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第七章定点诱变第七章定点诱变［本章摘要］突变有重复、缺失、倒位、易位四种类型。
定点诱变主要是关于：简单的插入或缺失，单个碱基的置换以及系统的缺失、插入或成串碱基的置换。
寡核苷酸介导的定点诱变主要是对单个或少数几个碱基的操作；外切核酸酶Ⅲ、BAL31、DNase Ⅰ介导嵌套缺失，可以得到系列缺失体。
第一节：寡核苷酸介导的诱变70年代初j×174 DNA （ss DNA 5386bp），当用带琥珀突变的ssDNA 与变性的野生型DNA片段一起转染细菌时，观察到“标记获救”现象。
即产生带野生型基因组的噬菌体，原因是野生型DNA 片段与突变体的相应序列退火，形成错配的异源双链体，后者可被宿主编码的错配修复系统转变为全长的野生型基因组。
由此可利用突变的DNA 片段将突变引入到野生型DNA 中。
一、Kunkel法或称“U” 法1．背景介绍dut-dUTP 酶缺陷，细胞不能把dUTP 转化为dUMP ，因此细胞内dUTP 的含量大为增加，其中一些dUTP 可掺入DNA 中正常情况下由胸苷嘧啶占据的位置。
ung -UDG 酶缺陷，UDG 酶[尿嘧啶（uracil）-N-糖基化酶（glycosylase）]可除去掺入DNA 中的尿嘧啶残基。
2．原理Kunkel 法原理如图7-1 所示，过程包括：①当目标DNA 插入phagemid 载体并进入E.coli CJ236 后。
②由于该菌体ung- dut-突变，合成的DNA 上含有少量尿嘧啶（取代胸腺嘧啶）。
③M13K07 辅助感染下，产生带U 的单链DNA 。
④与引入诱变的Oligo 复性。
⑤在T7DNA polymerase 和ligase 作用下，以带U 的单链DNA 为模板合成一条新链，形成杂合双链。
⑥感染dut+ung+ E.coli MV1190 后，在细胞分裂过程中，只有新合成的DNA 链才能起模板作用合成新的并引入了诱变位点的子代双链DNA 。
第七章诱变育种一、诱变育种的概念及特点二、物理诱变三、化学诱变四、诱变后代的处理五、提高诱变育种效率的方法一、诱变育种的概念及特点1、诱变育种的概念利用理化因素诱发生物体产生变异，再通过选择育成新品种或新材料的育种方法。
★物理诱变：利用辐射诱发基因突变和（或）染色体变异★化学诱变：应用化学物质诱发基因和（或）染色体变异2、特点（1）优点提高突变率，变异范围广。
突变率可达3%，比自然突变高100-1000倍。
突变类型多，还可能产生新基因。
对单一性状改良有效。
如早熟性、株高等。
多为点突变和隐性突变，易稳定，育种年限短。
●热中子：极早熟大豆哈75-222（早32天）●γ射线：原丰早水稻（早40天）●热中子（印度）蓖麻早150天（270天→120天）●大麦白粉病抗性基因mlo（2）局限有利变异少。
难以综合改良。
诱变的方向和性质尚不能控制。
▪二、物理诱变（一）物理诱变剂的种类及其性质物理诱变剂：各种辐射线。
因此，物理诱变通常称为辐射诱变。
分为：电离辐射线和非电离电离辐射线。
用于作物育种的大多是电离辐射线。
▪1、电离辐射线χ射线（伦琴射线）：最早用于诱变的射线。
20世纪20年代利用χ射线诱发玉米、大麦；1934利用χ射线育成第一个烟草突变品种Chlorina●由x光机产生，其能量和穿透力与工作电压有关。
●低电压产生软χ射线，穿透力弱，适于花粉外照射●高电压产生硬χ射线，穿透力强，适合小块组织、愈伤组织的外照射。
γ射线（丙种射线）：是一种短波长、能量高、穿透力强的电离辐射线。
目前应用最多。
●农用γ射线由放射性同位素60Co、137Cs产生，需专门的照射室(60Co源室)，严密防护，安全。
适于外照射。
●福建2处●厦门大学的佳辐占，农林大的eui水稻。
中子：不带电粒子，穿透力强，可直接进入细胞核内，适于处理种子、植株的外照射。
β射线：带电粒子, 质量小速度快，可以穿透几毫米的组织。
●育种上的β射线由放射线性同位素32P、35S产生。
第七章诱变育种诱变育种是利用理化因素诱发变异，再通过选择育成新品种的方法。
第一节诱变育种的成就及特点一、诱变育种的成就二、诱变育种的特点优点1. 提高突变率、扩大突变谱突变率：突变体占总个体数的百分率。
突变谱：各种突变类型组成突变谱。
2. 有效地改良个别性状诱变多为点突变、改变一两个基因，对主效基因控制的性状较有效，如：矮秆、早熟、抗病性。
3. 缩短育种年限诱发的变异大多为一个或少数几个主效基因的改变，稳定较快。
第二节常用物理诱变剂及其处理方法一、物理诱变剂的类别与性质紫外线X射线Γ射线粒子辐射电子束激光离子注入航天搭载航天搭载（航天育种或太空育种）育成的品种：水稻农垦58搭载卫星丰产品系ZR9搭载高空气球航育1号麦类扬麦5号搭载卫星小麦新品系蔬菜龙椒2号搭载高空气球卫星87-2离子束诱变育种离子注入引起生物产生变异，对改良数量性状效果显著。
目前在农作物诱变育种方面，离子注入改良的范围几乎涉及所有主要粮食和经济作物。
育成新品种：水稻品种 D9055和S9042小麦品种皖麦32蔬菜品种鲁番茄7号二、物理诱变剂处理方法（一）诱变处理的材料1、种子2、绿色植株3、花粉4、子房5、合子和胚细胞6、营养器官7、离体培养中的细胞和组织外照射 ---- 种子等所受的辐射来自外部的辐射源。
急性照射----采用较高的剂量率进行短时间的处理。
慢性照射----用钴（或铯）圃，每天将钴（或铯）源升到地面进行一定时间的慢性照射。
内照射---将辐射源引入生物体组织和细胞内进行照射的一种方法。
利用放射性同位素32P、35S、14C或65Zn的化合物，配成溶液进行浸渍种子，或使作物吸收，或注射茎部。
内照射的主要方法：•浸泡法•注入法•施入法•合成法（三）辐射处理的剂量①不同的科、属、种和品种，其辐射敏感性差异很大。
敏感作物：豆科作物、玉米、黑麦中等敏感作物：禾本科作物及棉花钝感作物：十字花科、亚麻、红麻、烟草②不同器官和细胞及不同发育时期、不同生理状况敏感性有差异。
