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20世纪80年代以来，基因克隆技术与DNA化学合成方法相结合，建立和发展了定点突变技术。
可以按照预定设计，在已知的DNA序列中增删或转换核苷酸，精确地是靶基因在特定位点发生碱基序列的变化，进而使基因表达及调控，基因产物发生相应改变。
这种快速精确的基因突变已经被广泛地应用与基因工程和蛋白质工程之中。
定点突变有多种方法，有的改变特定核苷酸，有的则是对一段最可能影响蛋白质功能的基因序列进行随机突变，产生一系列突变蛋白质。
寡核苷酸诱导的定点突变基本上分两类：一类是用单链噬菌体M13作载体的寡核苷酸介导的单链模板定点突变；另一类用双链质粒作载体，双引物法定点突变。
为了在体外导入特定的点突变，小的限制性片段可以切除，并被包含所需要突变的合成接头所替代（称为盒式诱变）。
如果不行，插入片段可以克隆到产生单链DNA的噬菌粒载体中，由所设计的错配引物指导DNA复制，产生异源双链的复制型，并在下面的复制循环中产生野生型和突变的复制型。
单链噬菌体作载体的定点突变的基本原理是，用已知序列的环状DNA变性后为模板，人工合成一段引物，将所要设计的定点突变寡核苷酸置于引物中，也就是说人工所合成的引物不是完全和模板互补，而是在某个位点有意识地让碱基突变，和模板上的碱基不能配对，由于其他的碱基是互补的，所以任然可以通过复性，使引物和模板特异性结合。
在M13单链环状模板上杂交一段寡核苷酸引物，利用DNA聚合酶和连接酶的作用，从引物延伸合成链，得到一个闭合环状的异源双链分子。
由于预先在寡核苷酸引物中人为地引入碱基的错配对，插入或缺失，然后在将杂合双环DNA转化到细菌中，因此异源双链DNA经转化和筛选就可以分离到带有相应突变的DNA克隆。
由于复制是半保留复制，经克隆后将有一半的后代环状DNA产生了定点突变，另一半和正常的亲代链一样。
环状双链质粒DNA作为载体进行基因的改造有它的优点。
待改造基因中如有两个适当的限制性内切酶切点，可以用人工合成双链DNA片段置换两切点之间原有序列，在人工合成的双链DNA片段中包含有突变的序列。
定点诱变的原理和应用1. 引言定点诱变是一种基因工程技术，可以通过人为干预基因组，使其发生特定的变异。
定点诱变技术在科研、生物医药等领域具有重要的应用价值。
本文将介绍定点诱变的原理和应用。
2. 定点诱变的原理定点诱变的原理是通过人为设计和构建特定的DNA片段，然后将其导入宿主细胞中，通过一系列的分子生物学技术将该DNA片段插入到细胞染色体的目标位点上。
定点诱变技术主要有以下几个关键步骤：•设计目标位点：首先需要确定要进行定点诱变的目标位点，通常是某个特定基因或基因组区域。
•构建修饰DNA片段：根据目标位点的序列信息，设计和合成能够与目标位点配对的DNA片段。
这些DNA片段通常包含所需的突变基因或序列。
•导入宿主细胞：将修饰DNA片段导入宿主细胞中，常用的方法有电转化、化学法和病毒介导的转导等。
•插入目标位点：通过一系列的分子生物学技术，将修饰DNA片段插入到细胞染色体的目标位点上。
常见的方法有CRISPR/Cas9技术、基因敲除、基因转座等。
3. 定点诱变的应用定点诱变技术在科研、生物医药等领域具有广泛的应用价值。
以下是其中几个常见的应用领域：3.1 基因功能研究定点诱变技术可以用来研究基因的功能和表达调控机制。
通过在目标位点上插入突变基因，研究者可以观察到这些突变对基因功能和表达的影响，进而揭示基因的作用机制和生物学功能。
3.2 疾病模型构建定点诱变技术可以用来构建疾病模型，以研究疾病的发生机制和治疗方法。
通过在目标位点上插入与特定疾病相关的突变基因，可以模拟疾病的发生过程，进一步研究疾病的发病机理，并寻找治疗疾病的新方法。
3.3 转基因作物育种定点诱变技术可以用来改良作物品种，提高其产量、抗病性等性状。
通过在目标位点上插入与所需性状相关的突变基因，可以直接导入所需性状，避免传统杂交育种中的不可控性，并加快育种进程。
3.4 基因治疗定点诱变技术可以用来进行基因治疗，治疗一些遗传性疾病或基因突变导致的疾病。
基因定点诱变的方法及原理基因定点诱变是指在特定位置引发基因突变的一种技术或方法。
通过基因定点诱变技术，可以精确地改变基因组中特定位置的碱基序列，从而研究或改变目标基因的功能。
目前常用的基因定点诱变方法主要有以下几种：1. CRISPR-Cas9系统：CRISPR-Cas9（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats-CRISPR associated protein 9）是一种基于RNA-DNA 相互识别的靶向基因编辑技术。
该系统利用Cas9蛋白通过结合到特定的DNA 序列来导向编辑目标位置，而CRISPR RNA（crRNA）和互补序列的转录过程产生了指导RNA（sgRNA）。
CRISPR-Cas9系统可以通过设计合成特定的sgRNA来诱导Cas9蛋白与目标基因的DNA序列结合，并在目标位点引入双链断裂，通过自然修复过程来实现基因突变。
2. TALEN系统：TALEN（Transcription activator-like effector nuclease）是一种由TAL（Transcription activator-like）蛋白和核酸酶融合而成的基因编辑工具。
TAL蛋白可通过识别和结合特定的DNA序列来实现靶向基因编辑。
TALEN 系统利用设计合成的TAL蛋白与核酸酶的融合体结合到目标基因的DNA序列上，并通过酶活性诱导DNA的双链断裂，从而引发基因突变。
3. ZFN系统：ZFN（Zinc finger nuclease）是由锌指蛋白（Zinc Finger Protein）与核酸酶（nuclease）融合而成的一种基因编辑工具。
锌指蛋白能够识别和结合到特定的DNA序列上，而核酸酶则通过识别锌指蛋白与DNA结合后的底物序列引发DNA的切割。
ZFN系统利用设计合成的锌指蛋白与核酸酶的融合体结合到目标基因的DNA序列上，从而在特定的位置诱导DNA的双链断裂，进而引发基因突变。
环状定点诱变技术在载体构建中的应用作者：王斌邢体坤宋路萍杨振苹荆新蕊王亚萍黄帅张静静来源：《中国当代医药》2020年第26期[摘要]目的探讨环状定点诱变技术在目标质粒单碱基突变，酶切位点修改和片段删除中的应用。
方法设计包含目标突变，部分互补且5’端含有5～8 bp突出的引物对，环状质粒作为模板进行扩增，甲基化酶DpnI酶消化去除模板质粒。
转化DH5α感受态进行缺口修复，获得定点突变的目标质粒。
结果通过酶切和基因测序证明，环状定点诱变技术可高效用于单碱基突变、酶切位点修改和片段删除等突变。
结论环状定点诱变技术能够简便、高效、快捷地实现目标质粒的单碱基突变、酶切位点修改和片段删除，基本满足药物开发过程中载体构建的需求。
[关键词]环状定点诱变;片段删除;酶切位点;PCR扩增[中图分类号] R450 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2020）9（b）-0032-04Application of circular site-directed mutagenesis in vector constructionWANG Bin1 XING Ti-kun2 SONG Lu-ping2 YANG Zhen-ping2 JING Xin-rui2 WANG Ya-ping2 HUANG Shuai2 ZHANG Jing-jing21. Department of Quality Control， HUALAN Genetic Engineering Co.， Ltd.，He′nan Province， Xinxiang 453000， China;2. Department of Recombinant Cell， HUALAN Genetic Engineering Co.， Ltd.，He′nan Province， Xinxiang 453000， China[Abstract] Objective To explore the application of circular site-directed mutagenesis technology in single base mutation， restriction site modification and fragment deletion of the target plasmid. Methods The primer pairs were designed including target mutation， partial complementation， and 5’ end contains 5-8 bp protruding. The circular plasmid was used as template for amplification and digested and removed by methylase enzyme DpnI. Transform DH5α for gap repair then site-directed mutation plasmid was obtained. Results Through the validation by enzyme cutting and gene sequencing， circular site-directed mutagenesis technology could be efficiently used in single base mutation， modification of enzyme site and deletion of fragment. Conclusion The circular site-directed mutagenesis technology is simple， efficient and quick to realize single base mutation，restriction site modification and fragment deletion of the target plasmid， which can basically meet the needs of molecular construction in the process of drug development.[Key words] Circular site-directed mutagenesis technology; Fragment deletion; Restriction enzyme cutting site; PCR amplification定點诱变是体外特异性地取代、插入或缺失DNA序列任何一个特定碱基的技术[1]。
第三章DNA突变技术
基因突变包括单个碱基或片断的替换，基因片断的插入与删除等。
根据其特点可将基因突变技术分两大类：
1.位点特异性突变定点突变
2.随机突变表型筛选
随机突变
易错PCR法(Error-prone PCR)
降低一种dNTP的量（降至5％-10％） 加入dITP来代替被减少的dNTP
缓冲液中另加0.5mmol/L Mn2+
DNA Shuffling
外显子、单基因和基因家族的重组装 随机引物延伸法
交错延伸法
定点突变
点突变——碱基删除、增补和替换
易错PCR(epPCR)
How DNA shuffling is done in the tube
Random fragmentation of a pool of related genes;
Self-priming polymerase reaction and template switching (causing crossovers);
PCR amplification with primers of reassembled products
How DNA shuffling works
Similar mutants generated by
error-prone PCR, random and site-directed mutagenesis . ... .. ... ..Single gene shuffling library of point mutants Family gene shuffling library of chimeras
Generating chimeras with crossovers of large blocks
of sequences
一、单基因和基因家族的重组装
X XXX X XX X XX X XXX X XX X X XXX XX X X XX X XXX X X XXX
XX X
X XX X
XXX X XX X
XX X XX XXX X X X X X XX X Fragment Reassemble Select best
with DNAseI fragments recombinants
Repeat for multiple cycles
一、单基因和基因家族的重组装
D N A 重组装的过程
（Jae Kwang Song等，2000）
β-葡糖苷酶耐热性的提高
(Marý´a Jesu ´s Arrizubieta 等，2000）
耐热p-硝基苯酯酶的分子进化
(Lori Giver 等，1998）
The fucosidase activity are shown with stick representation. Two mutations in the active site (Asp604 and Gln573)are shown in red. Two
mutations in close proximity of the active site (Pro511 and Asp908)are
shown in magenta. Two mutations far away from the active site and on
the protein surface (Val9 and Gln135)are shown in green. The rest of
the substrate binding and active site residues are shown in yellow..
牛乳糖酶到岩藻糖苷酶的直接进化（JI-HU ZHANG等，1997）
How DNA shuffling works？
二、随机引物PCR(RPR)和重组装
（Hikaru Suenaga等,2001）
How DNA shuffling works？
三、交错延伸PCR突变法(StEP)
枯草杆菌蛋白酶E热稳定性的分子进化（Huimin Zhao等，1999）
进化的热稳定性枯草芽孢杆菌蛋白酶E的突变谱系
正面
反面
进化后的枯草杆菌蛋白酶E
芽孢杆菌脲酸酶的定向进化（Su-Hua Huang等,2004）
定点突变的研究意义
1.对调控区进行突变
研究基因结构与功能之间的关系
2. 对编码基因进行突变
检验特定残基在蛋白质结构、催化活性和配基结合能力中的作用
获得突变蛋白
定点突变的类型
▪寡核苷酸介导的基因突变指用含有突变碱基的寡聚核苷酸片断作为引物，在聚合酶的作用下启动DNA 分子进行复制。
▪盒式突变是利用一段人工合成的含基因突变序列的寡核苷酸片段，取代野生型基因中的相应序列。
▪PCR介导的基因突变
DNA定点突变的种类 寡聚核苷酸介导替换、插入、删除
盒式突变
PCR介导
寡聚核苷酸介导法
在dut+的E. coli中
dUTP酶
dUTP dUMP 在dUTP 酶缺失体中（dut-）
dUTP dUMP
dut：dUTPase突变，可导致E. coli内dUTP的量增加，当DNA复制时，可在很多应该加dTTP的位置加入dUTP。
在正常情况下，尿嘧啶-Ｎ-糖基化酶(ung+)可以去除掺入DNA中的尿嘧啶残基。
但在ung-的菌株中，此酶失活。
在大肠杆菌dut-ung-菌株中生长的M13噬菌体的单链基因组DNA中将含有20-30个尿嘧啶残基。
用这些噬菌体感染ung+菌株，尿嘧啶被迅速去除，DNA链遭到破坏，感染力下降约5个数量级。
此法的成功关键，是要得到好的含Ｕ单链模板DNA。
噬菌粒载体
（phagemid ）
无5‘-3’外切活性
3‘-5’外切活性低M13K07辅助感染
产生带U 的单链DNA
这种方法得到的突变率太低，约为1-5%。
主要原因是含突变位点的双链DNA，转入E.coli后，被其修复系统修复了。
盒式定点突变
PCR介导的基因突变
▪在基因5’和3’末端产生突变▪重叠延伸PCR
▪大引物PCR法
在基因5’和3’末端产生突变
重叠延伸法定点突变技术的原理示意图
重叠延伸PCR法小结
缺点：需要2对引物，进行3次PCR，并且需要对中间产物进行纯化。
优点：几乎没有特殊限制，而且成功率高，因此运用非常广泛。
同时利用重叠延伸PCR技术可以对基因中心区段进行取代、插入、缺失的突变。
大引物PCR介导的定点突变
各种点突变方法的比较
方法寡聚核苷酸
介导的突变
盒式突变PCR介导的突变
优点保真度高简单易行
突变效率高
操作简单
突变成功率高
缺点操作复杂
周期长
合成多条引物成本高
受到酶切位点的限制
后续工作复杂
TaqDNA聚合酶保真性偏低
应用产品
一步反向PCR法
Stratagen公司的QuikChange®系列试剂盒SBS Genetech公司的Muta-direct™Site Directed Mutagenesis Kit
Stratagen公司的QuikChange®Multi Site-Directed Mutagenesis Kit
TaKaRa公司的Multipoints Mutagenesis Kit
一种简便快速的定点突变的方法
Stratagen公司研制的Quickchange试剂盒,可以双链DNA质粒为模板，只需一对引物，进行一次PCR，在1～2d内即可完成点突变过程。
DpnI识别序列为甲基化的GATC，GATC在几乎各种质粒中都会出现，而且不止一次。
Overview of the QuikChange®XL site-directed mutagenesis method.
Steps of Muta-direct™Site-Directed Mutagenesis Kit
资料表明，引入3个定点突变的效
率为60%，5个定点突变的效率为30%。
Overview of the QuikChange Multi Site-Directed Mutagenesis method
适用于插入片段长度在
1.0kb以下的多点突变。
Steps of Multipoints Mutagenesis Kit (TaKaRa)。
