第七章定点诱变
［本章摘要］
突变有重复、缺失、倒位、易位四种类型。
定点诱变主要是关于：简单的插入或缺失，单个碱基的置换以及系统的缺失、插入或成串碱基的置换。
寡核苷酸介导的定点诱变主要是对单个或少数几个碱基的操作；外切核酸酶Ⅲ、BAL31、DNase Ⅰ介导嵌套缺失，可以得到系列缺失体。
第一节：寡核苷酸介导的诱变
70年代初j×174 DNA （ss DNA 5386bp），当用带琥珀突变的ssDNA 与变性的野生型DNA片段一起转染细菌时，观察到“标记获救”现象。
即产生带野生型基因组的噬菌体，原因是野生型DNA 片段与突变体的相应序列退火，形成错配的异源双链体，后者可被宿主编码的错配修复系统转变为全长的野生型基因组。
由此可利用突变的DNA 片段将突变引入到野生型DNA 中。
一、Kunkel法或称“U” 法
1．背景介绍
dut-dUTP 酶缺陷，细胞不能把dUTP 转化为dUMP ，因此细胞内dUTP 的含量大为增加，其中一些dUTP 可掺入DNA 中正常情况下由胸苷嘧啶占据的位置。
ung -UDG 酶缺陷，UDG 酶[尿嘧啶（uracil）-N-糖基化酶（glycosylase）]可除去掺入DNA 中的尿嘧啶残基。
2．原理
Kunkel 法原理如图7-1 所示，过程包括：
①当目标DNA 插入phagemid 载体并进入E.coli CJ236 后。
②由于该菌体ung- dut-突变，合成的DNA 上含有少量尿嘧啶（取代胸腺嘧啶）。
③M13K07 辅助感染下，产生带U 的单链DNA 。
④与引入诱变的Oligo 复性。
⑤在T7DNA polymerase 和ligase 作用下，以带U 的单链DNA 为模板合成一条新链，形成杂合双链。
⑥感染dut+ung+ E.coli MV1190 后，在细胞分裂过程中，只有新合成的DNA 链才能起模板作用合成新的并引入了诱变位点的子代双链DNA 。
而有U 的DNA 链，在dut+和ung+产物的作用下，尿嘧啶被水解，从而失去作为模板的能力。
3．酶和primer
①DNA polymerase
②ligase
③T4 gene 32 protein：提高含二级结构的ssDNA 的突变率
④primer：要求5' 端磷酸化。
引物的终极条件：与靶DNA 正确配对，特异性地与靶DNA 序列退火。
A.单核苷酸置换插入或缺失
5' 端完全配对，使得上游（引物）起始的DNA 合成不容易将诱变寡核苷酸取代，约需8-10bp 。
3' 端所形成的杂交体足以引导DNA 合成。
如果错配核苷酸太靠近3' 端，3' 端将不能形成稳定的杂交体，易被外切活性降解。
所以3' 端需有7-9bp 完全配对；为便于筛选，应选用可形成稳定杂交体而长度最短的诱变寡核苷酸。
一般17-19bp ，错配在中央，使得完全配对的杂交体与错配杂交体之间的热稳定性差异足够大。
B.多处缺失或变换2 个bp 以上的oligo
两侧需12-15bp ，侧翼双链区的Tm 应约为35-40℃。
突变区域大，效率越低（两侧形成稳定杂交体的能力是突变区长度的函数→越低）。
Tm = 4 （G + C）+ 2 （A + T）
⑤模板/结果
靶DNA 尽可能短，应测序确定其突变。
二、Altered Sites II in vitro Mutagenesis System
三、Transformer Site-Directed mutagenesis 原理及过程如图7-3 所示。
图7-3 ：Transformer Site-Directed mutagenesis 原理图
四、PCR 定点诱变
1．同源重组法
引物1、3 ，致突变引物，引物2、4 ，准确配对引物。
作用原理如图7-4 ，过程包括：
①以1、2 和3、4 分别为引物进行PCR ，得到引入了突变的线状DNA 分子。
②线状DNA 分子转化同一宿主。
③同源重组得到环状的引入了突变的目标DNA 。
2．Dpn I 法
作用原理如图7-5 所示，作用过程包括：
①以野生型DNA 为模板，致突变引物扩增出目标分子。
②依赖甲基化的限制性内切酶Dpn I 特异性降解模板DNA （甲基化）。
③扩增产物连接，转化大肠杆菌，得到大量复制。
3．重叠延伸 Overlap extension
原理参照图7-6 ，具体内容参考第五章。
第二节嵌套缺失1．外切核酸酶Ⅲ的消化
2．BAL 31 的消化
BAL31 主要活性为3' 外切核酸酶活性，可从线性DNA 两条链的3' 端去掉除单核苷酸。
它是一个内切核酸酶（单链，nick, gap），依赖Ca2+，EGTA 可抑制活性。
3．DNase Ⅰ的消化
DNase Ⅰ是一种内切酶，可优先水解ds or ss DNA 中的嘧啶核苷酸。
当Mg2+ 存在时独立作用于每条DNA 链，位点随机。
当Mn2+ 存在时大致在同一位置切割dsDNA ，产生平端或1-2 个核苷酸突出。
