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色谱基本分离模式2

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色谱分离法(二)

色谱分离法(二)

色谱分离法（二）12.6.4凝胶色谱技术(GPC) 凝胶色谱技术又称为空间排阻色谱法(SEC)，也称为分子排阻色谱法，是20世纪60年月初进展起来的一种迅速而又容易的分别技术，因为设备容易、操作便利，不需要有机溶剂，在对高分子物质有显著的分别效果。

目前已被广泛用于生化学、分子免疫学以及医学等有关领域。

凝胶色谱法系指其所用的固定相是称为凝胶的多孔性填料。

混合物随流淌相经固定相(凝胶)的色谱柱时，混合物中各组分按其分子大小不同而被分别的技术。

固定相是一种不带电荷的具有三维空间的多孔网状结构的物质，凝胶的每个颗粒的细微结构就如一个筛子，小分子可进入凝胶网孔，而大分子则排阻于凝胶颗粒之外。

囫囵色谱过程普通不变换洗脱液。

其原理12-10所示。

图12-10 凝胶色谱分别法原理将有一定量的含有不同大小分子的混合原料加在柱上并用流淌相洗脱，大分子物质因为直径较大，不易进入凝胶颗粒的微孔，而只能分布于颗粒之间，因此大分子在凝胶床内移动距离较短，在洗脱时向下移动的速度较快。

而中等大小的分子物质除了可在凝胶颗粒间隙中蔓延外，还可以进入凝胶颗粒的微孔中，但不能深化，凝胶对其阻滞作用不强，将会在大分子之后被洗脱下来。

最后小分子物质能够进入凝胶相内，在向下移动的过程中，会由一个凝胶内蔓延到颗粒间隙后再进入另一凝胶颗粒，如此不断地进入和蔓延，易知小分子物质的下移速度小于前两种物质，最后出柱中所示。

这样混合样品在经过色谱柱后，各组分基本上按分子大小受到不同阻滞而先后流精彩谱柱，从而实现分别的目的。

按照流淌相的不同，凝胶色谱分别法可分为以有机溶剂为流淌相的凝胶渗透色谱法(GFC)和以水或缓冲液为流淌相的凝胶过滤色谱法(GPC)。

GFC有如硅胶和玻璃珠等无机填料，琼脂糖凝胶、交联葡聚糖凝胶和聚丙烯酞胺凝胶等，适用于水溶性高分子的分别。

GPC所用填料有聚苯乙烯凝胶、聚乙酸乙烯酯、聚甲基丙烯酸酯凝胶等，主要适合于脂溶性高分子的分别。

总的来说凝胶色谱法具有操作便利，不会使物质变性，适用于不稳定的化合物，凝胶第1页共3页。

色谱分离-2

色谱分离-2
配系数与分配比都是衡量色谱柱对组分保留能力的 参数，数值越大，该组分的保留时间越长。
意义： 溶质流过色谱柱时，K大的组份通过色 谱柱所需要的时间长，K小的组份需要的时 间短。 当样品中各组份在两相的m不同时， 就能实现差速迁移，达到分离的目的。
2、基线：在实验条件下，色谱 柱仅有纯流动相进入检测器 时的流出曲线称为基线。 3、峰高：色谱峰顶与基线间的 垂直距离，以h表示。 4、保留值： A 死时间tm：不被固定相吸附或 溶解的物质进入色谱柱时， 从进样到出现峰极大值所需 的时间。因为物质不被固定 相吸附，故其流动速度将与 流动相的流动速度相近： B保留时间tr ：试样从进样到柱 后出现峰极大点时所经历的 时间。 C 调整保留时间tr’： .
GFC可分离系统体积介于V0和Vt之间的溶
质，分离精度有限，料液处理量也很小，只有
当料液体积小于两溶质的洗脱体积差，才有可
能完全分离。
二、 凝胶层析的操作
（1）凝胶的处理 葡聚糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶以干品出售的，所 以在使用前必须溶胀。可以将它们浸泡在洗脱剂中， 慢慢搅拌。 洗脱剂应具有一定的离子强度（约为0.08）。这 是因为大多数凝胶都含有少量羧基，如果洗脱剂的离 子强度低于0.08，少量羧基不能被屏蔽，凝胶颗粒就 具有离子交换性质，从而改变溶质的分配系数。
将色谱柱视为精馏塔，即色谱柱是一系列连续的、 相等的水平塔板组成。 每一块塔板高(plate high)为H。 假设在每一块塔板上，溶质在两相间很快达到分 配平衡，然后随着流动相按一个一个塔板的方式向前 转移。对一长为L的色谱柱，溶质平衡的次数应为：
n称为 理论塔板数 (theoretical plate number)。 与精馏塔一样，色谱柱的柱效 随理论塔板数n的 增加而增加，随塔板高H的增大而减小。

薄层色谱法分离有机化合物2[重点]

薄层色谱法分离有机化合物2[重点]

薄层色谱法分离有机化合物一、实验目的1.学习薄层色谱法、纸色谱法、柱色谱法分离有机化合物的原理；2.掌握薄层色谱法分离有机化合物的方法。

二、实验原理 我们有机实验过程中经常要合成一些有机化合物，纯度相对较低，要进行下一步反应必须进行提纯，通常的提纯手段（可先问学生，再总结）：重结晶、萃取法、色谱法、减压蒸馏、蒸馏、水蒸气蒸馏、分馏等，色谱法就是其中之一，通常用来分离、纯化和鉴定有机化合物。

基本原理就是利用待分离各组分在某一物质中的吸附或溶解性能（即分配）的不同 ，使混合物溶液流经过该种物质，进行反复吸附或分配等作用，分开各组分。

按照操作条件不同分为：柱色谱、纸色谱、薄层色谱、气相色谱及高效液相色谱等，今天介绍柱色谱、纸色谱、薄层色谱，操作薄层色谱。

柱色谱：利用色谱柱 （1）色谱柱（2）吸附剂（3）溶剂（1）色谱柱（拿根柱子介绍）（2）吸附剂：吸附剂：表面积很大、经过活化的多孔性或粉状固体（常用氧化铝、硅胶、氧化镁、碳酸钙、活性炭等：（3）溶剂，先考虑被分离各组分的极性和溶解性，非极性化合物用非极性溶剂，先溶解在非极性溶剂中，从柱顶加入柱中，再用稍有极性的溶剂使谱带色，再用极性更大的溶剂洗脱被吸附物质简单介绍操作（1）装柱（2）装样，将待分离各组分的混合物溶液从上端装入色谱柱，流过吸附柱时，停在上端（3）洗脱 利用吸附能力不同，流下去的洗脱速度不同，形成不同层次（即有若干色带），再用不同的洗脱剂洗下不同组分分开收集；纸色谱：主要用于多官能团或高极性化合物如糖、氨基酸等的分析分离（1）固定相：特制滤纸（2）溶剂：水和有机溶剂的混合物(3)展开剂：含一定比例水的有机溶剂简单介绍操作（1）选择固定相特制滤纸（2）溶解待分离各组分（3）划线：在滤纸一端2~3cm 处用铅笔画好起始线，（4）点样：将待分离组分溶液用毛细管在起始线上点一点样点，（5）展开：将滤纸划好的线前端的滤纸接触到展开剂，展开剂利用毛细管作用沿纸条上升，当有机相沿滤纸经过原点时，即在滤纸上水与流动相多次分配，流动相中溶解度较大的物质随溶质移动速度较快，在水中溶解度较大的物质则随溶剂移动速度较慢，则达到分离目的，展开剂前沿接近滤纸另一个端点时取出，标出展开剂位置。

色谱技术2

色谱技术2

④Glajch三角形优化法：确定溶剂强度及选择性
Glajch据统计方法，提出在三角形座标图上，选择7或10个具有不同
选择性及等洗脱强度的有代表性的溶剂系统，作为优化过程的实验 溶剂。
二、色谱柱
（一）柱子的日常维护
１．色谱柱的性能指标
①某所测k’值的最小塔板数（测试报告） ②最大峰的不对称因子fs（0.9～1.1）
３．不能用pH超过2～8.5的含水流动相保存柱子；
流动相pH2.5～7（反相柱，硅胶为基质）
6M的NaOH 50～100μl即可将硅胶溶解
４．柱子的冲洗:
H2O 、MeOH或ACN i-ProOH:CHCl3=1:1
再生H2O→MeOH→CH3Cl→THF→CH3Cl→MeOH（每种溶剂：

②溶剂的选择性
使用质子接受体溶剂，质子给予体样品分子将优先保留在流动相中； 而使用一个偶极矩较大的溶剂，带有强偶极官能团的样品分子将优
先保留在流动相中； 使用质子给予体溶剂（如甲醇），质子接受体样品分子更易保留在 流动相中；
③系统方法的选择性的优化


选择一组溶剂（A、B），使之溶剂强度控制组分的 k’2～5之间； 选择三角形分类中组别相差较远的溶剂，代替A、B， 使其溶剂强度不变，改变选择性； 若A为极性溶剂，B为非极性溶剂，一般改变A对流动 相选择性影响较大，因为极性溶剂与样品分子之间产 生的强相互作用将会掩盖由非极性溶剂所产生的类似 作用。 但样品中含有折光率相差很大（色散作用不同）的非 选择性组分时，情况不同。用折光率n不同的非极性溶 剂来代替初始溶剂A，也许能有效地改变选择性。如 环戊烷（n=1.404）或二硫化碳（n=1.624）可以用正 己烷(n=1.372)代替。

第6章色谱分离技术ppt课件

第6章色谱分离技术ppt课件
5.吸附薄层色谱法
（thin layer chromatography, TLC） 薄层色谱法：将吸附剂或支持剂均匀的铺在 玻璃板上，铺成一薄层，然后把要分离的样品 点到薄层的起始线上，用合适的溶剂展开，最 后使样品中各组分得到分离。
在 日 常 生 活 中，随 处都可 以看到 浪费粮 食的现 象。也 许你并 未意识 到自己 在浪费 ，也许 你认为 浪费这 一点点 算不了 什么
交换吸附： 吸附剂表面如果由极性分子或离子组成，则会 吸引溶液中带相反电荷的离子形成双电层，同时 放出等物质的量的离子，发生离子交换。
离子的电荷是决定因素，离子所带电荷越多， 在吸附剂表面的相反电荷点上的吸附力越强。
电荷相同的离子，水化半径越小，越容易被吸 附。
在 日 常 生 活 中，随 处都可 以看到 浪费粮 食的现 象。也 许你并 未意识 到自己 在浪费 ，也许 你认为 浪费这 一点点 算不了 什么
缺点： 处理量小、操作周期长、不能连续操作，因此 主要用于实验室，工业生产上应用较少。
在 日 常 生 活 中，随 处都可 以看到 浪费粮 食的现 象。也 许你并 未意识 到自己 在浪费 ，也许 你认为 浪费这 一点点 算不了 什么ຫໍສະໝຸດ 3.色谱法的分类吸附色谱法
分配色谱法
分离机理
离子交换色谱法 凝胶色谱法 亲和色谱法
将待分离的样品溶液点在薄层板的一端，在密 闭的容器中用适宜的溶剂（展开剂）展开。
在 日 常 生 活 中，随 处都可 以看到 浪费粮 食的现 象。也 许你并 未意识 到自己 在浪费 ，也许 你认为 浪费这 一点点 算不了 什么
当溶剂流过时，不同物质在吸附剂和展开剂之 间发生连续不断的吸附、解吸附、再吸附、再解 吸附。
为了增加薄层的牢固性且易于保存，可在涂布过程 中加入某些黏合剂。如羧甲基纤维素钠（CMC-Na）

第十二章色谱分离

第十二章色谱分离

三、生物工业中的色谱分离
色谱和电泳是目前所知最好的两种分离方法， 其塔板数可达百万数量级。 1、色谱分离的规模 根据分离时一次进样量的多少，色谱分离 的规模可分为如下 4类： 色谱分析：＜ 10 mg 半制备（或称中等规模制备）：10～50mg 制备 （或称样品制备）：0.1～ 10 g 工业生产：＞ 20 g
二、色谱分离分类
按固定相形状不同分类 1、柱色谱分离 2、纸上色谱分离 以滤纸为载体的分配色谱，滤纸纤维能 吸附25%-29%的水分，其中6%-7% 以氢键与纤维素的羟基结合。而滤纸纤维 与有机溶剂的亲和力甚弱。 纸上色谱分离是以滤纸纤维及其结合 水为固定相，以有机溶剂为流动相的。可 用于定性和定量分析。
凝胶颗粒的全部孔隙即使大小不同也不能分开； 它们的下行速度慢。鉴于上述原理，凝胶层析 可用于重组蛋白溶液脱盐、分子量测定以及分 离纯化。
四、凝胶色谱
1、凝胶层析原理
凝胶层析的几种原理
1、平衡排阻原理
2、扩散分离理论
3、流动分离理论
分离过程
4、凝胶层析的特点
5、凝胶的结构和性质
非专业性洗脱
外源基因表达产物的分离纯化
A 重组蛋白分离纯化方法选择的基因原则
针对不同的产物表达形式采取不同的策略
针对不同性质的重组蛋白选择不同的层析类型
多种分离纯化技术的联合运用
合适分离纯化介质的选择
分离纯化过程的规模化
针对不同的产物表达形式采取不同的策略
采用分泌型战略表达重组蛋白，通常体积大、浓度低， 因此应在纯化之前采用沉淀或超滤等方法先进行浓缩处理
2、分配色谱
Distribution chromatography,DC
又称为液液色谱，其原理是利用混合 物中各物质在两液相中的分配系数不同而 分离。 分配色谱可分为 正相色谱和反相色 谱。

十二章 色谱分离


谱进行分离较为适宜。
氨基酸、有机酸、核苷酸等一些离子型化合物的生产多用离子交换色 谱分离； 抗生素、生物碱、萜类、色素等次级代谢产物多采用吸附色谱或反相 分配色谱分离。
三、分析色谱与制备色谱 及工业色谱的比较
1、应用色谱技术范围的不同：
制备和工业色谱主要是采用以液相为流动相的柱色谱。
2、操作上的不同： 制备和工业色谱中，则要求进样量越多越好，色谱柱 也应适当大些。 3、色谱分离理论上的不同：
凝胶色谱以凝胶为固定相，是一种根据各物质分子大小不同而 进行分离的色谱技术，又称为分子筛色谱（Molecular Sieve Chromatography，MSC）、空间排阻色谱或尺寸排阻色谱 （Size Exclusion Chromatography，SEC）。
凝胶是一种不带电荷的具有三维空间的多孔网状结构的物质，凝胶的每个 颗粒的细微结构就如一个筛子。当混合物随流动相流经凝胶柱时，较大的 分子不能进入所有的凝胶网孔而受到排阻，它们将与流动相一起首先流出， 较小的分子能进入部分凝胶网孔，流出的速度较慢，更小的分子能进入全 部凝胶网孔，而最后从凝胶柱中流出。
故亲和色谱被广泛用于酶、治疗蛋白、抗体、核 酸、辅助因子等生物大分子以及细胞、细胞器、病
无机吸附剂在有机大分子色层分离中的实用例子— —丝裂霉素的精制。
丝裂霉素的发酵滤液用活性炭吸附，丙酮洗脱， →蒸去丙酮的浓缩水溶液，用氯仿萃取。
→氯仿萃取液上氧化铝柱，先用氯仿冲洗，能部分分带，
→接着以氯仿－丙酮（3:2）展开，约2小时后，能分出色层，其中蓝 紫色色带为有效成分丝裂霉素C。
→将柱推出，切取蓝紫色部分，用10％甲醇－氯仿洗脱，减压蒸干，
薄层色谱分离 ，将固定相在玻璃平板上铺成薄层而进行分离的一种分

2.2.46色谱分离技术

气相色谱法
固定相： — 柱长： ± 70 %， — 柱内径：± 50%，
— 颗粒大小：最多减小 50%，不允许增加， — 薄膜厚度：-50% 到+100% 流速：± 50% 温度：± 10% 进样体积：只要满足待测峰的重现性和检测，可以减小。 超临界流体色谱法 流动相组成：对于填充柱，无论哪个值较大次要溶剂组分量可以以相对值 ±30%或绝对值±2% 进行调节。其余组分的调节不多于 10%的绝对调节。对于毛 细管色谱柱系统，不允许调节。 检测波长：不允许调节 固定相 — 柱长： ± 70 %， — 柱内径： ± 25% （填充柱） ± 50% （毛细管柱） — 颗粒大小：最多减小 50%，不允许增加 流速：± 50% 温度：± 10% 进样体积：只要满足待测峰的重现性和检测，则可以减小 定量 — 检测器响应：检测器灵敏度是进入检测器的流动相中每单位浓度或 每单位质量的物质的信号输出。相对检测器响应因子（通常指响应因子）表示 相对于标准物质检测器的灵敏度。校正因子是响应因子的倒数。 — 外标法。待分析物的浓度通过比较由测试液获得的响应值（峰值） 和由参考溶液获得的响应值（峰值）得到。 — 内标法。将等量的待测物（内标物）中不含的组分加入到测试液和 对照液中。内标物不应与待测物反应；性质稳定，不含有与待测物具有相同保 留时间的杂质。通过比较测试液与对照液中由待测物和内标物的峰面积或峰高 的比值，得到待测物的浓度。
tR2 = 待测峰的保留时间, tR1 = 参照峰的保留时间（通常是相应于供试品的色谱峰） tM = 沿基线自进样点到相应的保留组分色谱峰最高点与基线的垂
直交点的滞留时间或距离
未调整的相对保留值(rG)由下面的式子得出：
除非另有说明，各论中的相对保留值均相应于未调整的相对保留值。 平面色谱法中，常用滞留因子 RF2，RF1 而不是 tR2，tR1. 定量精密度 信噪比 信噪比(S/N)影响定量精密度，可由下列方程计算：

2色谱法分离原理

2色谱法分离原理色谱法是一种广泛应用于化学分析和生物分离的重要技术。

它基于物质在固定相和流动相相互作用的差异，通过在流动相中分离目标物质，进而实现对混合物成分的分析和纯化。

色谱法分离原理主要包括静相分离和动相分离两个方面。

静相分离是利用静止相（也称为固定相或吸附相）与流动相中的溶质发生相互作用，既以各种形式给溶质“限制”其移动速率，从而实现分离的目的。

静相常常是一种吸附剂，如硅胶、活性炭、酒石酸等，也可以是离子交换树脂、凝胶等。

在静相分离中，样品会在静止相中相互竞争吸附，而吸附量的差异导致了物质的分离。

动相分离主要是利用溶质在流动相中分子排序和迁移速度的差异。

流动相可以是气体（气相色谱）或液体（液相色谱），在传统的色谱法中，液相色谱是最常用的。

在液相色谱中，样品在流动相的带动下，根据不同物质在液相中溶解度、分配系数和扩散速度等的不同，通过固定相与流动相之间的相互作用，实现物质的分离和分析。

在液相色谱中，分离过程主要包括吸附色谱和分配色谱。

吸附色谱是指流动相通过固定相时，溶质在流动相和固定相之间的吸附和解吸作用。

这种作用是非均相平衡过程，物质会在固定相表面发生吸附，而吸附和解吸速度的差异导致物质的分离。

常见的吸附色谱有薄层色谱和柱层析等。

分配色谱是指流动相在固定相间形成溶解，并通过流动相和固定相之间的分配作用实现溶质的分离。

分配色谱是基于溶质在两相中分布系数不同的原理进行的。

溶质在固定相和流动相之间以不同的比例分配，根据这种差异来实现物质的分离和分析。

常见的分配色谱有反相色谱、离子色谱和极性色谱等。

除了上述静相和动相分离原理外，还有一些常用的色谱法，如气相色谱和毛细管电泳等。

气相色谱利用气体流动相，将揮发性物质带动溶质在气体相中的迁移来实现分离和鉴定。

毛细管电泳利用电荷作用和流体流动，使目标物质在液体流体介质中迁移，并根据其迁移速率和方向差异，实现对物质分离的一种方法。

总的来说，色谱法是一种基于固定相和流动相相互作用差异的分离技术。

色谱分离方法

此外，对于碱性物质可发生不可逆吸附。因此， 对一些碱性物质在使用硅胶进行层析时，有必要进行 预实验。
如在硅胶中拌入15％左右的硝酸银，这种加硝酸 银的硅胶对有机物中不饱和键有特殊的吸附性，因此 ，常用它分离一些不饱和化合物。
柱色谱（Column Chromatography）
3.2 洗脱剂的选择
选择原则：
凝胶 凝胶基质 珠
小分子 大分子
凝胶过滤层析过程示意图
凝胶色谱
❖ 单次展开法和多次展开法 ❖ 单向展开法和双向展开法
吸附色谱 显色
❖ 显色也称定位，即用某种方法使经色谱展开后的 混合物斑点呈现颜色，以便观察其位置
(1) 紫外线照射法 (2) 喷雾显色法 (3) 碘蒸汽显色法 (4) 生物显迹法
柱色谱
洗脱液
样品 填充物 玻璃柱
分部收集
柱色谱（Column Chromatography）
❖ 薄层色谱法选择的主要吸附剂为氧化铝、硅胶和聚酰 胺。色谱用的吸附剂要求一定的形状与粒度范围，不 同吸附剂用于分离不同类型的化合物。吸附剂还必须 具有一定的活度，活度太高或过低都不能使混合物各 组分得到有效的分离。
吸附色谱
展开剂
❖在吸附色谱中，组分的展开过程涉及吸附剂、被 分离化合物和溶剂三种之间的相互竞争。其基本 原则主要有两个：①展开剂对被分离组分有一定 的解吸能力，但又不能太大。②展开剂应该对被 分离的物质有一定的溶解度。
3.1 吸附剂的选择
实验室常用
氧化 铝
硅胶
氧化 活性 镁炭
吸附剂要求： 不能与被分离的物质和展开剂发生化学作用 吸附剂的粒度大小要均匀
柱色谱（Column Chromatography）
⑴ 氧化铝（alumina）
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4. CE中电渗流的流形
电荷均匀分布，整体移动，电渗流的流动为平流，塞式 流动（谱带展宽很小）；
液相色谱中的溶液流动为层流，抛物线流型，管壁处流 速为零，管中心处的速度为平均速度的2倍（引起谱带展宽 较大）。
5. CE中电渗流的作用
电渗流的速度约等于一般离子电泳速度的5～7倍；
各种电性离子在毛细管柱中的迁移速度为： ν ν ν
ap=μap
E
CE中的参数与关系式
parameters and relation in HPCE
1.迁移时间（保留时间）
CE兼具有电化学的特性和色谱分析的特性。有关色谱 理论也适用。
t Lef
ap

Lef
ap E

Lef L
ap V
V—外加电压；L—毛细管总长度；
一、 简介
毛细管电泳（Capillary Electrophoresis, CE)又称高效毛细 管电泳(HPCE)，是以毛细管为分离通道，以高压电场为驱 动力的新型液相分离分析技术。
毛细管电泳技术在八十年代得以迅速发展，是分析科学中继 高效液相色谱之后的又一重大进展，也是近年来分析化学中 发展最为迅速的领域之一。 目前，在药物分析、临床医学、生命科学、以及从小分子、 离子到单细胞分析的一系列领域得到了广泛的应用。
Lef —毛细管有效长度； teo—电渗流标记物（中性物质）的迁移时间。
CE中电渗流的方向
电渗流的方向取决于毛细管内表面电荷的性质： 内表面带负电荷，溶液带正电荷，电渗流流向阴极； 内表面带正电荷，溶液带负电荷，电渗流流向阳极； 石英毛细管；带负电荷，电渗流流向阴极；
改变电渗流方向的方法：
（1）毛细管改性 表面键合阳离子基团； （2）加电渗流反转剂 内充液中加入大量的阳离子表面活性剂，将使石英毛细 管壁带正电荷，溶液表面带负电荷。电渗流流向阳极。
小了温度效应，使电场电压可以很高。
• 电压升高，电场推动力大，又可进一步使柱径变小， 柱长增加。
• 高效毛细管电泳的柱效远高于高效液相色谱，理论塔
板数高达几十万块/米，特殊柱子可以达到数百万。
经典电泳技术与现代微柱分离技术完美结合的 产物，兼有高压电泳及高效液相色谱的优点
二、毛细管电泳基本原理
Basic principles of CE
2. CE中的电渗现象与电渗流
石英毛细管柱，内充液pH>3时，表面电离成-SiO-,管 内壁带负电荷，形成双电层。
在高电场的作用下，带正电荷的溶液表面及扩散层向阴
极移动，由于这些阳离子实际上是溶剂化的，故将引起柱中 的溶液整体向负极移动，速度ν
电渗流。
3. CE中电渗流的大小与方向
电渗流的大小用电渗流速度ν 度μeo和电场强度E。即
2.分离效率（塔板数） 在CE中，仅存在纵向扩散，σ 2=2Dt
n
apVLef
2 DL

ap ELef
2D
;
扩散系数小的溶质比扩散系数大的分离效率高，分离生 物大分子的依据。
t n 5.54 R Y 1/ 2
2
3.分离度
R 0.177
apVLef
第三章 色谱基本分离模式
Basic chromatographic modes
3.1 气相色谱 3.2 高效液相色谱 3.3 毛细管电泳 凝胶电泳 等速电泳 手性毛细管电泳 毛细管电色谱
• • • • • • •
简介 毛细管电泳的基本原理及特点 仪器流程及主要部件 毛细管电泳的分离模式 CE相关技术 毛细管电泳的应用与发展动向 毛细管电泳发展趋势
1.纵向扩散的影响
在CE中，纵向扩散引起的峰展宽：σ 2=2Dt
由扩散系数和迁移时间决定。大分子的扩散系数小，可 获得更高的分离效率，大分子生物试样分离的依据。
2.进样的影响
当进样塞长度太大时，引起的峰展宽大于纵向扩散。分 离效率明显下降；理想情况下，进样塞长度： Winj= (24D t )1/2 实际操作时进样塞长度小于或等于毛细管总长度的1%～2%。
电泳是指带电离子在电场中的定向移动，不同离子具有 不同的迁移速度，迁移速度与哪些因素有关？ 当带电离子以速度ν 在电场中移动时，受到大小相等、 方向相反的电场推动力和平动摩擦阻力的作用。
电场力：FE = qE
阻 力：F = fν 故： qE = fν
q—离子所带的有效电荷； E —电场强度； ν—离子在电场中的迁移速度；
加入不同阳离子表面活性剂 来控制电渗流。 加入阴离子表面活性剂，如 十二烷基硫酸钠（SDS），可以使 壁表面负电荷增加，zeta电势增 大，电渗流增大； （3）加入有机溶剂如甲醇、乙腈， 使电渗流增大。
淌度
Mobility
淌度：带电离子在单位电场下的迁移速度； 淌度不同是电泳分离的基础。
1.绝对淌度(absolute mobility)μab
毛细管电泳发展史上的里程碑
电泳--
在电解质溶液中，位于电场中的带电离子在电
场力的作用下，以不同的速度向其所带电荷相反的电极方向 迁移的现象，称之为电泳。由于不同离子所带电荷及性质的 不同，迁移速率不同，可实现分离。 1937年，Tiselius将蛋白质混合液放在两段缓冲溶液之 间，两端施以电压进行自由溶液电泳，第一次将人血清提 取的蛋白质混合液分离出白蛋白和α 、β 、γ球蛋白； 发现样品的迁移速度和方向由其电荷和淌度决定；
焦耳热：毛细管溶液中有电流通过时，产生的热量； HPCE中的焦耳热与背景电解质的摩尔电导、浓度及电场 强度成正比。 温度每变化1，将引起背景电解质溶液黏度变化2%～3%；
5. 添加剂的影响
（1）加入浓度较大的中性盐，如K2SO4，溶液离子强度增大， 使溶液的黏度增大，电渗流减小。
（2）加入表面活性剂，可改变电 渗流的大小和方向；
无限稀释溶液中带电离子在单位电场强度下的平均迁移 速度，简称淌度。可在手册中查阅。
2.有效淌度(effective mobility)μef
实际溶液中的淌度(实验中测定的)。 μef=∑aiμi
ai —溶质i
的解离度；μi —溶质i 在解离状态下的绝对淌度
3.表观淌度 μap 离子在实际分离过程中的迁移速度（表观迁移速度）： ν
电中心作用，浓度约为溶质的100-1000倍时，抑制对蛋白质 吸附，又不增加溶液电导，对电渗流影响不大。
DL
平均
平均
ap1 ap2
2
影响分离度的主要因素；工作电压V；毛细管有效长度 与总长度比；有效淌度差。分离度可按谱图直接由下式计算：
2(t 2 t1 ) R W2 W1
影响分离效率的因素—区带展宽
factors inຫໍສະໝຸດ luenced the efficiency—band broadening
第一次的自由溶液电泳；第一台电泳仪；
1948年，获诺贝尔化学奖。
1983年 Hjerten先后提出了毛细管凝胶电泳和毛细管等电 聚焦电泳，大幅提高了分离效率，操作自动化，便于定性和 定量。

1984年 Terabe将胶束引入毛细管电泳，开创了毛细管电 泳的重要分支：胶束电动毛细管色谱（MEKC）。
电渗流表示，取决于电渗淌
ν
电渗流
= μeo E
0ε
电渗淌度取决于电泳介质及双电层的Zeta电势，即 μeo = ε
ξ /η
η
ε 0—真空介电常数；ε —介电常数；ξ —毛细管壁的Zeta电势。
ν ν
电渗流
= ε 0ε ξ E / = Lef/teo
实际电泳分析，可在实验测定相应参数后，按下式计算
电渗流
1999年
加入国际基因组学研究
逐渐成为标准和常规的研究方法， 进入“寻常百姓”家！
经典电泳分析 &毛细管电泳分析
traditional electrophoresis & capillary electrophoresis 利用电泳现象对某些化学或生物物质进行分离分析的方 法和技术叫电泳法或电泳技术。 电泳是指带电离子在电场中的定向移动， 不同离子具有不同的迁移速度
毛细管电泳（CE）的发展历史

1937年 A. Tiselius 提出移界电泳
诺贝尔奖

1967年 Hjerten最先提出在直径为3mm的毛细管中做自由 溶液的区带电泳
毛细管电泳的起点

1981年 Jorgenson和Lukacs使用了75um的毛细管柱，用荧 光检测器对多种组分实现了分离，提出了现在的毛细管 电泳技术。
按形状分类：U型管电泳、柱状电泳、板电泳；
按载体分类：滤纸电泳、琼脂电泳、聚丙烯酰胺电泳、 自由电泳；
传统电泳分析：操作烦琐，分离效率低，定量困难，无 法与其他分析相比。
高效毛细管电泳在技术上采取了两项重要改进 ：
一是采用了小内径的毛细管；
二是采用了高达数万伏的电压。
• 毛细管的采用使产生的热量能够较快散发，大大减

1988~1989年 商品化的毛细管电泳仪推出，毛细管电泳 技术迅速发展起来。

1989年 第一届国际毛细管电泳会议召开。 一门新的分支学科的产生
我国CE技术的发展
1984年 由竺安教授首先启动 中科院化学学院&浙江大学
1986年
1993年
陆续在有关会议和杂志上发表研究结果
第一届全国毛细管电泳学术研讨会
4.溶质与管壁间的相互作用
存在吸附与疏水作用，造成谱带展宽； 蛋白质、多肽带电荷数多，有较多的疏水基，吸附问题 特别严重，是目前分离分析该类物质的一大难题。 细内径毛细管柱，一方面有利于散热，另一方面比表面 积大，又增加了溶质吸附的机会。 减小吸附的方法和途径：加入两性离子代替强电解质，