪烁着许多色彩。

比如蓝色、红色和黄色等等。

这些颜色看起来都非常可爱，而且很有创意，让人爱不释手。

这也是为什么很多人愿意购买一些颜色鲜艳的鱼的原因所在。

但是，这样的人类造物不适合在自然环境下生存，鲜艳的色彩使其更容易被掠食者杀死。

因为，这些东西是买给宠物的。

㊀山东农业科学㊀２０２４ꎬ５６(４):１~８ＳｈａｎｄｏｎｇＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ㊀ＤＯＩ:１０.１４０８３/ｊ.ｉｓｓｎ.１００１－４９４２.２０２４.０４.００１收稿日期:２０２３－０４－２１基金项目:国家重点研发计划项目(２０２２ＹＦＤ１２００５００)ꎻ国家大宗蔬菜产业技术体系项目(ＣＡＲＳ－２３－Ａ０６)ꎻ国家自然科学基金项目(３１８７２９４９)作者简介:章力(１９９５ )ꎬ女ꎬ博士研究生ꎬ研究方向为番茄遗传育种ꎮＥ－ｍａｉｌ:９８７７２５９９９＠ｑｑ.ｃｏｍ通信作者:黄泽军(１９７４ )ꎬ男ꎬ湖南郴州人ꎬ研究员ꎬ博士生导师ꎬ研究方向为番茄遗传育种ꎮＥ－ｍａｉｌ:ｈｕａｎｇｚｅｊｕｎ＠ｃａａｓ.ｃｎ利用种子红色荧光标记鉴定转基因番茄后代章力１ꎬ２ꎬ魏凯１ꎬ２ꎬ李珊珊１ꎬ宁宇１ꎬ路菲菲１ꎬ王孝宣１ꎬ国艳梅１ꎬ刘磊１ꎬ李鑫１ꎬ杜永臣１ꎬ李君明１ꎬ黄泽军１(１.中国农业科学院蔬菜花卉研究所/蔬菜生物育种全国重点实验室ꎬ北京㊀１０００８１ꎻ２.中国农业大学园艺学院ꎬ北京㊀１０００８１)㊀㊀摘要:转基因技术有助于番茄基因功能研究和遗传改良ꎬ其中转基因后代的筛选是一个非常重要但工作量大的环节ꎮ本研究基于番茄油体蛋白基因家族序列分析和番茄基因表达数据库ＳＧＮ－ＴＥＡ搜索结果ꎬ克隆了一个种子特异且高水平表达的油体蛋白基因ＳｌＯＬＥ１(Ｓｏｌｙｃ０６ｇ０３４０４０)ꎮ利用无缝克隆的方法将红色荧光蛋白基因ＴａｇＲＦＰ的编码区序列插入到ＳｌＯＬＥ１基因的终止密码子前ꎬ形成一个嵌合基因ＳｌＯＬＥ１－ＴａｇＲＦＰꎮ将嵌合基因插入到ｐＢＩ１２１双元载体ꎬ构建植物表达载体ｐＳｌＯＬＥ１－ＴａｇＲＦＰꎬ利用农杆菌介导法转化番茄品种 ＭｏｎｅｙＭａｋｅｒ ꎬＴ０代植株的自交种子在荧光显微镜下呈现出明亮红色荧光或无荧光ꎮＰＣＲ分子标记进一步验证发现ꎬ红色荧光种子萌发的幼苗均存在ＴａｇＲＦＰ序列ꎬ表明在种子阶段检测红色荧光筛选转基因番茄后代的准确率为１００％ꎮ由此ꎬ本研究建立了一种利用ＳｌＯＬＥ１－ＴａｇＲＦＰ嵌合基因ꎬ可以通过种子红色荧光可视化分析ꎬ简单快速㊁低成本地鉴定转基因番茄后代的方法ꎮ关键词:番茄ꎻ种子ꎻ红色荧光蛋白ꎻ油体蛋白ꎻ转基因鉴定中图分类号:Ｓ６４１.２:Ｑ７８１㊀㊀文献标识号:Ａ㊀㊀文章编号:１００１－４９４２(２０２４)０４－０００１－０８ＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＴｏｍａｔｏＴｒａｎｓｇｅｎｉｃＯｆｆｓｐｒｉｎｇｗｉｔｈＲｅｄＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅＭａｒｋｅｒｏｆＳｅｅｄｓＺｈａｎｇＬｉ１ꎬ２ꎬＷｅｉＫａｉ１ꎬ２ꎬＬｉＳｈａｎｓｈａｎ１ꎬＮｉｎｇＹｕ１ꎬＬｕＦｅｉｆｅｉ１ꎬＷａｎｇＸｉａｏｘｕａｎ１ꎬＧｕｏＹａｎｍｅｉ１ꎬＬｉｕＬｅｉ１ꎬＬｉＸｉｎ１ꎬＤｕＹｏｎｇｃｈｅｎ１ꎬＬｉＪｕｎｍｉｎｇ１ꎬＨｕａｎｇＺｅｊｕｎ１(１.ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＶｅｇｅｔａｂｌｅｓａｎｄＦｌｏｗｅｒｓꎬＣｈｉｎｅｓｅＡｃａｄｅｍｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ/ＳｔａｔｅＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＶｅｇｅｔａｂｌｅＢｉｏｂｒｅｅｄｉｎｇꎬＢｅｉｊｉｎｇ１０００８１ꎬＣｈｉｎａꎻ２.ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＨｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒｅꎬＣｈｉｎａＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬＢｅｉｊｉｎｇ１０００８１ꎬＣｈｉｎａ)Ａｂｓｔｒａｃｔ㊀Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｈａｓｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｄｔｏｇｅｎｅｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｓｔｕｄｉｅｓａｎｄｇｅｎｅｔｉｃｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔｏｆｔｏｍａｔｏ.Ｔｈｅｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｏｆｆｓｐｒｉｎｇｉｓａｃｏｓｔ/ｌａｂｏｒ￣ｉｎｔｅｎｓｉｖｅａｎｄｔｉｍｅ￣ｃｏｎｓｕｍｉｎｇｐｒｏｃｅｓｓ.Ｗｅｃｌｏｎｅｄａｓｅｅｄ￣ｓｐｅｃｉｆｉｃａｎｄｈｉｇｈｌｙｅｘｐｒｅｓｓｅｄｏｌｅｏｓｉｎｇｅｎｅＳｌＯＬＥ１(Ｓｏｌｙｃ０６ｇ０３４０４０)ａｃｃｏｒｄｉｎｇｔｏｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｏｆｓｅｑｕｅｎｃｅａｎａｌｙｓｉｓｏｆｔｏｍａｔｏｏｌｅｏｓｉｎｇｅｎｅｆａｍｉｌｙａｎｄａｓｅａｒｃｈｉｎｔｈｅｔｏｍａｔｏｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｄａｔａｂａｓｅＳＧＮ￣ＴＥＡ.ＴｈｅｃｏｄｉｎｇｒｅｇｉｏｎｏｆｔｈｅｒｅｄｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎｇｅｎｅＴａｇＲＦＰｗａｓｉｎｓｅｒｔｅｄｉｎｔｏｔｈｅｕｐｓｔｒｅａｍｏｆｔｈｅｓｔｏｐｃｏｄｏｎｏｆＳｌＯＬＥ１ｇｅｎｅｔｏｐｒｏｄｕｃｅａｃｈｉｍｅｒｉｃｇｅｎｅＳｌＯＬＥ１￣ＴａｇＲＦＰꎬｗｈｉｃｈｗａｓｔｈｅｎｉｎｓｅｒｔｅｄｉｎｔｏｂｉｎａｒｙｖｅｃｔｏｒｐＢＩ１２１ｔｏｃｏｎｓｔｒｕｃｔａｐｌａｎｔｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒｐＳｌＯＬＥ１￣ＴａｇＲＦＰ.Ｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒｗａｓｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄｉｎｔｏｔｏ￣ｍａｔｏｖａｒｉｅｔｙＭｏｎｅｙＭａｋｅｒｂｙＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ￣ｍｅｄｉａｔｅｄｍｅｔｈｏｄ.Ｔｈｅｓｅｅｄｓｆｒｏｍｓｅｌｆ￣ｃｒｏｓｓｅｄＴ０ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｐｌａｎｔｓｄｉｓｐｌａｙｅｄｂｒｉｇｈｔｒｅｄｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｏｒｎｏｔｕｎｄｅｒｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ.ＦｕｒｔｈｅｒｖｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｗｉｔｈＰＣＲｍｏｌｅｃｕ￣ｌａｒｍａｒｋｅｒｓｈｏｗｅｄｔｈａｔＴａｇＲＦＰｓｅｑｕｅｎｃｅｗａｓｐｒｅｓｅｎｔｉｎｔｈｅｓｅｅｄｌｉｎｇｓａｒｉｓｉｎｇｆｒｏｍｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｓｅｅｄｓꎬｉｎｄｉｃａ￣ｔｉｎｇｔｈａｔｔｈｅａｃｃｕｒａｃｙｏｆｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｔｏｍａｔｏｐｒｏｇｅｎｙｂｙｒｅｄｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅａｔｓｅｅｄｓｔａｇｅｗａｓ１００％.Ｔｈｅｒｅｆｏｒｅꎬｔｈｉｓｓｔｕｄｙｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄａｓｉｍｐｌｅꎬｆａｓｔａｎｄｌｏｗ￣ｃｏｓｔｍｅｔｈｏｄｆｏｒｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｔｏｍａｔｏｏｆｆｓｐｒｉｎｇｔｈｒｏｕｇｈｓｅｅｄｒｅｄｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓｕｓｉｎｇＳｌＯＬＥ１￣ＴａｇＲＦＰｃｈｉｍｅｒｉｃｇｅｎｅ.Ｋｅｙｗｏｒｄｓ㊀ＴｏｍａｔｏꎻＳｅｅｄꎻＲｅｄｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｐｒｏｔｅｉｎꎻＯｌｅｏｓｉｎｐｒｏｔｅｉｎꎻＴｒａｎｓｇｅｎｉｃｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ㊀㊀转基因技术以及借助转基因的基因编辑技术ꎬ促进了植物基因功能研究ꎬ而且有助于改良植物性状和培育优良新品种ꎮ植物遗传转化后ꎬ转化植株及其后代中外源ＤＮＡ的检测是一个十分必要的环节ꎬ但工作量大㊁效率有待提高ꎮ在植物的遗传转化工作中ꎬ常借助选择基因和报告基因筛选转基因植株ꎮ以卡那霉素(ｎｐｔＩＩ)和潮霉素(ｈｐｔ)等抗生素或者ＥＰＳＰＳ和Ｂａｒ等除草剂抗性基因作为选择基因进行筛选[１－２]ꎬ不同植物材料对筛选剂所需的最适浓度差别较大ꎬ会出现假阳性结果ꎬ甚至有时会影响植株的正常生长ꎮ利用ＧＵＳ作为报告基因筛选时ꎬ需要对转基因植株组织进行ＧＵＳ染色检测[３]ꎬ会破坏植物组织ꎮＦＡＳＴ(ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅａｃｃｕｍｕｌａｔｉｎｇｓｅｅｄｔｅｃｈｎｏｌ￣ｏｇｙ)是一种通过种子特异性启动子驱动荧光融合蛋白表达ꎬ利用种子荧光快速筛选转基因植株的方法ꎬ最早应用于模式植物拟南芥(Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ)[４]ꎮ荧光蛋白是一类在特定波长下激发强烈荧光的蛋白质ꎬ可作为报告基因用于检测基因特异性表达和融合蛋白分子的定位㊁迁移㊁构象变化以及分子间的相互作用[５－９]ꎮ红色荧光蛋白(ｒｅｄｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎꎬＲＦＰ)是从海葵(Ｄｉｓｃｏｓｏ￣ｍａｓｐｓｐ.)中分离出的与绿色荧光蛋白(ｇｒｅｅｎｆｌｕｏ￣ｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎꎬＧＦＰ)同源的荧光蛋白[１０]ꎬ激发波长和发射波长均较长ꎬ其中ꎬＴａｇＲＦＰ的激发波长和发射波长分别为５５５ｎｍ和５８４ｎｍꎬ其亮度大约是ｍＣｈｅｒｒｙ蛋白的３倍ꎬ具有高ｐＨ稳定性和荧光寿命长等特点ꎬ是目前所报道的相对较亮的单体红色荧光蛋白[１１]ꎮＦＡＳＴ技术将荧光蛋白作为可视化筛选标记直接鉴定转基因种子ꎬ方法简便且不会对植株产生破坏ꎬ能够降低大面积种植的成本ꎬ有效提高筛选效率[４]ꎮ油体蛋白(ｏｌｅｏｓｉｎ)是一类特殊的贮藏蛋白ꎬ有些油体蛋白在植物种子中特异表达ꎮ当外源小分子量蛋白插入到油体蛋白的Ｎ端或Ｃ端后不会影响其表达和定位ꎬ且融合蛋白非常稳定[１２－１３]ꎮ番茄(Ｓｏｌａｎｕｍｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ)是一种具有重要经济价值的蔬菜作物ꎬ也是果实发育基础研究的模式植物ꎮ转基因技术和基因编辑技术已经大量应用于番茄基础研究和性状改良ꎬ然而传统的方法无法在种子阶段区分转基因和非转基因材料ꎬ转基因后代鉴定效率比较低ꎮ本研究参考ＦＡＳＴ技术ꎬ利用番茄种子特异且高水平表达的油体蛋白基因ＳｌＯＬＥ１启动子驱动ＴａｇＲＦＰ融合蛋白表达ꎬ利用种子红色荧光快速有效筛选番茄转基因后代ꎬ为后续的基因功能研究和性状改良带来便利ꎮ１㊀材料与方法１.１㊀植物材料与菌株番茄品种 ＲｉｏＧｒａｎｄｅ 来自美国俄亥俄州立大学ＥｓｔｈｅｒｖａｎｄｅｒＫｎａａｐ实验室ꎬ于２０２０年种植于中国农业科学院蔬菜花卉研究所南区温室ꎮ番茄品种 ＭｏｎｅｙＭａｋｅｒ (ＭＭ)的种子由中国农业科学院蔬菜花卉研究所番茄遗传育种课题组扩繁保存ꎮ大肠杆菌ＤＨ５α和农杆菌ＧＶ３１０１购自上海唯地生物技术有限公司ꎮ１.２㊀番茄油体蛋白的鉴定与分析根据拟南芥油体蛋白研究结果[１４－１６]ꎬ从ＴＡＩＲ(ｔｈｅａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｒｅｓｏｕｒｃｅ)数据库下载１７个拟南芥油体蛋白序列ꎮ以拟南芥油体蛋白序列为查询序列ꎬ采用ＢＬＡＳＴＰ(ｅ－ｖａｌｕｅ<１Ｅ－５)在茄科基因组数据库ＳＧＮ(ｓｏｌａｎａｃｅａｅｇｅ￣ｎｏｍｉｃｓｎｅｔｗｏｒｋ)中检索番茄油体蛋白ꎮ从ＮＣＢＩ数据库获得水稻(Ｏｒｙｚａｓａｔｉｖａ)油体蛋白序列ꎮ利用ＣｌｕｓｔａｌＷ软件进行番茄㊁拟南芥和水稻油体蛋白多序列比对ꎬ使用ＭＥＡＧ－Ｘ软件㊁采用最大似然法(ｍａｘｉｍｕｍｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ)构建油体蛋白序列的进化树ꎮ利用番茄果实发育成熟高分辨率时空转录图谱数据库ＳＧＮ－ＴＥＡ(ｈｔｔｐｓ://ｔｅａ.ｓｇｎ.ｃｏｒｎｅｌｌ.２山东农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第５６卷㊀ｅｄｕ/)分析油体蛋白基因在成熟期果实组织的表达模式ꎮ１.３㊀ＴａｇＲＦＰ和番茄油体蛋白基因的克隆以中国农业科学院蔬菜花卉研究所张金喆老师惠赠的含红色荧光蛋白基因ＴａｇＲＦＰ编码序列的番茄ＤＮＡ为模板ꎬ使用引物ＺＰ３１１ꎬ利用高保真聚合酶预混液ＡｐｅｘＨＦＦＬＰＣＲＭａｓｔｅｒＭｉｘ(艾科瑞生物)ꎬ对ＴａｇＲＦＰ进行ＰＣＲ扩增ꎮ反应程序为:９４ħ１ｍｉｎꎻ９８ħ１０ｓꎬ６０ħ１５ｓꎬ６８ħ１ｍｉｎꎬ３５个循环ꎮ以ＣＴＡＢ法[１７]提取的番茄品种ＲｉｏＧｒａｎｄｅ幼嫩叶片的基因组ＤＮＡ为模板ꎬ使用引物Ｏｌｅ００２扩增番茄油体蛋白基因ＳｌＯＬＥ１(Ｓｏｌｙｃ０６ｇ０３４０４０)全长序列ꎮ引物序列见表１ꎮＰＣＲ产物经１％琼脂糖凝胶电泳检测后ꎬ采用ＥａｓｙＰｕｒｅ®ＱｕｉｃｋＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔ(全式金)进行胶回收纯化ꎮＴａｇＲＦＰ和ＳｌＯＬＥ１的回收产物均与ＢｌｕｎｔＺｅｒｏ克隆载体(全式金)连接ꎬ转化至ＤＨ５α感受态细胞ꎬ挑选阳性克隆送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序ꎮ表１㊀基因克隆引物引物名称正向引物序列(５'－３')反向引物序列(５'－３')ＺＰ３１１ＣＣＡＧＣＡＣＡＣＴＡＣＴＡＴＧＡＧＣＧＡＧＧＴＡＡＧＣＴＣＡＣＴＴＧＴＧＣＣＣＣＡＧＯｌｅ００２ＧＡＣＧＡＡＴＧＧＡＴＴＡＡＴＧＴＧＧＴＴＣＣＧＣＡＡＣＴＧＡＣＴＴＣＡＴＧＴＣＴＡＴＡ１.４㊀种子ＳｌＯＬＥ１－ＴａｇＲＦＰ红色荧光表达载体的构建根据ＳｌＯＬＥ１克隆载体序列和ＴａｇＲＦＰ编码序列ꎬ采用软件ＣＥＤｅｓｉｇｎ设计无缝克隆引物(表２)ꎮ无缝克隆采用ＣｌｏｎＥｘｐｒｅｓｓⅡＯｎｅＳｔｅｐＣｌｏｎｉｎｇＫｉｔ(诺唯赞)ꎬ反应条件为３７ħ连接３０ｍｉｎꎮ以Ｓｌ￣ＯＬＥ１基因克隆载体为模板ꎬ使用引物Ｌｉｎｅ００５进行反向ＰＣＲꎻ以ＴａｇＲＦＰ克隆载体为模板ꎬ使用引物Ｉｎｓｅｒｔ００５扩增ＴａｇＲＦＰ编码序列ꎮ分别对ＰＣＲ产物进行胶回收纯化ꎬ然后进行无缝克隆ꎬ将ＴａｇＲＦＰ编码序列插入到ＳｌＯＬＥ１基因终止密码子前面ꎬ构建ＳｌＯＬＥ１－ＴａｇＲＦＰ嵌合基因克隆载体Ｂｌｕｎｔ－ＯＲꎬ嵌合基因序列中仅保留１个终止密码子ꎮ使用ＥｃｏＲⅠ和ＨｉｎｄⅢ限制性内切酶对ｐＢＩ１２１植物双元表达载体(华越洋)进行双酶切ꎬ以克隆载体Ｂｌｕｎｔ－ＯＲ为模板ꎬ使用引物Ｉｎｓｅｒｔ０１０扩增ＳｌＯＬＥ１－ＴａｇＲＦＰ嵌合基因片段ꎬ胶回收纯化后与ｐＢＩ１２１双酶切产物进行无缝克隆ꎬ构建表达载体ｐＳｌＯＬＥ１－ＴａｇＲＦＰꎮ表２㊀无缝克隆引物引物名称正向引物序列(５ᶄ－３ᶄ)反向引物序列(５ᶄ－３ᶄ)Ｌｉｎｅ００５ＧＣＴＡＧＣＧＣＴＡＣＴＣＴＣＴＡＣＴ￣ＴＣＴＡＧＡＴＴＴＡＧＴＣＴＧＡＴＧＧＧＴＴＣＣＡＧＴ￣ＧＡＴＧＴＧＩｎｓｅｒｔ００５ｔｃａｃｔｇｇａａｃｃｃａｔｃａｇａｃｔＡＴＧＡＧ－ＣＧＡＧＣＴＧＡＴＴＡＡＧＧＡＧＡＡａａｇｔａｇａｇａｇｔａｇｃｇｃｔａｇｃＴＣＡＣＴＴ￣ＧＴＧＣＣＣＣＡＧＴＴＴＧＣＩｎｓｅｒｔ０１０ｇａｃｃａｔｇａｔｔａｃｇｃｃａａｇｃｔｔＧＡＣＧＡＡＴＧ￣ＧＡＴＴＡＡＴＧＴＧＧＴＴＣＡＡａａａａｃｇａｃｇｇｃｃａｇｔｇａａｔｔｃＣＧ￣ＣＡＡＣＴＧＡＣＴＴＣＡＴＧＴＣ￣ＴＡＴＡＴＡＡＡＡＧ１.５㊀种子ＳｌＯＬＥ１－ＴａｇＲＦＰ红色荧光表达载体的遗传转化利用冻融法将表达载体ｐＳｌＯＬＥ１－ＴａｇＲＦＰ转入农杆菌ＧＶ３１０１ꎬ通过农杆菌介导法进行番茄ＭＭ子叶的遗传转化ꎮ遗传转化方案参照文献[１８]ꎬ将ＭＭ的种子消毒后置于１/２ＭＳ培养基ꎬ待子叶展开且真叶尚未长出时剪下子叶ꎬ在Ａ１培养基中暗培养２ｄ后进行侵染ꎬ侵染的子叶继续在Ａ１培养基中培养２ｄꎬ经Ａ２培养基诱导得到愈伤组织和分化的芽ꎬＡ３培养基分化培养得到小苗ꎬ最后由Ａ４培养基生根培养得到生根小苗后移栽至中国农业科学院蔬菜花卉研究所北圃场玻璃温室ꎮ１.６㊀转基因番茄的ＰＣＲ检测和种子荧光鉴定提取转基因番茄植株的ＤＮＡꎬ根据表达载体中ＴａｇＲＦＰ两侧序列设计引物Ｏ＋Ｒ－７(Ｆ:ＧＧＴＡ￣ＡＧＣＧＴＧＴＴＡＴＣＧＴＧＧＡꎻＲ:ＡＴＧＡＡＧＡＣＧＡＧＣＣＴＣＧ￣ＴＡＧＣ)ꎬＰＣＲ检测Ｔ０代植株中是否插入ＴａｇＲＦＰ基因序列ꎮ将Ｔ０代阳性转基因植株自交授粉收获的干燥种子ꎬ置于徕卡体视荧光显微镜(ＬｅｉｃａＭＺ１０Ｆ)下进行荧光成像和拍照ꎮ挑选呈现荧光和无荧光的种子分别催芽ꎬ真叶长出后提取ＤＮＡꎬ进一步通过ＰＣＲ验证番茄转基因后代中是否含有ＴａｇＲＦＰ基因ꎮ２㊀结果与分析２.１㊀番茄油体蛋白基因分析在ＳＧＮ数据库中检索到番茄中有９个油体蛋白编码基因ꎬ分别是Ｓｏｌｙｃ０２ｇ０８６４９０㊁Ｓｏｌｙｃ０３ｇ１１２４４０㊁Ｓｏｌｙｃ０３ｇ１１９８２０㊁Ｓｏｌｙｃ０６ｇ０３４０４０㊁Ｓｏｌｙｃ０６ｇ０６０８４０㊁Ｓｏｌｙｃ０６ｇ０６９２６０㊁Ｓｏｌｙｃ０８ｇ０６６０４０㊁Ｓｏｌｙｃ０８ｇ０７８１６０和Ｓｏｌｙｃ１２ｇ０１０９２０ꎮ在ＮＣＢＩ数３㊀第４期㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀章力ꎬ等:利用种子红色荧光标记鉴定转基因番茄后代据库中检索到６个水稻油体蛋白编码基因:Ｏｓ０１ｇ０６４３９００㊁Ｏｓ０３ｇ４９１９０㊁Ｏｓ０４ｇ０５４６５００㊁Ｏｓ０５ｇ０５７６７００㊁Ｏｓ０６ｇ０４７３８００和Ｏｓ０９ｇ０３２４０００ꎮ为了明确番茄㊁拟南芥和水稻油体蛋白之间的亲缘关系ꎬ对番茄９个㊁拟南芥１７个和水稻６个的油体蛋白构建分子进化树(图１Ａ)ꎮ在进化树中ꎬ番茄油体蛋白基因Ｓｏｌｙｃ０６ｇ０３４０４０与拟南芥中的ＡＴ４Ｇ２５１４０(ＡｔＯＬＥ１)和ＡＴ５Ｇ５１２１０基因以及水稻的Ｏｓ０９ｇ０３２４０００(ＯｓＯＬＥ４)和Ｏｓ０４ｇ０５４６５００(ＯｓＯＬＥ３)基因亲缘关系最近ꎮＡＴ４Ｇ２５１４０(ＡｔＯＬＥ１)是拟南芥种子中最丰富的油体蛋白[１９]ꎮ利用自身启动子分别驱动ＡＴ４Ｇ２５１４０(ＡｔＯＬＥ１)㊁Ｏｓ０９ｇ０３２４０００(ＯｓＯＬＥ４)基因与ＧＦＰ基因的融合蛋白基因表达ꎬ可使转基因拟南芥和水稻的种子呈现出绿色荧光[２０]ꎮ随后检索番茄基因表达数据库ＳＧＮ－ＴＥＡ(ｈｔｔｐｓ://ｔｅａ.ｓｇｎ.ｃｏｒｎｅｌｌ.ｅｄｕ/)ꎬ发现Ｓｏｌｙｃ０３ｇ１１２４４０㊁Ｓｏｌｙｃ１２ｇ０１０９２０和Ｓｏｌｙｃ０６ｇ０３４０４０基因在红熟期种子中的表达量居前三ꎬＲＰＭ值分别为２１１４.９４㊁１７１９.４１和１１８５.１５ꎮ由于Ｓｏｌｙｃ０６ｇ０３４０４０在番茄红熟期果实的其他组织中几乎不表达(图１Ｂ)ꎬ且其编码蛋白与拟南芥ＡＴ４Ｇ２５１４０(ＡｔＯＬＥ１)和水稻Ｏｓ０９ｇ０３２４０００(ＯｓＯＬＥ４)蛋白序列相似性最高ꎬ因此ꎬ推测Ｓｏｌｙｃ０６ｇ０３４０４０基因(以下简称ＳｌＯＬＥ１)启动子可以驱动融合蛋白在番茄种子中表达ꎮ图１㊀番茄㊁拟南芥和水稻的油体蛋白进化树(Ａ)及番茄ＳｌＯＬＥ１基因在红熟期果实和㊀㊀总果皮的表达模式(Ｂ)(基因表达数据来自ｈｔｔｐｓ://ｔｅａ.ｓｇｎ.ｃｏｒｎｅｌｌ.ｅｄｕ/)２.２㊀种子红色荧光表达载体ｐＳｌＯＬＥ１－ＴａｇＲＦＰ构建以番茄 ＲｉｏＧｒａｎｄｅ 的ＤＮＡ为模板ꎬ经引物Ｏｌｅ００２扩增得到长度为４００４ｂｐ的ＳｌＯＬＥ１基因全长片段(图２Ａ)ꎬ其中含启动子和终止子序列长度各约１.７ｋｂꎮ利用引物ＺＰ３１１扩增ＴａｇＲＦＰ编码区序列(７１５ｂｐꎬ图２Ｂ)ꎮＰＣＲ扩增片段分别连入ＢｌｕｎｔＺｅｒｏ克隆载体ꎬ测序后获得序列正确的克隆载体Ｂｌｕｎｔ－ＳｌＯＬＥ１和Ｂｌｕｎｔ－ＴａｇＲＦＰꎮ将质粒Ｂｌｕｎｔ－ＳｌＯＬＥ１通过反向ＰＣＲ线性化(引物Ｌｉｎｅ００５ꎬ表２)ꎬ与质粒Ｂｌｕｎｔ－ＴａｇＲＦＰ为模板的ＰＣＲ产物的胶回收纯化产物(引物Ｉｎ￣ｓｅｒｔ００５ꎬ表２)进行无缝克隆ꎬ成功在ＳｌＯＬＥ１基因终止密码子前面插入ＴａｇＲＦＰ编码区序列ꎬ获得重组质粒Ｂｌｕｎｔ－ＯＲꎮ将ｐＢＩ１２１双元载体的ＥｃｏＲⅠ和ＨｉｎｄⅢ双４山东农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第５６卷㊀酶切产物ꎬ与质粒Ｂｌｕｎｔ－ＯＲ为模板的ＰＣＲ产物的胶回收纯化产物无缝克隆(引物Ｉｎｓｅｒｔ０１０ꎬ表２)ꎮ无缝克隆产物转化大肠杆菌ＤＨ５αꎬ利用引物ＺＰ３１１进行菌液ＰＣＲ鉴定ꎬ以Ｂｌｕｎｔ－ＴａｇＲＦＰ质粒为阳性对照ꎬ有９份菌液扩增出条带ꎬ大小约为７１５ｂｐꎬ其中菌液ＳｌＯＬＥ１－ＴａｇＲＦＰ－１４的测序结果完全正确ꎬ成功构建种子红色荧光表达载体ｐＳｌＯＬＥ１－ＴａｇＲＦＰ(图２Ｃ㊁图３)ꎮＭ:ＤＮＡ分子量参考ꎻ阳:Ｂｌｕｎｔ－ＴａｇＲＦＰ质粒阳性对照ꎮ图２㊀ＳｌＯＬＥ１基因全长(Ａ)㊁ＴａｇＲＦＰ编码区片段(Ｂ)以及ｐＳｌＯＬＥ１－ＴａｇＲＦＰ菌液(Ｃ)的ＰＣＲ扩增图３㊀ＳｌＯＬＥ１－ＴａｇＲＦＰ表达载体示意图２.３㊀ＳｌＯＬＥ１－ＴａｇＲＦＰ转基因阳性番茄植株获得将ｐＳｌＯＬＥ１－ＴａｇＲＦＰ质粒转入农杆菌ＧＶ３１０１ꎬ以番茄ＭＭ的子叶为外植体进行侵染ꎬ经组织培养共获得４５个再生植株ꎮ以转基因植株的ＤＮＡ为模板ꎬ使用引物Ｏ＋Ｒ－７对ＴａｇＲＦＰ基因进行ＰＣＲ检测ꎮ以ｐＳｌＯＬＥ１－ＴａｇＲＦＰ质粒为阳性对照ꎬ野生型ＭＭ为阴性对照ꎬ水为空白对照ꎬ结果(图４)显示ꎬ有８株Ｔ０代番茄植株的扩增产物与野生型ＭＭ一致ꎬ为单一条带ꎬ表明没有插入ＴａｇＲＦＰ基因ꎻ其余３７株均扩增出杂合条带ꎬ表明成功插入了ＴａｇＲＦＰ编码区序列ꎬ遗传转化效率达到８２.２２％ꎮ图４㊀ＳｌＯＬＥ１－ＴａｇＲＦＰＴ０代转基因植株的ＰＣＲ鉴定２.４㊀转基因番茄后代种子红色荧光观察及ＰＣＲ鉴定挑选９株生长健壮的ＳｌＯＬＥ１－ＴａｇＲＦＰ阳性转基因番茄幼苗ꎬ移栽至玻璃温室ꎬ振荡自交授粉ꎮ将Ｔ０代植株自交种子干燥后置于徕卡体视荧光显微镜下ꎬ以野生型ＭＭ的种子为阴性对照ꎬ分别在明场和荧光光源下检测ＴａｇＲＦＰ信号ꎮ结果(图５)显示ꎬ在明场下ꎬ野生型ＭＭ和转基因干燥种子颜色无明显差异ꎻ在荧光下ꎬ野生型种子均无红色荧光ꎬ转基因种子部分呈现明亮红色荧光ꎮ表明ＴａｇＲＦＰ可以作为一种标记筛选出转基因番茄后代中的红色荧光种子ꎮ５㊀第４期㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀章力ꎬ等:利用种子红色荧光标记鉴定转基因番茄后代图５㊀野生型ＭＭ和Ｔ０代转基因植株自交种子的ＴａｇＲＦＰ荧光检测㊀㊀为了验证通过种子红色荧光检测番茄转基因后代的准确性ꎬ进一步播种转基因植株的红色荧光种子和无荧光种子各９６粒ꎬ使用引物Ｏ＋Ｒ－７进行ＰＣＲꎬ鉴定后代植株是否存在ＴａｇＲＦＰ序列ꎮ结果表明ꎬ９６株红色荧光种子萌发的幼苗扩增产物均为杂合条带ꎬ表明含有ＴａｇＲＦＰ编码区序列ꎬ而９６株无荧光种子萌发的幼苗扩增产物均为单一条带ꎬ表明不含ＴａｇＲＦＰ编码区序列ꎮ荧光种子和无荧光种子各１２粒萌发的幼苗ＰＣＲ检测结果如图６所示ꎬ表明通过种子红色荧光鉴定番茄转基因后代的准确率达１００％ꎮ图６㊀红色荧光(Ａ)和无荧光(Ｂ)种子的ＰＣＲ检测３㊀讨论与结论荧光蛋白有多种类型ꎬ其中ꎬ绿色荧光蛋白(ＧＦＰ)㊁蓝色荧光蛋白(ＢＦＰ)㊁青色荧光蛋白(ＣＦＰ)和黄色荧光蛋白(ＹＦＰ)等[２１－２４]的发射波长局限在４４０~５２９ｎｍ[２５]ꎬ在细胞内成像时会激发某些内源物质产生荧光ꎬ对结果造成不同程度的干扰ꎮ本研究所使用的ＴａｇＲＦＰ的发射波长为５８４ｎｍꎬ细胞内成像背景低ꎬ更容易检测ꎮ通过ＰＣＲ分子标记检测发现ꎬ利用ＴａｇＲＦＰ作为筛选标记ꎬ区分转基因与非转基因种子的准确率可达１００％ꎮ此外ꎬ使用荧光蛋白标记筛选转基因种子时ꎬ可利用荧光种子分选设备进一步提高鉴定效率[２６－２７]ꎮ种子特异性表达启动子驱动荧光蛋白基因ꎬ可用于转基因种子的可视化鉴定ꎮ在拟南芥中使用种子储藏蛋白基因ｎａｐｉｎ启动子驱动荧光蛋白进行表达ꎬ可以在荧光显微镜下识别转基因种子[２８]ꎮ拟南芥和水稻油体蛋白基因ＡｔＯＬＥ１㊁Ｏｓ￣ＯＬＥ４与ＧＦＰ的融合蛋白基因表达ꎬ可使转基因种子呈现绿色荧光ꎬ从而实现快速简便鉴定转基因后代[４ꎬ２０]ꎮ本研究发现ＳｌＯＬＥ１(Ｓｏｌｙｃ０６ｇ０３４０４０)是拟南芥ＡｔＯＬＥ１基因和水稻ＯｓＯＬＥ４基因的同源基因ꎬ而且在番茄种子中特异㊁高水平表达ꎮ利用Ｓｌ￣ＯＬＥ１基因启动子驱动ＳｌＯＬＥ１－ＴａｇＲＦＰ融合蛋白表达ꎬ成功实现了通过种子红色荧光快速简便鉴定转基因番茄后代的目的ꎮ由此推测ꎬ利用植物自身种子特异性启动子驱动油体蛋白与荧光蛋白融合基因的表达ꎬ可以应用于其他含油体蛋白种子植物的转基因后代鉴定ꎮ种子荧光标记系统已经逐步应用于基础研究６山东农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第５６卷㊀和育种领域ꎮ基因编辑通常借助稳定的遗传转化ꎬ需要对阳性转基因植株和不含转基因成分的突变后代进行筛选ꎬ工作量大ꎬ费用高ꎮ玉米种子荧光报告系统辅助的ＣＲＩＳＰＲ/Ｃａｓ基因编辑技术通过胚中的红色荧光标记准确鉴别转基因或非转基因籽粒ꎬ显著提高了基因编辑工作效率[２９]ꎮ水稻智能不育育种技术将育性恢复基因㊁花粉失活基因和种子特异启动子驱动的红色荧光蛋白基因串联ꎬ一起导入到水稻雄性不育突变体中ꎬ自交可产生无荧光的雄性不育种子和有荧光的可育种子[３０]ꎮ玉米雄性不育制种新技术也可根据红色荧光实现不育系和保持系种子的分选[３１]ꎮ利用单倍体诱导系的单倍体育种技术可以加快纯系选育进程ꎬ提高育种效率ꎮ然而单倍体诱导效率一般不高ꎬ鉴别也较为困难ꎮ利用基因编辑技术创制拟南芥㊁玉米和马铃薯等植物的单倍体诱导系ꎬ结合种子荧光标记ꎬ提高了单倍体鉴别效率[３２－３３]ꎮＺｈｏｎｇ等[３４]报道的番茄单倍体荧光鉴别技术体系中使用的是拟南芥ＦＡＳＴ￣Ｒｅｄ标记ꎮ本研究克隆了番茄自身的种子特异性表达基因ＳｌＯＬＥ１ꎬ并构建了ＳｌＯＬＥ１－ＴａｇＲＦＰ嵌合基因ꎮ稳定遗传转化ＳｌＯＬＥ１－ＴａｇＲＦＰ嵌合基因的番茄种子在激发光照射下发出明亮的红色荧光ꎬ准确率可达１００％ꎮ该种子红色荧光标记筛选体系将有望应用于番茄基因编辑㊁智能雄性不育系创制和单倍体鉴别等领域ꎬ具有一定基础研究和育种应用价值ꎮ参㊀考㊀文㊀献:[１]㊀ＯｒｔｉｚＪＰꎬＲｅｇｇｉａｒｄｏＭＩꎬＲａｖｉｚｚｉｎｉＲＡꎬｅｔａｌ.Ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎｒｅ￣ｓｉｓｔａｎｃｅａｓａｎｅｆｆｉｃｉｅｎｔｓｅｌｅｃｔａｂｌｅｍａｒｋｅｒｆｏｒｗｈｅａｔｓｔａｂｌｅｔｒａｎｓ￣ｆｏｒｍａｔｉｏｎ[Ｊ].ＰｌａｎｔＣｅｌｌＲｅｐｏｒｔｓꎬ２０１５ꎬ１５(１２):８７７－８８１. [２]㊀ＮａｋａｍｕｒａＳꎬＭａｎｏＳꎬＴａｎａｋａＹꎬｅｔａｌ.Ｇａｔｅｗａｙｂｉｎａｒｙｖｅｃｔｏｒｓｗｉｔｈｔｈｅｂｉａｌａｐｈｏｓｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｇｅｎｅꎬｂａｒꎬａｓａｓｅｌｅｃｔｉｏｎｍａｒｋｅｒｆｏｒｐｌａｎｔｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ[Ｊ].ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ＆Ｂｉｏｃｈｅｍ￣ｉｓｔｒｙꎬ２０１０ꎬ７４(６):１３１５－１３１９.[３]㊀ＳｈｉｖａＰｒａｋａｓｈＮꎬＢｈｏｊａｒａｊａＲꎬＳｈｉｖｂａｃｈａｎＳＫꎬｅｔａｌ.Ｍａｒｋｅｒ￣ｆｒｅｅｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｃｏｒｎｐｌａｎｔｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｔｈｒｏｕｇｈｃｏ￣ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ[Ｊ].ＰｌａｎｔＣｅｌｌＲｅｐｏｒｔｓꎬ２００９ꎬ２８(１１):１６５５－１６６８. [４]㊀ＳｈｉｍａｄａＴＬꎬＳｈｉｍａｄａＴꎬＨａｒａ￣ＮｉｓｈｉｍｕｒａＩ.Ａｒａｐｉｄａｎｄｎｏｎ￣ｄｅｓｔｒｕｃｔｉｖｅｓｃｒｅｅｎａｂｌｅｍａｒｋｅｒꎬＦＡＳＴꎬｆｏｒｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄｓｅｅｄｓｏｆＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ[Ｊ].ＴｈｅＰｌａｎｔＪｏｕｒｎａｌꎬ２０１０ꎬ６１(３):５１９－５２８.[５]㊀ＪａｃｈＧꎬＢｉｎｏｔＥꎬＦｒｉｎｇｓＳꎬｅｔａｌ.ＵｓｅｏｆｒｅｄｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎｆｒｏｍＤｉｓｃｏｓｏｍａｓｐ.(ｄｓＲＥＤ)ａｓａｒｅｐｏｒｔｅｒｆｏｒｐｌａｎｔｇｅｎｅｅｘ￣ｐｒｅｓｓｉｏｎ[Ｊ].ＴｈｅＰｌａｎｔＪｏｕｒｎａｌꎬ２００１ꎬ２８(４):４８３－４９１. [６]㊀ＭｉｚｕｎｏＨꎬＳａｗａｎｏＡꎬＥｌｉＰꎬｅｔａｌ.ＲｅｄｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎｆｒｏｍＤｉｓｃｏｓｏｍａａｓａｆｕｓｉｏｎｔａｇａｎｄａｐａｒｔｎｅｒｆｏｒｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｒｅｓｏ￣ｎａｎｃｅｅｎｅｒｇｙｔｒａｎｓｆｅｒ[Ｊ].Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙꎬ２００１ꎬ４０(８):２５０２－２５１０.[７]㊀ＹａｒｂｒｏｕｇｈＤꎬＷａｃｈｔｅｒＲＭꎬＫａｌｌｉｏＫꎬｅｔａｌ.ＲｅｆｉｎｅｄｃｒｙｓｔａｌｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆＤｓＲｅｄꎬａｒｅｄｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎｆｒｏｍｃｏｒａｌꎬａｔ２.０￣Åｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ[Ｊ].ＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓｏｆｔｈｅＮａｔｉｏｎａｌＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉ￣ｅｎｃｅｓｏｆｔｈｅＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓｏｆＡｍｅｒｉｃａꎬ２００１ꎬ９８(２):４６２－４６７. [８]㊀ＪａｃｈＧꎬＰｅｓｃｈＭꎬＲｉｃｈｔｅｒＫꎬｅｔａｌ.ＡｎｉｍｐｒｏｖｅｄｍＲＦＰ１ａｄｄｓｒｅｄｔｏｂｉｍｏｌｅｃｕｌａｒｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ[Ｊ].ＮａｔｕｒｅＭｅｔｈｏｄｓꎬ２００６ꎬ３(８):５９７－６００.[９]㊀ＮｉｓｈｉｚａｗａＫꎬＫｉｔａＹꎬＫｉｔａｙａｍａＭꎬｅｔａｌ.Ａｒｅｄｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏ￣ｔｅｉｎꎬＤｓＲｅｄ２ꎬａｓａｖｉｓｕａｌｒｅｐｏｒｔｅｒｆｏｒｔｒａｎｓｉｅｎｔｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄｓｔａｂｌｅｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｉｎｓｏｙｂｅａｎ[Ｊ].ＰｌａｎｔＣｅｌｌＲｅｐｏｒｔｓꎬ２００６ꎬ２５(１２):１３５５－１３６１.[１０]ＭａｔｚＭＶꎬＦｒａｄｋｏｖＡＦꎬＬａｂａｓＹＡꎬｅｔａｌ.ＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎｓｆｒｏｍｎｏｎｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔＡｎｔｈｏｚｏａｓｐｅｃｉｅｓ[Ｊ].ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈ￣ｎｏｌｏｇｙꎬ１９９９ꎬ１７(１０):９６９－９７３.[１１]ＭｅｒｚｌｙａｋＥＭꎬＧｏｅｄｈａｒｔＪꎬＳｈｃｈｅｒｂｏＤꎬｅｔａｌ.Ｂｒｉｇｈｔｍｏｎｏ￣ｍｅｒｉｃｒｅｄｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎｗｉｔｈａｎｅｘｔｅｎｄｅｄｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｌｉｆｅ￣ｔｉｍｅ[Ｊ].ＮａｔｕｒｅＭｅｔｈｏｄｓꎬ２００７ꎬ４(７):５５５－５５７.[１２]ＲｏｏｉｊｅｎＧＪＨꎬＭｏｌｏｎｅｙＭＭ.Ｐｌａｎｔｓｅｅｄｏｉｌ￣ｂｏｄｉｅｓａｓｃａｒｒｉｅｒｓｆｏｒｆｏｒｅｉｇｎｐｒｏｔｅｉｎｓ[Ｊ].Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙꎬ１９９５ꎬ１３(１):７２－７７. [１３]ＨｕａｎｇＡＨ.Ｏｌｅｏｓｉｎｓａｎｄｏｉｌｂｏｄｉｅｓｉｎｓｅｅｄｓａｎｄｏｔｈｅｒｏｒｇａｎｓ[Ｊ].Ｐｌａｎｔｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙꎬ１９９６ꎬ１１０(４):１０５５－１０６１.[１４]ＳｈｉｍａｄａＴＬꎬＨａｙａｓｈｉＭꎬＨａｒａ￣ＮｉｓｈｉｍｕｒａＩ.Ｍｅｍｂｒａｎｅｄｙｎａｍ￣ｉｃｓａｎｄｍｕｌｔｉｐｌｅｆｕｎｃｔｉｏｎｓｏｆｏｉｌｂｏｄｉｅｓｉｎｓｅｅｄｓａｎｄｌｅａｖｅｓ[Ｊ].ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙꎬ２０１８ꎬ１７６(１):１９９－２０７.[１５]ＣｈｅｎＫꎬＹｉｎＹＴꎬＬｉｕＳꎬｅｔａｌ.Ｇｅｎｏｍｅ￣ｗｉｄｅｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｆｕｎｃｔｉｏｎａｌａｎａｌｙｓｉｓｏｆｏｌｅｏｓｉｎｇｅｎｅｓｉｎＢｒａｓｓｉｃａｎａｐｕｓＬ.[Ｊ].ＢＭＣＰｌａｎｔＢｉｏｌｏｇｙꎬ２０１９ꎬ１９:２９４.[１６]ＹｕａｎＹＣꎬＣａｏＸＺꎬＺｈａｎｇＨＪꎬｅｔａｌ.Ｇｅｎｏｍｅ￣ｗｉｄｅｉｄｅｎｔｉｆｉｃａ￣ｔｉｏｎａｎｄａｎａｌｙｓｉｓｏｆＯｌｅｏｓｉｎｇｅｎｅｆａｍｉｌｙｉｎｆｏｕｒｃｏｔｔｏｎｓｐｅｃｉｅｓａｎｄｉｔｓｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔｉｎｏｉｌａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎａｎｄｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ[Ｊ].ＢＭＣＰｌａｎｔＢｉｏｌｏｇｙꎬ２０２１ꎬ２１(１):５６９.[１７]ＤｏｙｌｅＪＪꎬＤｏｙｌｅＪＬ.ＡｒａｐｉｄＤＮＡｉｓｏｌａｔｉｏｎｐｒｏｃｅｄｕｒｅｆｏｒｓｍａｌｌｑｕａｎｔｉｔｉｅｓｏｆｆｒｅｓｈｌｅａｆｔｉｓｓｕｅ[Ｊ].ＰｈｙｔｏｃｈｅｍｉｃａｌＢｕｌｌｅｔｉｎꎬ１９８７ꎬ１９:１１－１５.[１８]杨孟霞.利用基因编辑技术创制番茄雄性不育材料的研究[Ｄ].北京:中国农业科学院ꎬ２０２０.[１９]ＳｈｉｍａｄａＴＬꎬＳｈｉｍａｄａＴꎬＴａｋａｈａｓｈｉＨꎬｅｔａｌ.ＡｎｏｖｅｌｒｏｌｅｆｏｒｏｌｅｏｓｉｎｓｉｎｆｒｅｅｚｉｎｇｔｏｌｅｒａｎｃｅｏｆｏｉｌｓｅｅｄｓｉｎＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ[Ｊ].ＴｈｅＰｌａｎｔＪｏｕｒｎａｌꎬ２００８ꎬ５５(５):７９８－８０９.[２０]ＳｈｉｍａｄａＴꎬＯｇａｗａＹꎬＳｈｉｍａｄａＴꎬｅｔａｌ.Ａｎｏｎ￣ｄｅｓｔｒｕｃｔｉｖｅｓｃｒｅｅｎａｂｌｅｍａｒｋｅｒꎬＯｓＦＡＳＴꎬｆｏｒｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｒｉｃｅｓｅｅｄｓ[Ｊ].ＰｌａｎｔＳｉｇｎａｌｉｎｇ＆Ｂｅｈａｖｉｏｒꎬ２０１１ꎬ６(１０):１４５４－１４５６.[２１]ＴｓｉｅｎＲＹ.Ｔｈｅｇｒｅｅｎｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎ[Ｊ].ＡｎｎｕａｌＲｅｖｉｅｗｏｆ７㊀第４期㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀章力ꎬ等:利用种子红色荧光标记鉴定转基因番茄后代Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙꎬ１９９８ꎬ６７:５０９－５４４.[２２]ＰａｔｔｅｒｓｏｎＧＨꎬＤａｙＲＮꎬＰｉｓｔｏｎＤＪ.Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎｓｐｅｃｔｒａ[Ｊ].ＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｅｌｌＳｃｉｅｎｃｅꎬ２００１ꎬ１１４(５):８３７－８３８. [２３]ＲｉｚｚｏＭＡꎬＳｐｒｉｎｇｅｒＧＨꎬＧｒａｎａｄａＢꎬｅｔａｌ.ＡｎｉｍｐｒｏｖｅｄｃｙａｎｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎｖａｒｉａｎｔｕｓｅｆｕｌｆｏｒＦＲＥＴ[Ｊ].ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈ￣ｎｏｌｏｇｙꎬ２００４ꎬ２２(４):４４５－４４９.[２４]ＧｒｉｅｓｂｅｃｋＯꎬＢａｉｒｄＧＳꎬＣａｍｐｂｅｌｌＲＥꎬｅｔａｌ.Ｒｅｄｕｃｉｎｇｔｈｅｅｎ￣ｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙｏｆｙｅｌｌｏｗｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎｍｅｃｈａｎｉｓｍａｎｄａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ[Ｊ].ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙꎬ２００１ꎬ２７６(３１):２９１８８－２９１９４.[２５]樊晋宇ꎬ崔宗强ꎬ张先恩.红色荧光蛋白的光谱多样性及体外分子进化[Ｊ].生物化学与生物物理进展ꎬ２００８ꎬ３５(１０):１１１２－１１２０.[２６]中国科学院长春光学精密机械与物理研究所.一种用于荧光种子分选的光学装置:ＣＮ１１５１４４３３０Ａ[Ｐ].２０２１－０３－３０. [２７]中国科学院长春光学精密机械与物理研究所.荧光种子分选装置:ＣＮ２１４７１８４８２Ｕ[Ｐ].２０２１－１１－１６.[２８]ＳｔｕｉｔｊｅＡＲꎬＶｅｒｂｒｅｅＥＣꎬｖａｎｄｅｒＬｉｎｄｅｎＫＨꎬｅｔａｌ.Ｓｅｅｄ￣ｅｘ￣ｐｒｅｓｓｅｄｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎｓａｓｖｅｒｓａｔｉｌｅｔｏｏｌｓｆｏｒｅａｓｙ(ｃｏ)ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎａｎｄｈｉｇｈ￣ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｇｅｎｏｍｉｃｓｉｎＡｒａ￣ｂｉｄｏｐｓｉｓ[Ｊ].ＰｌａｎｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＪｏｕｒｎａｌꎬ２００３ꎬ１(４):３０１－３０９.[２９]ＹａｎＹＹꎬＺｈｕＪＪꎬＱｉＸＴꎬｅｔａｌ.Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔｏｆａｎｅｆｆｉｃｉｅｎｔｓｅｅｄｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｒｅｐｏｒｔｅｒ￣ａｓｓｉｓｔｅｄＣＲＩＳＰＲ/Ｃａｓ９ｇｅｎｅｅｄｉｔｉｎｇｉｎｍａｉｚｅ[Ｊ].ＪｏｕｒｎａｌｏｆＩｎｔｅｇｒａｔｉｖｅＰｌａｎｔＢｉｏｌｏｇｙꎬ２０２１ꎬ６３(９):１６７１－１６８０.[３０]ＣｈａｎｇＺＹꎬＣｈｅｎＺＦꎬＷａｎｇＮꎬｅｔａｌ.Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆａｍａｌｅｓｔｅｒｉｌｉｔｙｓｙｓｔｅｍｆｏｒｈｙｂｒｉｄｒｉｃｅｂｒｅｅｄｉｎｇａｎｄｓｅｅｄｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｕ￣ｓｉｎｇａｎｕｃｌｅａｒｍａｌｅｓｔｅｒｉｌｉｔｙｇｅｎｅ[Ｊ].ＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓｏｆｔｈｅＮａ￣ｔｉｏｎａｌＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓｏｆｔｈｅＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓｏｆＡｍｅｒｉｃａꎬ２０１６ꎬ１１３(４９):１４１４５－１４１５０.[３１]ＣａｉＤＲꎬＺｈａｎｇＺＧꎬＺｈａｏＬꎬｅｔａｌ.Ａｎｏｖｅｌｈｙｂｒｉｄｓｅｅｄｐｒｏｄｕｃ￣ｔｉｏｎｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｂａｓｅｄｏｎａｕｎｉｌａｔｅｒａｌｃｒｏｓｓ￣ｉｎｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙｇｅｎｅｉｎｍａｉｚｅ[Ｊ].ＳｃｉｅｎｃｅＣｈｉｎａＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓꎬ２０２３ꎬ６６(３):５９５－６０１.[３２]ＺｈｏｎｇＹꎬＣｈｅｎＢＪꎬＬｉＭＲꎬｅｔａｌ.ＡＤＭＰ￣ｔｒｉｇｇｅｒｅｄｉｎｖｉｖｏｍａｔｅｒｎａｌｈａｐｌｏｉｄｉｎｄｕｃｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍｉｎｔｈｅｄｉｃｏｔｙｌｅｄｏｎｏｕｓＡｒａｂｉ￣ｄｏｐｓｉｓ[Ｊ].ＮａｔｕｒｅＰｌａｎｔｓꎬ２０２０ꎬ６(５):４６６－４７２.[３３]ＺｈａｎｇＪＺꎬＹｉｎＪꎬＬｕｏＪＹꎬｅｔａｌ.Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆｈｏｍｏｚｙｇｏｕｓｄｉｐ￣ｌｏｉｄｐｏｔａｔｏｔｈｒｏｕｇｈｍａｔｅｒｎａｌｈａｐｌｏｉｄｉｎｄｕｃｔｉｏｎ[Ｊ].ａＢＩＯＴＥＣＨꎬ２０２２ꎬ３(３):１６３－１６８.[３４]ＺｈｏｎｇＹꎬＣｈｅｎＢＪꎬＷａｎｇＤꎬｅｔａｌ.Ｉｎｖｉｖｏｍａｔｅｒｎａｌｈａｐｌｏｉｄｉｎ￣ｄｕｃｔｉｏｎｉｎｔｏｍａｔｏ[Ｊ].ＰｌａｎｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＪｏｕｒｎａｌꎬ２０２２ꎬ２０(２):２５０－２５２.８山东农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第５６卷㊀。

第1篇一、实验背景基因荧光小鼠是一种重要的实验动物模型，通过基因工程技术将荧光蛋白基因导入小鼠基因组中，使小鼠体内特定细胞或组织表达荧光蛋白，从而在活体状态下观察细胞或组织的形态、分布、功能等。

基因荧光小鼠在生物医学研究、疾病模型构建、药物筛选等领域具有广泛的应用价值。

本实验旨在通过基因工程技术构建基因荧光小鼠模型，并对其表达特性、组织分布、体内功能等方面进行研究。

二、实验材料与方法1. 实验材料（1）小鼠：C57BL/6小鼠，雌雄各10只，体重20-25g。

（2）荧光蛋白基因（GFP）：克隆自绿色荧光蛋白（GFP）基因，包含启动子、编码序列和终止子。

（3）载体：pEGFP-N1质粒，含有GFP基因。

（4）试剂：DNA限制性内切酶、DNA连接酶、T4 DNA连接酶、DNA聚合酶、PCR试剂盒、细胞培养试剂等。

2. 实验方法（1）荧光蛋白基因克隆采用PCR技术从GFP基因克隆片段中扩增目的基因，并通过限制性内切酶进行酶切，与载体pEGFP-N1进行连接，构建重组质粒pEGFP-N1-GFP。

（2）重组质粒鉴定对重组质粒进行PCR扩增，电泳检测目的基因条带，并进行测序验证。

（3）基因转移采用显微注射技术将重组质粒pEGFP-N1-GFP注入小鼠受精卵，构建基因荧光小鼠。

（4）基因荧光小鼠培育将注射重组质粒的受精卵移植到雌鼠体内，进行胚胎培养和胚胎移植，获得基因荧光小鼠。

（5）基因荧光小鼠表型观察观察基因荧光小鼠的体貌特征、生长发育、组织分布、荧光表达等。

三、实验结果1. 重组质粒构建通过PCR扩增和酶切连接，成功构建了重组质粒pEGFP-N1-GFP，经测序验证，目的基因序列与预期一致。

2. 基因荧光小鼠表型观察（1）体貌特征：基因荧光小鼠外观与普通小鼠无异。

（2）生长发育：基因荧光小鼠生长发育正常，体重增长符合预期。

（3）组织分布：荧光蛋白基因在基因荧光小鼠体内表达，主要分布在肝脏、肾脏、心脏、肺脏等器官。

转基因荧光标记种类
1. 绿色荧光蛋白(GFP)
GFP最早是从绿色发光水母中分离出来的,它是最常用的荧光标记蛋白。

GFP能够在紫外光或蓝光激发下发出绿色荧光。

2. 红色荧光蛋白(RFP)
RFP来源于非绿藻类,能够在绿光或黄光激发下发出红色荧光。

常用的有DsRed、mCherry等。

3. 黄色荧光蛋白(YFP)
YFP是GFP的突变体,在紫外光或蓝光激发下发出黄色荧光。

常用的有Venus、Citrine等。

4. 蓝色荧光蛋白(BFP)
BFP来源于部分珊瑚类生物,在紫外光激发下发出蓝色荧光。

常用的有EBFP、EBFP2等。

5. 红外荧光蛋白(IFP)
IFP来源于细菌光感蛋白,能够在近红外光激发下发出红外荧光。

常用的有iRFP等。

这些荧光标记蛋白广泛应用于细胞生物学、分子生物学等研究领域,用于标记和追踪蛋白质的表达和定位、观察细胞活动等。

不同颜色的荧光蛋白还可以进行多重标记,同时观察多种蛋白质或细胞成分。

十大神奇转基因动物图片1:荧光鼠2007年末，荧光鼠脑细胞的图片传遍世界各地，从“福利客”超市的宣传海报到“自然”杂志的封面。

这些五彩斑斓的脑细胞是单个的神经元，鲜艳的色彩帮助科学家将它们区分开来。

英国哈佛大学的杰夫-里奇曼为首的科研小组在实验鼠的基因组中导入水母的绿色荧光蛋白基因，使其在紫色光线的照射下呈现出绿色荧光。

这种绿色荧光基因对小鼠无害，只起到标记作用。

图片2:蜘蛛羊我们所有人都听说过蜘蛛侠，但是你听过蜘蛛山羊吗？这种转基因山羊是独一无二的，因为它们能产生普通的蜘蛛丝。

这种构成蜘蛛网的同样物质由它们的乳腺产生。

很多科学家把蜘蛛丝叫做“生物钢”，有着超强的抗张强度。

研究人员称，如果把很多蜘蛛丝拧成一股绳的话，它足够强韧，可制成防弹背心、降落伞绳，或者从飞机到航母等设备。

蜘蛛丝还可被制成人造韧带和人造腱，支撑组织、骨骼和神经细胞，让它们在生长期间保持稳定。

随着细胞的逐渐生长，这些人造丝部分会逐渐分解。

但蜘蛛与蚕不同，把很多蜘蛛放在一起它们会彼此蚕食。

因此，科学家始终致力于想出集中生产蜘蛛丝的方法。

帮助“生产”这些山羊的怀俄明大学分子生物学家兰迪-刘易斯说：“从概念上讲，这个过程非常简单。

用于丝蛋白的蜘蛛丝基因与控制蛋白质构成组织的山羊的DNA有关。

在这种情况下，它是乳腺，只形成于哺乳期。

然后，细胞与卵结合生成胚胎，胚胎有着合成其DNA的基因。

当母羊开始分泌乳汁时丝蛋白就产生了。

”图片3:抗癌老鼠美国研究人员通过一项新技术，使得老鼠具有了抵抗各种癌症的能力，而这个科学突破将使癌症患者有望接受无副作用的治疗。

这些老鼠内产生的一种蛋白质是未来疗法的关键，它能消灭肿瘤细胞，却不会伤害体内的健康组织。

通常情况下，一般的癌症治疗会使患者出现疼痛、恶心和掉头发等情况。

科学家们希望有朝一日把这种蛋白质用于癌症患者身上，使他们摆脱这些痛苦。

这个突破取决于一种叫P ar-4的老鼠基因，它生产这种蛋白质。

研究人员让一组老鼠拥有比正常情况下更多的蛋白质。