定点诱变技术解析

第三节蛋白质工程●课标要求简述蛋白质工程。

●课标解读1．简述蛋白质工程的概念和原理。

2．说明蛋白质工程和基因工程的区别与联系。

3．举例说明蛋白质工程的应用和发展。

●教学地位蛋白质工程是基因工程的延伸，又称为第二代基因工程，是按照人们的需要，利用基因工程的原理对蛋白质进行改造。

目前蛋白质工程还有许多理论和技术问题等待解决，成功的实例还不多，但发展前景广阔。

在高考中考到的次数还不多，常在考查基因工程的非选择题中有一问涉及蛋白质工程。

●教法指导1．结合过程图，让学生理解蛋白质工程的基本原理。

2．结合具体的应用实例，让学生理解蛋白质工程的应用。

●新课导入建议玉米的营养价值不如小麦，原因是玉米中必需氨基酸赖氨酸的含量比较低。

玉米中赖氨酸含量低的原因是赖氨酸合成过程中的两种关键酶——天冬氨酸激酶和二氢吡啶二羧酸合成酶的活性受到赖氨酸浓度的影响较大，当赖氨酸浓度达到一定量时，会抑制两种酶的活性。

所以玉米中赖氨酸的含量很难提高，如果我们将天冬氨酸激酶第352位的苏氨酸变成异亮氨酸，将二氢吡啶二羧酸合成酶的第104位的天冬酰胺变成异亮氨酸，就可以使玉米种子中的赖氨酸含量提高2倍，那么怎样对这两种酶进行改造呢？这就要依靠蛋白质工程。

●教学流程设计课前自主探究：阅读教材P30～35有关知识，填充【课前自主导学】空白，完成思考交流1、2。

⇒步骤1：课程导入：建议用【新课导入建议】方法导入课题。

⇒步骤2：尝试作答【课前自主导学】部分的【正误判断】，检查自学效果。

⇒步骤3：教师结合教材P30图1－17和教材P31图1－18让学生理解蛋白质工程的原理，通过【课堂互动探究】探究1归纳总结，通过例1强化。

⇓步骤6：诵读【结论语句】，尝试构建最优知识网络图解，互评后参看【本课知识小结】的网络构建。

课下完成【当堂双基达标】。

⇐步骤5：通过教材中的实例让学生认识蛋白质工程的应用，认识蛋白质工程的意义。

⇐步骤4：引导学生讨论蛋白质工程和基因工程的区别与联系，通过【课堂互动探究】探究2的表格进行比较。

基因定点突变全攻略一、定点突变得目得把目得基因上面得一个碱基换成另外一个碱基.二、定点突变得原理定点突变就是指通过聚合酶链式反应(PCR)等方法向目得DNA片段（可以就是基因组，也可以就是质粒)中引入所需变化（通常就是表征有利方向得变化）,包括碱基得添加、删除、点突变等。

定点突变能迅速、高效得提高DNA所表达得目得蛋白得性状及表征，就是基因研究工作中一种非常有用得手段。

体外定点突变技术就是研究蛋白质结构与功能之间得复杂关系得有力工具，也就是实验室中改造/优化基因常用得手段。

蛋白质得结构决定其功能,二者之间得关系就是蛋白质组研究得重点之一。

对某个已知基因得特定碱基进行定点改变、缺失或者插入,可以改变对应得氨基酸序列与蛋白质结构，对突变基因得表达产物进行研究有助于人类了解蛋白质结构与功能得关系,探讨蛋白质得结构/结构域。

而利用定点突变技术改造基因：比如野生型得绿色荧光蛋白（wtGFP)就是在紫外光激发下能够发出微弱得绿色荧光,经过对其发光结构域得特定氨基酸定点改造,现在得GFＰ能在可见光得波长范围被激发（吸收区红移),而且发光强度比原来强上百倍,甚至还出现了黄色荧光蛋白,蓝色荧光蛋白等等。

定点突变技术得潜在应用领域很广,比如研究蛋白质相互作用位点得结构、改造酶得不同活性或者动力学特性,改造启动子或者DNＡ作用元件,提高蛋白得抗原性或者就是稳定性、活性、研究蛋白得晶体结构，以及药物研发、基因治疗等等方面．通过设计引物,并利用ＰCR将模板扩增出来,然后去掉模板，剩下来得就就是我们得PCR 产物,在PCＲ产物上就已经把这个点变过来了,然后再转化,筛选阳性克隆，再测序确定就行了．三、引物设计原则引物设计得一般原则不再重复.突变引物设计得特殊原则:(1）通常引物长度为2５~４5 bp,我们建议引物长度为3０~35 bp。

一般都就是以要突变得碱基为中心,加上两边得一段序列,两边长度至少为1１—12 bｐ。

若两边引物太短了，很可能会造成突变实验失败，因为引物至少要１1-1２个ｂp才能与模板搭上,而这种突变ＰＣR要求两边都能与引物搭上，所以两边最好各设至少12个bp，并且合成多一条反向互补得引物。

浅析基因定点诱变在蛋白质工程中的应用作者：胡文斌朱云波来源：《中学生物学》2013年第08期在蛋白质工程中对蛋白质结构进行的设计改造，最终还必须通过基因来完成。

设计改造后的蛋白质在自然界生物中不存在相应的基因，往往需要通过人工化学合成或基因修饰获得，其中基因修饰的主要方法就是基因定点诱变。

如在高中生物人教版选修3教科书“蛋白质工程的崛起”这一节中谈到：“将天冬氨酸激酶的第352位的苏氨酸变成异亮氨酸，将二氢吡啶二羧酸合成酶中104位的天冬酰胺变成异亮氨酸，就可以使玉米叶片和种子中的游离赖氨酸分别提高5倍和2倍。

”这个实例中，改造后的蛋白质基因与原始基因只有一个碱基对的差异，其所用的方法就是基因定点诱变。

但是，基因突变往往是不定向的，是随机的，研究者如何让基因按照人的意愿进行定向突变呢？为什么没有用化学合成法合成基因呢？化学合成法有什么弊端吗？下面就这些问题作简要分析和阐述。

1 基因定点诱变的原理和方法基因定点诱变技术是蛋白质工程研究中的一种重要方法，其实质是利用化学合成寡核苷酸和基因重组技术相结合的方法，按照预定设计，对已知基因的特定碱基进行定点增删或转换，最终改变对应的氨基酸序列和蛋白质结构。

最具代表性的定点诱变方法有以下三种。

1.1 寡核苷酸介导的定点诱变利用人工合成的寡核苷酸可以制造任何部位的突变，而不受限制酶切点的限制（图1）。

如果希望改变某个DNA的某个特定碱基，可以先合成一条突变碱基位于中间的寡核苷酸，一般长度约15～20 bp。

这条寡核苷酸链除了突变碱基外，其余的序列与野生型DNA分子中的相应序列完全一致。

然后将合成的寡核苷酸与由单链噬菌体做载体所携带的DNA克隆互补链混合，进行分子杂交。

这段配对的寡核苷酸可以做为引物，在DNA聚合酶作用下合成完整的互补链，再用DNA连接酶连接起来。

将此双链DNA导入大肠杆菌中，经扩增就可以得到大量可稳定遗传的的突变DNA克隆。

1.2 盒式定点诱变盒式定点诱变是利用一段人工合成的含有突变序列的寡核苷酸片段，取代野生型基因中相应序列。

环状定点诱变技术在单碱基定点诱变中的应用[摘要] 目的采用环状定点诱变技术将重组真核表达质粒pcDNA3.1-hTSHR中hTSHR cDNA序列上发生突变的单碱基诱变回正常的序列。

方法设计1对含预期突变的完全互补的诱变引物,以环状质粒为模板进行PCR扩增,得到带缺口的突变质粒,酶消化去除模板质粒,将PCR产物转化DH5α感受态细胞进行缺口修复和克隆。

结果DNA测序表明,在预期位点已成功发生诱变,且目的基因其他部位的碱基序列均未发生随机突变。

结论环状定点诱变技术是一种高效、简便、快捷的诱变方法,通过该方法成功实现了目的碱基的定点诱变,为后续研究奠定了基础。

[关键词] 环状定点突变;聚合酶链反应;质粒;人促甲状腺激素受体采用体外细胞生物法来检测自身免疫性甲状腺疾病(autoimmune thyroid diseases,AITD)患者体内的促甲状腺激素受体抗体(TSH receptor antibodies,TRAb)时,需要应用表达人促甲状腺激素受体(human thyroid stimulating hormone receptor,hTSHR)的细胞株。

国内目前尚没有此类细胞株供应,鉴于此,本课题组尝试进行了这方面的研究,前期在构建pcDNA3.1-hTSHR重组真核表达质粒时,通过DNA测序发现目的基因hTSHR cDNA序列上第256位碱基发生了突变,因此本实验拟采用环状诱变PCR法对该碱基进行诱变,以期获得序列完全正确的重组真核表达质粒。

1 材料与方法1.1 材料Muta-directTM定点突变试剂盒购自北京赛百盛生物工程公司,DH5α感受态细胞、DNA分子质量标准及质粒抽提纯化试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司,pcDNA3.1-hTSHR(-256 C)重组真核表达载体为本课题组前期所构建,限制性内切酶KpnⅠ和XbaⅠ为日本TaKaRa公司产品,胰蛋白胨、酵母提取物为英国Oxoid公司产品,引物由上海生工生物工程技术有限公司合成,其余为国产分析纯。

命题篇强化练10(专项命题一)1.[PCR技术及其应用](2022湖北黄冈一模)重叠延伸PCR技术是一种通过寡聚核苷酸链之间重叠的部分互相搭桥、互为模板,通过多次PCR扩增,从而获得目的基因的方法。

某科研团队运用重叠延伸PCR技术在水蛭素基因中的特定位点引入特定突变,使水蛭素第47位的天冬酰胺(密码子为AAC、AAU)替换为赖氨酸(密码子为AAA、AAG),从而提高水蛭素的抗凝血活性,原理如图所示。

下列说法错误的是()注:引物突起处代表与模板链不能互补的突变位点。

A.过程①需要模板、含Mg2+的缓冲液、引物、4种脱氧核苷酸和耐高温的DNA聚合酶等B.若引物2的突变位点设计为A,则引物3的突变位点应设计为GC.经过过程④获得的杂交DNA有2种,只有其中一种可以经过过程⑤获得目的基因D.以过程⑤获得的目的基因为模板,可以使用引物1和引物4进行PCR2.[PCR技术及其应用](2022天津一模)通过设计引物,运用PCR技术可以实现目的基因的定点诱变。

如图为基因工程中获取突变基因的过程,其中引物1序列中含有一个碱基T不能与目的基因片段配对,但不影响引物与模板链的整体配对,反应体系中引物1和引物2的5'端分别设计增加限制酶a和限制酶b的识别位点。

有关叙述不正确的是()A.引物中设计两种限制酶识别位点有利于目的基因定向插入载体B.在PCR反应体系中还需要加入4种游离的脱氧核苷酸、Taq DNA聚合酶等C.第3轮PCR,引物1能与图中②结合并且形成两条链等长的突变基因D.第3轮PCR结束后,含突变碱基对且两条链等长的DNA占1/23.[PCR技术及其应用](2022北京一模)小鼠肿瘤转移抑制基因(kissl基因)仅在特定组织中表达。

在雌激素的诱导下,细胞内信号转导分子可以与kissl基因启动子的特定区域结合,激活kissl基因的转录。

研究者扩增了kissl基因启动子不同长度的片段P1、P2、P3和P4,分别构建这些片段与绿色荧光蛋白基因(G)融合的载体,转入体外培养的特定细胞中,在培养液中添加雌激素,以确定不同片段的转录活性。

定点诱变名词解释-回复
定点诱变是一种通过分子生物学技术，以确定的方式改变特定基因或DNA 序列的方法。

这种方法通常涉及到使用PCR（聚合酶链反应）和突变引物来引入特定的突变。

在定点诱变中，研究人员可以设计一种特殊的引物，该引物与DNA模板上的目标区域互补，并且包含一个或多个突变位点。

当PCR扩增时，这些突变引物将引导DNA聚合酶合成带有突变的新DNA链。

然后可以通过克隆和其他方法将这些突变的DNA片段插入到宿主细胞中，以便进一步研究。

定点诱变可以用于许多不同的目的，包括研究基因功能、改善蛋白质性质以及创建新的生物制品等。

基因定点诱变的方法及原理基因定点诱变是指在特定位置引发基因突变的一种技术或方法。

通过基因定点诱变技术，可以精确地改变基因组中特定位置的碱基序列，从而研究或改变目标基因的功能。

目前常用的基因定点诱变方法主要有以下几种：1. CRISPR-Cas9系统：CRISPR-Cas9（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats-CRISPR associated protein 9）是一种基于RNA-DNA 相互识别的靶向基因编辑技术。

该系统利用Cas9蛋白通过结合到特定的DNA 序列来导向编辑目标位置，而CRISPR RNA（crRNA）和互补序列的转录过程产生了指导RNA（sgRNA）。

CRISPR-Cas9系统可以通过设计合成特定的sgRNA来诱导Cas9蛋白与目标基因的DNA序列结合，并在目标位点引入双链断裂，通过自然修复过程来实现基因突变。

2. TALEN系统：TALEN（Transcription activator-like effector nuclease）是一种由TAL（Transcription activator-like）蛋白和核酸酶融合而成的基因编辑工具。

TAL蛋白可通过识别和结合特定的DNA序列来实现靶向基因编辑。

TALEN 系统利用设计合成的TAL蛋白与核酸酶的融合体结合到目标基因的DNA序列上，并通过酶活性诱导DNA的双链断裂，从而引发基因突变。

3. ZFN系统：ZFN（Zinc finger nuclease）是由锌指蛋白（Zinc Finger Protein）与核酸酶（nuclease）融合而成的一种基因编辑工具。

锌指蛋白能够识别和结合到特定的DNA序列上，而核酸酶则通过识别锌指蛋白与DNA结合后的底物序列引发DNA的切割。

ZFN系统利用设计合成的锌指蛋白与核酸酶的融合体结合到目标基因的DNA序列上，从而在特定的位置诱导DNA的双链断裂，进而引发基因突变。

PCR的应用随着生物技术的飞速发展，曾经遥不可及的PCR技术逐步走进了高中实验室。

PCR技术应用广泛，如实时荧光定量RT－PCR技术、重叠延伸PCR、大引物PCR、反向PCR、巢式PCR等，高考试题中有关PCR的问题越来越多，设问考查深度也明显提升。

各种PCR技术不是孤立的，它们均以常规PCR为基础，为实现特定目的而进行了一定改进，但也有各自的局限性，因此在必要时可同时使用几种扩增技术，如多重巢式PCR、反向实时荧光定量PCR 等。

在高考备考中，要关注不同扩增技术的本质差异，同时总结此类试题的解答步骤：一是寻找题图有效信息，确定所考PCR类型；二是迅速再忆所考PCR的独特性，猜测出题人可能的意图；三是根据设问对前述猜测进行验证，并领悟出题人挖掘的新考点，进而对知识框架进行完善。

1．实时荧光定量RT－PCR技术检测病毒核酸病毒感染的常规检测方法是通过实时荧光PCR鉴定。

实时荧光PCR扩增目的基因，需额外添加荧光标记探针(一小段单链DNA，可与目的基因中部序列特异性结合)。

当探针完整时，不产生荧光。

在PCR过程中，与目的基因结合的探针被耐高温的DNA聚合酶水解，R与Q 分离后，R发出的荧光可被检测到(如图甲)，通过实时荧光PCR检测某冠状病毒感染时，检测到的荧光强度变化如图乙，荧光到达预先设定阈值的循环数(Ct值)越小，说明病毒核酸浓度越高。

2．PCR定点突变——重叠延伸PCR技术重叠延伸PCR技术其主要设计思路是用具有互补配对片段的引物(图中的引物2和3，突起处代表与模板链不能互补的突变位点)，分别进行PCR，获得有重叠链的两种DNA片段，再在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸获得想要的目的基因。

如某科研团队运用重叠延伸PCR 技术在水蛭素基因中的特定位点引入特定突变，使水蛭素第47位的天冬酰胺(密码子为AAC、AAU)替换为赖氨酸(密码子为AAA、AAG)，从而提高水蛭素的抗凝血活性。

原理如图：3．PCR定点突变——大引物PCR技术大引物PCR需要用到三条引物进行两轮PCR，这三条引物分别是突变上游引物、常规上游引物和常规下游引物。

环状定点诱变技术在载体构建中的应用作者：王斌邢体坤宋路萍杨振苹荆新蕊王亚萍黄帅张静静来源：《中国当代医药》2020年第26期[摘要]目的探讨环状定点诱变技术在目标质粒单碱基突变，酶切位点修改和片段删除中的应用。

方法设计包含目标突变，部分互补且5’端含有5～8 bp突出的引物对，环状质粒作为模板进行扩增，甲基化酶DpnI酶消化去除模板质粒。

转化DH5α感受态进行缺口修复，获得定点突变的目标质粒。

结果通过酶切和基因测序证明，环状定点诱变技术可高效用于单碱基突变、酶切位点修改和片段删除等突变。

结论环状定点诱变技术能够简便、高效、快捷地实现目标质粒的单碱基突变、酶切位点修改和片段删除，基本满足药物开发过程中载体构建的需求。

[关键词]环状定点诱变;片段删除;酶切位点;PCR扩增[中图分类号] R450 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2020）9（b）-0032-04Application of circular site-directed mutagenesis in vector constructionWANG Bin1 XING Ti-kun2 SONG Lu-ping2 YANG Zhen-ping2 JING Xin-rui2 WANG Ya-ping2 HUANG Shuai2 ZHANG Jing-jing21. Department of Quality Control， HUALAN Genetic Engineering Co.， Ltd.，He′nan Province， Xinxiang 453000， China;2. Department of Recombinant Cell， HUALAN Genetic Engineering Co.， Ltd.，He′nan Province， Xinxiang 453000， China[Abstract] Objective To explore the application of circular site-directed mutagenesis technology in single base mutation， restriction site modification and fragment deletion of the target plasmid. Methods The primer pairs were designed including target mutation， partial complementation， and 5’ end contains 5-8 bp protruding. The circular plasmid was used as template for amplification and digested and removed by methylase enzyme DpnI. Transform DH5α for gap repair then site-directed mutation plasmid was obtained. Results Through the validation by enzyme cutting and gene sequencing， circular site-directed mutagenesis technology could be efficiently used in single base mutation， modification of enzyme site and deletion of fragment. Conclusion The circular site-directed mutagenesis technology is simple， efficient and quick to realize single base mutation，restriction site modification and fragment deletion of the target plasmid， which can basically meet the needs of molecular construction in the process of drug development.[Key words] Circular site-directed mutagenesis technology; Fragment deletion; Restriction enzyme cutting site; PCR amplification定點诱变是体外特异性地取代、插入或缺失DNA序列任何一个特定碱基的技术[1]。