浅析基因定点诱变在蛋白质工程中的应用

蛋白质工程原理与技术蛋白质工程与原理技术1、什么是蛋白质工程？P1答：蛋白质工程（Protein engineering ）是通过对蛋白质结构与功能关系的了解，借助于生物信息学的知识和手段，利用基因定点诱变和基因重组等技术特异性地改造蛋白质的结构基因，产生具有新的特性的蛋白质的技术。

2、什么是基因定点诱变？答：就是在DNA水平上，通过对蛋白质结构基因中某个或某些氨基酸编码顺序加以改变，从而改变蛋白质结构的技术。

该技术不仅可用于改造天然蛋自质，而且可以用于确定蛋白质中每一个氨基酸在结构和功能上的作用，以收集有关氨基酸线形顺序与其空间构象和生物学活性之间的对应关系，为人工改造蛋白质提供理论依据。

3、什么是表达载体？P27答：表达载体：就是在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件（转录和翻译所必需的DNA序列，如启动子、终止子等），使外源DNA片段能够在宿主细胞中表达蛋白质。

包括原核细胞表达载体和哺乳动物细胞表达载体两类。

4、什么是克隆载体？P27答：克隆载体：在载体上插入合适大小的外源DNA片段，并引入到宿主细胞中进行大量繁殖，使外源DNA片段得到大量扩增。

5、基因克隆的基本程序？P29答：（1）获得目的基因；（2）与克隆载体连接，形成新的重组DNA分子；（3）用重组DNA分子转化受体细胞，并能在受体细胞中复制和遗传；（4）对转化子筛选和鉴定；（5）对获得外源基因的细胞或生物体通过培养，获得所需的遗传性状或表达出所需要的产物。

6、真核基因在大肠杆菌中的表达方式？（条件）P34答：基本条件：①大肠杆菌没有剪切内含子的功能，所以，真核细胞的目的基因必须来自于cDNA;②真核基因mRNA缺乏结合细菌核糖体的SD序列，因此cDNA的起始密码子(ATG)上游部分(5‘端非编码区)是无用的，必须除去。

对于一些分泌性蛋白，还应除去信号肽部分；③表达载体应是含有大肠杆菌RNA聚合酶所能识别的启动子和SD序列的大肠杆菌表达载体; ④载体上只能用大肠杆菌启动子，将外源基因克隆在启动子下游，以便大肠杆菌RNA聚合酶识别启动子，并带动真核基因在大肠杆菌细胞中转录。

20世纪80年代以来，基因克隆技术与DNA化学合成方法相结合，建立和发展了定点突变技术。

可以按照预定设计，在已知的DNA序列中增删或转换核苷酸，精确地是靶基因在特定位点发生碱基序列的变化，进而使基因表达及调控，基因产物发生相应改变。

这种快速精确的基因突变已经被广泛地应用与基因工程和蛋白质工程之中。

定点突变有多种方法，有的改变特定核苷酸，有的则是对一段最可能影响蛋白质功能的基因序列进行随机突变，产生一系列突变蛋白质。

寡核苷酸诱导的定点突变基本上分两类：一类是用单链噬菌体M13作载体的寡核苷酸介导的单链模板定点突变；另一类用双链质粒作载体，双引物法定点突变。

为了在体外导入特定的点突变，小的限制性片段可以切除，并被包含所需要突变的合成接头所替代（称为盒式诱变）。

如果不行，插入片段可以克隆到产生单链DNA的噬菌粒载体中，由所设计的错配引物指导DNA复制，产生异源双链的复制型，并在下面的复制循环中产生野生型和突变的复制型。

单链噬菌体作载体的定点突变的基本原理是，用已知序列的环状DNA变性后为模板，人工合成一段引物，将所要设计的定点突变寡核苷酸置于引物中，也就是说人工所合成的引物不是完全和模板互补，而是在某个位点有意识地让碱基突变，和模板上的碱基不能配对，由于其他的碱基是互补的，所以任然可以通过复性，使引物和模板特异性结合。

在M13单链环状模板上杂交一段寡核苷酸引物，利用DNA聚合酶和连接酶的作用，从引物延伸合成链，得到一个闭合环状的异源双链分子。

由于预先在寡核苷酸引物中人为地引入碱基的错配对，插入或缺失，然后在将杂合双环DNA转化到细菌中，因此异源双链DNA经转化和筛选就可以分离到带有相应突变的DNA克隆。

由于复制是半保留复制，经克隆后将有一半的后代环状DNA产生了定点突变，另一半和正常的亲代链一样。

环状双链质粒DNA作为载体进行基因的改造有它的优点。

待改造基因中如有两个适当的限制性内切酶切点，可以用人工合成双链DNA片段置换两切点之间原有序列，在人工合成的双链DNA片段中包含有突变的序列。

基因工程与蛋白质表达随着科技的不断进步，基因工程已经成为生物科学领域的一项重要技术。

基因工程涉及到对生物体中的基因进行操作和调控，从而改变其遗传信息与表达方式。

这项技术的应用范围广泛，其中之一就是在蛋白质表达领域的应用。

本文将从基因工程与蛋白质表达的关系、基因工程在蛋白质表达中的应用和未来发展方向三个方面对这个话题进行探讨。

一、基因工程与蛋白质表达的关系基因工程和蛋白质表达密不可分。

在生物体中，基因携带了蛋白质的合成信息，而蛋白质则是基因的表达产物。

基因工程通过对基因序列的修改和调控，可以实现对蛋白质合成的精确控制。

这种精确控制使得科学家们能够大规模、高效率地制备目标蛋白质，为生物制药、工业生产等领域提供了强有力的支持。

二、基因工程在蛋白质表达中的应用1. 重组蛋白质的生产基因工程技术可以将所需蛋白质的基因序列插入到高产蛋白质的表达载体中，然后将其导入到宿主细胞或其他表达系统中进行表达。

通过这种方式，科学家们可以大量制备目标蛋白质，这对于药物研发、工业酶的生产以及新型材料的研究等有着重要的意义。

2. 蛋白质的定点突变基因工程技术可以通过基因重组和点突变来改变蛋白质的结构和功能。

例如，在药物研究中，科学家们可以通过基因工程技术对蛋白质进行修改，使其具有更好的药理特性和生物活性。

3. 糖基化蛋白的工程化表达基因工程技术可以使得在非糖基化的宿主细胞中产生糖基化蛋白。

这是因为基因工程技术可以将糖基化酶的基因插入非糖基化细胞中，从而实现对糖基化蛋白的表达。

三、基因工程与蛋白质表达的未来发展基因工程与蛋白质表达领域仍然有很大的发展空间和潜力。

1. 新型表达系统的开发目前已经存在的表达系统在某些方面还有局限性，例如蛋白质的折叠、修饰等问题。

未来的研究可以致力于开发更多的表达系统，使得科学家们能够更好地表达复杂蛋白质。

2. 定向进化技术的应用定向进化技术是一项将基因工程与进化学相结合的技术，可以通过人工干预改变蛋白质的序列与结构。

定点突变的原理及应用1. 简介定点突变（Site-directed mutagenesis）是一种通过有意诱导改变DNA的特定位置的技术。

通过改变DNA序列，可以产生新的突变型，并用于研究基因功能、蛋白质结构与功能关系、以及药物设计等领域。

本文将介绍定点突变的原理及应用。

2. 原理定点突变技术主要有两种方法：化学法和分子生物学法。

以下是两种方法的原理说明：2.1 化学法化学法主要通过碱基修饰剂来改变DNA序列。

常用的方法是使用化学修饰剂N-methyl-N-nitro-N-nitrosoguanidine (MNNG) 或nitrous acid (HNO2)处理DNA，使其发生碱基突变。

这些碱基修饰剂会引起DNA中的碱基发生氧化、甲基化、烷基化等修饰，导致DNA序列的变化。

2.2 分子生物学法分子生物学法是目前应用较广泛的定点突变方法。

主要有以下几个步骤： 1）设计引物：根据目标突变位点的上下游序列，设计引物。

2）PCR扩增：使用设计的引物进行PCR扩增，得到含有突变位点的DNA片段。

3）点突变：使用特定的酶和突变体模板进行点突变反应，使目标位点发生突变。

4）验证突变：通过测序或其他技术手段验证突变是否成功。

3. 应用定点突变技术在许多领域都有广泛的应用，包括但不限于以下几个方面：3.1 研究基因功能定点突变可以用于研究基因功能和调控机制。

通过引入特定的突变体，可以观察到基因功能的变化，进而研究基因在生物体内的作用机制。

3.2 蛋白质结构与功能关系研究蛋白质的结构与功能之间具有密切的关系。

定点突变可以通过改变蛋白质的氨基酸序列，研究蛋白质结构与功能之间的关系。

通过观察突变体的结构和功能变化，可以揭示蛋白质的结构与功能之间的关联。

3.3 药物设计与筛选定点突变技术在药物设计与筛选中也有重要应用。

通过针对特定的基因位点进行突变，可以筛选出与目标药物相互作用的突变体，从而为药物设计和筛选提供理论依据。

第4节蛋白质工程的原理和应用课标内容要求核心素养对接1.概述人们根据基因工程原理，进行蛋白质设计和改造，可以获得性状和功能符合人类要求的蛋白质。

2．举例说明依据人类需要对原有蛋白质结构进行基因改造、生产目标蛋白的过程。

1.生命观念：说明基因的碱基排列顺序—蛋白质的结构—蛋白质功能的关系。

2．科学思维：尝试通过蛋白质工程技术，根据人类需要的蛋白质结构，设计改造某一蛋白质的设计流程。

1．概念(1)基础：蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系。

(2)手段：通过基因改造或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质。

(3)目的：获得满足人类的生产和生活需求的蛋白质。

2．理论和技术条件：分子生物学、晶体学以及计算机技术的迅猛发展。

二、蛋白质工程崛起的缘由1．基因工程的实质：将一种生物的基因转移到另一种生物体内，后者可以产生它本不能产生的蛋白质，进而表现出新的性状。

2．基因工程的不足：基因工程在原则上只能产生自然界中已存在的蛋白质。

3．天然蛋白质的不足：天然蛋白质的结构和功能符合特定物种生存的需要，却不一定完全符合人类生产和生活的需要。

4．实例：玉米中赖氨酸的含量比较低，赖氨酸合成中两种酶的氨基酸被替换，就可以使玉米叶片和种子中游离赖氨酸分别提高5倍和2倍。

三、蛋白质工程的基本原理1．目标：根据人们对蛋白质功能的特定需求，对蛋白质的结构进行设计改造。

2．方法：改造基因或合成基因。

3．流程：预期蛋白质功能→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到相对应的脱氧核苷酸序列(基因)或合成新的基因→获得所需要的蛋白质。

四、蛋白质工程的应用1．在医药工业方面的应用(1)研发速效胰岛素类似物：科学家通过改造胰岛素基因使B链28位脯氨酸替换为天冬氨酸或者将它与29位的赖氨酸交换位置，从而有效抑制了胰岛素的聚合，研发出速效胰岛素类似物。

(2)提高干扰素的保存期：将干扰素分子上的一个半胱氨酸变成丝氨酸，提高了干扰素的保存时间。

定点诱变的原理和应用1. 引言定点诱变是一种基因工程技术，可以通过人为干预基因组，使其发生特定的变异。

定点诱变技术在科研、生物医药等领域具有重要的应用价值。

本文将介绍定点诱变的原理和应用。

2. 定点诱变的原理定点诱变的原理是通过人为设计和构建特定的DNA片段，然后将其导入宿主细胞中，通过一系列的分子生物学技术将该DNA片段插入到细胞染色体的目标位点上。

定点诱变技术主要有以下几个关键步骤：•设计目标位点：首先需要确定要进行定点诱变的目标位点，通常是某个特定基因或基因组区域。

•构建修饰DNA片段：根据目标位点的序列信息，设计和合成能够与目标位点配对的DNA片段。

这些DNA片段通常包含所需的突变基因或序列。

•导入宿主细胞：将修饰DNA片段导入宿主细胞中，常用的方法有电转化、化学法和病毒介导的转导等。

•插入目标位点：通过一系列的分子生物学技术，将修饰DNA片段插入到细胞染色体的目标位点上。

常见的方法有CRISPR/Cas9技术、基因敲除、基因转座等。

3. 定点诱变的应用定点诱变技术在科研、生物医药等领域具有广泛的应用价值。

以下是其中几个常见的应用领域：3.1 基因功能研究定点诱变技术可以用来研究基因的功能和表达调控机制。

通过在目标位点上插入突变基因，研究者可以观察到这些突变对基因功能和表达的影响，进而揭示基因的作用机制和生物学功能。

3.2 疾病模型构建定点诱变技术可以用来构建疾病模型，以研究疾病的发生机制和治疗方法。

通过在目标位点上插入与特定疾病相关的突变基因，可以模拟疾病的发生过程，进一步研究疾病的发病机理，并寻找治疗疾病的新方法。

3.3 转基因作物育种定点诱变技术可以用来改良作物品种，提高其产量、抗病性等性状。

通过在目标位点上插入与所需性状相关的突变基因，可以直接导入所需性状，避免传统杂交育种中的不可控性，并加快育种进程。

3.4 基因治疗定点诱变技术可以用来进行基因治疗，治疗一些遗传性疾病或基因突变导致的疾病。

定点突变和饱和突变是两种常用的蛋白质工程技术，它们都可以改变目标基因的序列，从而影响蛋白质的结构和功能。

但是，这两种技术也有很大的不同，主要体现在以下几个方面：突变的范围定点突变是指在目标基因的特定位点上，引入预先设计好的碱基替换、插入或缺失，从而产生特定的氨基酸替换、添加或删除的突变体。

定点突变的目的是根据已有的关于蛋白质结构、功能、催化机理等信息，有目的地改变蛋白质性能或特异性。

饱和突变是指在目标基因的某一位点或某几个位点上，将原来的碱基替换成所有可能的其他碱基，从而产生所有可能的氨基酸替换的突变体。

饱和突变的目的是探索蛋白质功能和结构之间的关系，以及寻找具有改善或新颖性能的蛋白质突变体。

因此，定点突变是一种有选择性的突变技术，它只改变目标基因中感兴趣的部分；而饱和突变是一种无选择性的突变技术，它改变目标基因中所有可能的部分。

突变的方法定点突变通常采用PCR方法来实现，即利用合成的含有突变碱基的引物来扩增目标基因片段，并将其克隆到载体中。

这种方法虽然能够在特定位点引入特定碱基突变，但一次只能引入一种突变碱基，若进行饱和突变需要合成多条突变引物。

这样做既费时又费力，而且容易出错。

饱和突变则采用其他更高效和简便的方法来实现，比如使用简并密码子、随机引物、DNA重组等技术。

简并密码子是指可以编码多种氨基酸的密码子，比如NNK或NNS（N表示任意碱基，K表示G或T，S表示G或C），它们可以编码20种氨基酸中的19种（除了色氨酸）。

随机引物是指含有随机碱基序列的引物，它们可以产生各种不同组合的密码子。

DNA重组是指利用限制性内切酶、连接酶等酶来切割和连接不同来源或不同位置的DNA片段，从而产生新型DNA序列。

这些方法都可以在目标基因上产生大量不同类型和位置的突变，并且操作简单快速。

突变的效果定点突变和饱和突变对蛋白质性能和稳定性的影响也不尽相同。

定点突变通常是根据已知信息进行设计和预测的，因此它们往往能够达到预期的效果，比如增强或减弱蛋白质活性、改善或降低蛋白质亲和力、增加或减少蛋白质稳定性等。

蛋白质工程的实际应用【提高稳定性】提高蛋白质的稳定性包括以下几个方面:(1)延长酶的半寿期;(2)提高酶的热稳定性;(3)延长药用蛋白的保存期;(4)抵御由于重要氨基酸氧化引起的活性丧失。

葡萄糖异构酶(GI)在工业上应用广泛，为提高其热稳定性，朱国萍等人在确定第138位甘氨酸(Gly138)为目标氨基酸后，用双引物法对GI基因进行体外定点诱变，以脯氨酸(Pro138)替代Gly138，含突变体的重组质粒在大肠杆菌中表达，结果突变型GI比野生型的热半衰期长一倍;最适反应温度提高10~12℃;酶比活相同。

据分析，Pro替代Gly138后，可能由于引入了一个吡咯环，该侧链刚好能够填充于Gly138附近的空洞，使蛋白质空间结构更具刚性，从而提高了酶的热稳定性。

【融合蛋白质】脑啡肽(Enk)N端5肽线形结构是与δ型受体结合的基本功能区域，干扰素(IFN)是一种广谱抗病毒抗肿瘤的细胞因子。

黎孟枫等人化学合成了EnkN端5肽编码区，通过一连接3肽编码区与人α1型IFN基因连接，在大肠杆菌中表达了这一融合蛋白。

以体外人结肠腺癌细胞和多形胶质瘤细胞为模型，采用3H-胸腺嘧啶核苷掺入法证明该融合蛋白抑制肿瘤细胞生长的活性显著高于单纯的IFN，通过Naloxone竞争阻断实验证明，抑制活性的增高确由Enk导向区介导。

【活性改变】通常饭后30~60min，人血液中胰岛素的含量达到高峰，120~180min内恢复到基础水平。

而目前临床上使用的胰岛素制剂注射后120min后才出现高峰且持续180~240min，与人生理状况不符。

实验表明，胰岛素在高浓度(大于10-5mol/L)时以二聚体形式存在，低浓度时(小于10-9mol/L)时主要以单体形式存在。

设计速效胰岛素原则就是避免胰岛素形成聚合体。

类胰岛素生长因子-I(IGF-I)的结构和性质与胰岛素具有高度的同源性和三维结构的相似性，但IGF-I不形成二聚体。

IGF-I的B结构域(与胰岛素B链相对应)中B28-B29氨基酸序列与胰岛素B 链的B28-B29相比，发生颠倒。

酶的定向进化关键词：酶氨基酸蛋白质试剂标准物质北京标准物质网一、概念及一般步骤定点诱变方法在蛋白质工程中起到了至关重要的作用。

然而，定点诱变只能对天然蛋白质序列中的部分单独氨基酸进行替换或修改，因而对其生物活性提高的作用有限。

同时，该方法仅适用于三维结构明确、结构与功能的相互关系也清楚的蛋白质，应用空间相对有限。

这些定向诱变技术本身的局限性制约了其更为快速的发展和更广泛的应用。

酶的定向进化技术，则是在不了解酶的空间结构和作用机制的情况下，通过人为创造特殊条件模拟自然进化过程，在体外使其基因发生大量变异，并定向筛选获得具有特定性质或功能的突变酶分子。

相对于传统的定点诱变蛋白质理性设计方法，定向进化被称为蛋白质的非理性设计方法。

酶的定向进化技术一般步骤为：选择已经存在的酶分子作为进化起点，确立目标酶的性质或功能；通过随机突变和基因体外重组创建基因突变文库；确定目标酶分子的筛选方法；选择结果相对最好的突变株。

通常，酶的定向进化是一个循环递进的过程，以一次循环所得的最佳突变株作为下一个突变循环起点，逐渐累积正突变直至获得期望的目标酶分子。

酶的定向进化技术是一种更接近自然进化方式的蛋白质工程新策略，使原本在自然界中需要数千万年的进化过程缩短至几个月内完成，并能定向得到符合需要的新型酶分子，大大加速了蛋白质工程的发展。

目前，蛋白质的合理设计策略与酶分子的定向进化方法互相补充，为研究蛋白质的结构和功能开辟了新的道路，拓宽了蛋白质工程的研究范围和应用前景。

二、定向进化的研究方法定向进化一般包括随机诱变、体外重组、筛选鉴定三部分，每一部分都有多种研究技术。

1.随机诱变易错PCR技术是通过改变传统PCR方法的反应条件，使碱基在一定程度上随机错配而引入多点突变，进而构建突变基因库。

该方法多用于较小的基因片段，其遗传变化只发生在单一分子内部，属无性进化范畴。

由于在突变过程中有益突变的概率很低，因此该方法较为费力耗时。

一般易错PCR过程均需要连续反复进行使得每一次的正向突变累积直至产生重要的有益突变。

基因工程定义：通过将外源基因通过体外重组后导入受体细胞内，从而使这个基因能在受体细胞内复制、转录、翻译表达。

它是用人为的方法将所需要的某一供体生物的——DNA提取出来，在离体条件下用适当的工具酶进行切割后，把它与作为载体的DNA分子连接起来，然后与载体一起导入某一更易生长、繁殖的受体细胞中，以让外源物质在其中进行正常的复制和表达，从而获得新物种的一种崭新技术。

原理：基因重组应用：1在生产领域，人们可以利用基因技术,生产转基因食品二、在环境保护上基因工程做成的DNA探针能够十分灵敏地检测环境中的病毒、细菌等污染。

三、在医疗方面基因治疗即是基因工程的一种技术方法。

此外运用“DNA探针”检测肝炎病毒等病毒感染及遗传缺陷，不但准确而且迅速，在医疗上也应用广泛，四、在基因工程药物的研究方面将生物合成相应药物成分的基因导入微生物细胞内，让它们产生相应的药物，不但能解决产量问题，还能大大降低生产成本。

蛋白质工程的研究进展及前景展望由于基因工程的发展，人们已经可以运用基因重组等理论和方法去设计并制造出预想的各种性能的蛋白质。

这种改变蛋白质的操作可以在蛋白质水平上，也可以在基因水平上。

如基因水平的改变，是在功能基因开发的基础上，对编码蛋白质的基因进行改造，小到可改变一个核苷酸，大到可以加入或消除某一结构的编码序列。

蛋白质水平的改变则主要是对制造出的蛋白质进行加工、修饰，如磷酸化、糖基化等。

蛋白质的化学修饰条件剧烈，无专一性，而基因操作则比较方便，在实施基因操作时，必须预先知道是哪个氨基酸或哪几个氨基酸影响着蛋白质的性状。

就现代生物技术发展水平看，大量新蛋白质通过检测，来确定改变的蛋白质是否具有预期的性状，技术上已是可行的。

２．２定点突变技术目前，在蛋白质工程中最常采用的技术是定点诱变技术，即在特定的位点改变基因上核苷酸的种类，从而达到改变蛋白质性状的目的。

蛋白质工程发展至当代，利用专一改变基因中某个或某些特定核苷酸的技术，可以产生具有工业上和医药上所需性状的蛋白质。