微生物发酵生产达托霉素的研究进展

达托霉素菌种选育研究达托霉素是由玫瑰链霉菌经发酵提取得到。

它能杀死临床上分离的绝大多数革兰阳性菌，具有广阔的应用前景。

本实验确定了玫瑰链霉菌紫外诱变的处理时间为45s，链霉素对其的最低抑制浓度为2.1 μg/mL。

通过对筛选得到的链霉素抗性菌株进行初筛和复筛，获得了一株达托霉素高产菌株NO. 201，其效价达到7652μg/mL，较对照组提高了90%。

稳定性验证表明，该高产菌株传代5次仍然稳定，为后续生产提供了可能。

标签：达托霉素，玫瑰链霉菌，链霉素1前言达托霉素是由玫瑰链霉菌经发酵提取得到的脂肽类抗生素[1]。

达托霉素在临床上表现出广谱、药效快、给药小、副反应小等优点[2]。

本文以紫外线诱变达托霉素生产菌株孢子悬浮液，筛选链霉素抗性菌株，获得了达托霉素高产菌株，并对获得的高产菌株的遗传特性及稳定性进行考察。

2实验方法2.1 菌种原始菌株由新昌制药厂菌种保藏中心保藏，作为诱变育种的出发菌株。

2.2 培养方法取1 mL浓度为106个/ mL的孢子悬浮液接种种子培养基（30 mL/250 mL 摇瓶），30°C 250 r/min培养24 h至对数生长期；取2 mL种子液接种发酵培养基（50 mL/500 mL 摇瓶）30°C 250 r/min培养120 h，检测单位。

2.3 达托霉素的检测采用Agilent 1200高效液相色谱仪测定。

采用峰面积计算含量。

2.4 菌种诱变及筛选2.4.1 单孢子悬浮液的制备冷冻孢子移种于斜面，培养成熟后用灭过菌的0.85%LiCl溶液（做助变剂）制成孢子悬浮液，再用无菌玻璃珠将孢子充分打散，滤纸过滤，即得单孢子悬浮液。

2.4.2 紫外诱变处理用吸管吸取5 mL孢子悬浮液于无菌平板中，置功率为30W，波长253.7nm 的紫外灯下30 cm处开盖振荡照射一定时间，避光放置过夜，取样经梯度稀释后涂平板。

2.4.3链霉素耐受性突变株的筛选2.4.3.1含链霉素的分离平板培养基的制备在已灭菌的分离培养基中加入一定量的链霉素溶液，摇匀，倒平板，使成含一定浓度的链霉素平板。

达托霉素的作用机制和药物来源的研究进展洪娟;刘佳佳【摘要】Daptomycin was a novel lipopeptide antibiotic used in the treatment of certain infections caused by multi - resistant organisms which were Gram - positive. The mechanism of actions of daptomycin and its drug source were summe- rized, and the virous synthesis methods of daptomycin, such as precursor induce, biosynthesis, solid and two methods for its analogues -solid synthesis and chemical enzyme synthesis were reviewed and compared synthesis%达托霉素是一种环脂肽类抗生素，对耐药性革兰氏阳性细菌具有强大杀灭作用。

本文详细介绍了达托霉素的作用机制，总结了其药物来源，分别对达托霉素的各种合成方法——前体诱导法、生物合成、固液相合成法及其类似物的全固相合成法和化学酶法进行了概述和比较。

【期刊名称】《广州化工》【年(卷),期】2012(040)009【总页数】3页(P28-30)【关键词】达托霉素;抗生素;耐药性【作者】洪娟;刘佳佳【作者单位】中南大学化学化工学院,湖南长沙410083;中南大学化学化工学院,湖南长沙410083【正文语种】中文【中图分类】R978.1近年来,由于抗生素的滥用,细菌的耐药性日趋强大.临床上出现的耐甲西林金黄葡萄球菌(MRSA),耐万古霉素的肠球菌(VRE),糖肽类敏感的金葡菌(GISA)等是目前医院中传播率和致死率很高的病原体[1].其中的MRSA的强毒性、多重及高度耐药性、传播快等特征,一旦发生感染,病情就难以控制,某些发达国家已将其与烈性传染病对等[2].达托霉素是由美国Lilly公司最初研究,Cubist制药公司开发的一种环脂肽类抗生素,对革兰阳性耐药菌有活性且具更好抗菌谱和较低耐药性[3],能成功应对上述耐药菌且良好疗效、制剂简单、毒副作用小.本文对达托霉素的作用机制及其药物来源的研究进展进行了综述.达托霉素分子由连接到一个环状13-氨基酸肽的N-末端色氨酸上的癸酰基侧链构成[4].肽环由氨基酸和非蛋白质源氨基酸(如:Asn,OmAsp,3mGlu等)按照酰胺键或酯键构成肽环或羧酸肽环.环脂肽类抗生素分子结构中既含有亲水性氨基酸,又含有脂链以及疏水性氨基酸,这就决定了其两亲性的生物学特性.达托霉素偏酸性,在中性pH下分子带负电荷,因而具有极好的水溶性.同时,脂链和疏水性基团的存在,使得其有一定的脂溶性,容易与细菌磷脂层反应,因而有良好的抗菌效果[5].达托霉素的具体作用机制现在尚无定论,许多研究人员对其独特的作用机制行了研究.达托霉素为Ca2+浓度依赖型抗生素[6],在缺乏Ca2+时,达托霉素的抗菌活性很小或几乎没有.只有Ca2+浓度为1.25 mmol/L时抗菌活性才达到最大.圆二色谱和核磁共振研究结果显示,达托霉素与Ca2+结合后结构发生改变,增加其分子的两亲性减少带电荷,使其更有利于与细菌磷脂反应.Schriever CA[7]研究认为达托霉素使细胞膜去极化而使细菌细胞死亡:首先,达托霉素与Ca2+结合,而后其亲脂尾部插入细菌细胞质膜中;第二步,达托霉素寡聚化,使其亲脂尾部在细菌细胞膜上起"离子通道"的作用,破坏了细胞膜,使大量胞内离子的外流;第三步,K+的流失使细胞快速除极,破坏离子梯度.缺乏合适的离子梯度,细菌胞内的三磷酸腺苷合成受到阻遏,失去合成DNA、RNA及大分子蛋白质的能力,细胞死亡.Boarctti M[8]的研究表明,达托霉素的作用靶点不是青霉素结合蛋白,而是结合在细菌细胞膜上,通过扰乱细胞膜对氨基酸的转运,从而阻碍细菌细胞壁肽聚糖的磷壁(酸)脂质(LTA)的生物合成,干扰细胞的复制,导致细菌迅速死亡.卜一珊等[9]对经达托霉素处理的金葡菌进行电镜扫描,相片显示,达托霉素可以在细胞没有发生自溶的情况下迅速杀死细胞,这样就避免了因细胞磷壁酸、肽聚糖和DNA的释放而引起的炎症反应.综上,由于达托霉素的作用机制与现已上市的各类抗菌药物都不相同,这意味着达托霉素将不易受到来自其它抗生素所致交叉耐药性的影响.达托霉素的最早获得是在20世纪80年代它是玫瑰孢链霉菌(Streptomyces roseosporus)发酵产生的环十脂肽类物质经化学修饰的产物[3].在玫瑰孢链霉菌发酵过程中加入正癸酸,利用筛选的癸酸抗性突变株流加法发酵以及激光诱导突变株结合链霉素抗性筛选生产达托霉素的方法都将产量提高35%以上.采用广布多点的方法分散添加癸酸,产出的达托霉素为主要成分,并易于纯化.王玮等[3]研究表明,Streptomyces roseosporus的发酵产物通常是一组包含不同长度脂酰侧链的环十脂肽复合物.发酵产物中除了3种主要成分外,还含有许多杂质,如果在玫瑰孢链霉菌发酵时不优化发酵条件,达托霉素的产量很低,分离纯化难度大,采用前体诱导法,可以改善分离效果.达托霉素的生物合成基因是从Streptomyces roseosporus的Tn5099突变体中获得的,Baltz RH等[10]对得到的DNA片断做了分子克隆,部分序列测定以及插入诱变的操作.用10～20 kb长的编码区去干扰可能的糖肽的生物合成基因,从而确定了两个肽合成编码区.达托霉素是一种非核糖体合成的抗菌肽(多肽).合成酶基因每个模板都可识别、激活一个氨基酸残基,并且在必要的时候对其进行修饰,添加到正在合成的肽链上.Miao等[11]研究报道,达托霉素NRPS(non-ribosomal peptide synthetases非核糖体肽合成酶)的组织结构包含了dptA、dptB、dptC、dptD、dptH等部分.dptA内含五个模块(模块1～5),dptB内含三个(模块6～8)以及模块9的催化功能域,dptC内含模块9～11的酰化硫化功能域,dptD内含模块12～13,以及一个硫化功能域.Baltz RH等[10]对环肽基因簇的两个区域cspA和cspB作了DNA序列分析.他们将Hmγ基因插入到cpsA模块,从而得到了玫瑰孢链霉菌双向交叉阳性检测系统.达托霉素基因簇的CpsB模块包括了氨基酸激活,硫酯键的形成和异构化.利用基因手段对达托霉素分子进行生物合成,可以有效的控制多肽链的合成及其结构修饰,从而得到目标分子.基因工程在医学领域的研究和应用有待于更多学者的参与和发掘.徐红岩等[12]根据多年大量多肽合成工作的经验积累,巧妙地设计了达托霉素的固液相合成策略,该方法被证明可快速合成目标分子.另外运用该方法可对这类环肽主骨架进行修饰或改造,根据组合化学的基本原理,快速合成出一系列大量天然环肽的类似物,以期找到结构相对简单而具有达托霉素相似或更强生物活性的化合物,供临床前的筛选.可是,固液相合成方法中采用的液相环合后再剪切的方法使得产物产率和纯度低,无法满足临床需求,且作为单体的犬尿氨酸和3-甲基谷氨酸自然来源稀少,其化学合成又非常困难,因此,要将该合成方法工业化仍需要进一步研究和完善.目前在合成上取得的最大进展是利用化学酶合成法得到了达托霉素类似物.天蓝色链霉菌中钙依赖性抗生素(cDA)生物合成途径中的硫酯环化酶A3(2)(CdaPS3 Te)被用于合成达托霉素类似物(12位Glu代替3 mGlu,2位L-Asn代替D-Asn).由于缺少Glu-12上的β-甲基,且Asn一2为D型,此类似物比达托霉素MIC高7倍.使用这种方法又合成了许多类似物来研究其构效关系.如Trp替换Kyn-13,MIC升高.Asn取代7, 9位的Asp,则完全丧失活性,用其他酸性残基取代3和12位则可保留大部分活性.在内酯环中额入酸性残基则破坏其活性.采用cdaPS3 Te可以建立一个达托霉素类似物的组合库来进一步筛选抗菌活性更好的分子[3].钦传光等[13]发明出一种达托霉素类似物及其全固相合成制备方法,希望通过达托霉素的主骨架设计出一系列结构相对简单的衍生物,以期找到与达托霉素相似或更强生物活性的化合物,供临床筛选.该方法是将第一个侧链带有羧基的Fmoc氨基酸(其α-羧基被选定的基团保护)连接到固相树脂载体上,再继续依次连接七个Fmoc 氨基酸,期间依次脱Fmoc;连接第九个侧链带有羟基(巯基或氨基)并被选择性基团保护的Fmoc氨基酸并脱Fmoc;再继续依次连接后面的三个Fmoc氨基酸并脱Fmoc;连接脂肪酸后,再选择性的脱去第九个氨基酸侧链羟基(巯基或氨基)上的保护基团,然后将其与最后一个Fmoc氨基酸的羧基进行反应,脱Fmoc;再脱去第一个氨基酸α-羧基的保护基团后,直接在固相树脂上进行环合,随后将产物从树脂上剪切下来,经冷乙醚沉淀,收获产品.全固相合成制备方法解决了达托霉素固液相合成法中犬尿氨酸和3-甲基谷氨酸自然来源稀少的弊端,为临床药物筛选提供了更广的来源. 达托霉素作为应用到临床的首个环脂肽类抗生素,鲜有交叉耐药菌的报道,这在医院院内感染严重、高致病耐药菌肆虐的今天,显得尤为重要.自2003年起,达托霉素药物在美国、德国、英国和荷兰陆续上市[14].2010年,中国SFDA也批准阿斯利康公司对克必信(注射用达托霉素)产品在国内免注册临床试验并授予上市许可.但是由于专利保护等原因,玫胞链霉菌不易得,且发酵过程需要精密控制,下游纯化过程对设备级别及技术的要求都很高,目前在国内还未见药厂对达托霉素开始工业化生产.因此,开发扩大达托霉素的药物来源,使国内拥有该药物的自主研发生产能力,有待众多学者的进一步努力.【相关文献】[1] 崔玉彬.处于临床试验研究阶段的抗生素候选药物总览[J].国外医药:抗生素分册,2011,32(2):79-82.[2] 顾觉奋,戴君.新一代抗MRSA抗生素的临床研究进展[J].抗感染药学,2009,6(4):223-228.[3] 王玮,穆青.从天然产物到药物-达托霉素的发展历程[J].国外医药:抗生素分册,2009,3(2):59-62.[4] Baltz RH,Miao V,wrigley SK.Natural products to drug daptomycin and relatedlipopepride antibiotics[J].Nat Prod Rep,2005,22(6):717-741.[5] 史丽娟,石磊.新型抗革兰阳性菌药物---达托霉素[J].中国医药导刊,2008,10(7):1100-1102.[6] 张石革.糖肽和环脂肽抗生素的进展与临床评价[J].中国医院用药评价与分析,2009,9(2):88-89.[7] Schriever CA,Fernandez C,Rodvold KA.Daptomycin:A novel cyclic lipopeptide antimicrobial[J].Clinical Review,2005,62(11):1145-1158.[8] Boaretti M,Canepari P.Purification of daptomycin binding proteins(DBPs)from the membrane of enterococcushirae[J].New Microbiol,2000, 23(3):305-317.[9] 卜一珊,崔蓉.新的抗革兰阳性菌药物---达托霉素[J].中国药师,2005,8(7):594-595.[10] Baltz RH,McHenney MA,Cantwell CA,et al.Applications of transposition mutagenesis in antibiotic producing streptomycetes[J].Kluwer Academic Publishers,1997,71(1-2):179-187.[11] Miao V,Coëffet-LeGal MF,Brian P,et al.Daptomycin biosynthesis in Streptomyces roseosporus:cloning and analysis of the gene cluster and revision of peptide stereochemistry[J].Microbiology,2005,151(5): 1507-1523.[12] 徐红岩,陆婷婷.一种达托霉素的合成方法:CN,101235080A[P]. 2008-08-06.[13]钦传光,任锦,牛卫宁,等.达托霉素类似物及其全固相合成制备方法:CN,101696235A[P].2010-04-21.[14] 韩培,陈继业,王岩,等.达托霉素生物合成研究进展及临床研究[J].中国医药工业杂志,2011,42(6):466-471.。

环脂肽类抗生素达托霉素的研究进展作者：章艳玲来源：《中国化工贸易·下旬刊》2018年第08期摘要：达托霉素是一种具有新型作用机理的能有效抑制耐药性病原菌的环脂肽类新型抗生素。

本文主要对达托霉素的作用机制、合成方法和临床应用进行综述，以期为达托霉素的研究提供一定思路。

关键词：达托霉素；作用机制；合成方法；临床应用达托霉素是玫瑰孢链霉菌发酵产物脂肽类化合物A21978C的N-癸酰基衍生物，是由玫瑰孢链霉中通过非核糖体蛋白合成酶（NRPS）机制合成的由13个氨基酸和一个正癸酸脂肪酸尾组成的环脂肽类新型抗生素[1]，其在体外对大多数革兰氏阳性菌均有抑制作用，而且对许多耐药菌，如耐万古霉素的肠球菌（VRE）、耐甲氧西林的金黄色葡萄球（MRSA）和凝固酶阴性的葡萄球菌（CNS），仍具有较强的活性[1-2]，被公认为万古霉素的最佳替代品。

近年来，达托霉素的有关研究报告有很多[3-8]，本文从达托霉素的作用机制、合成方法和临床应用方面进行报道。

1 达托霉素的作用机制达托霉素通过钙离子（Ca2+）依赖的方式靶向革兰氏阳性菌细胞膜。

最新的研究表明在枯草芽孢杆菌中，达托霉素优先插入到富含液脂的部位，造成细胞膜双分子层的扭曲，导致液脂聚集到插入位点补偿细胞膜流动性受到的影响。

催化细胞壁和细胞膜磷脂合成的关键酶定位于细胞膜中富含液脂的位置，如负责催化脂质II（lipidII）最后一步合成的MurG，催化磷脂合成的PlsX等。

达托霉素阻碍了MurG和PlsX 等重要蛋白与液脂的结合，导致蛋白定位异常和功能受损[8]。

通过干扰细胞膜磷脂的结构，扰乱细胞膜对氨基酸的转运，从而阻碍细菌细胞壁肽聚糖的生物合成，细胞壁的破损最终导致细胞裂解和细菌死亡。

另外，它还能通过破坏细菌的细胞膜，改变细胞质膜的性质，使其内容物外泄而达到杀菌的目的，因此细菌对达托霉素产生耐药性可能会比较困难[8]。

2 达托霉素的合成方法2.1 酶法半合成达托霉素达托霉素及A-21978C相关衍生物的最初制备是采用酶法半合成工艺。

2020年第1卷第6期|Syn thetic Bio logy J ournal2020，1（6）：722-731达托霉素生物合成过程的调控机制研究进展方教乐1，2，吕中原1，2，孙晨番1，2，刘一帆1，2，徐炜锋1，2，毛旭明1，2，李永泉1，2（1浙江大学药物生物技术研究所，浙江杭州310058；2浙江省微生物生化与代谢工程重点实验室，浙江杭州310058）摘要：微生物是天然产物类药物的重要来源之一，其中许多链霉菌来源的抗生素类药物一直活跃在对付细菌感染的前沿阵地。

然而随着“超级细菌”的陆续发现，以及新药研发速度的滞缓，人类尚缺乏“超级细菌”的最终治疗手段。

达托霉素是由玫瑰孢链霉菌（Streptomyces roseosporus ）经发酵产生的一种新型环脂肽类抗生素，由于其独特的结构及特殊的药物机制，被视为多重耐药革兰阳性细菌引起的重症感染的最后一道防线。

然而在工业发酵过程中，达托霉素的生物合成水平很低，有极高的提升潜力。

本文总结了近年来国内外相关达托霉素合成的调控机制研究，包括调控蛋白的挖掘、途径特异性调控机制、级联调控途径、脂酰前体合成途径、GBL 信号途径与磷酸双组分系统及其协同调控机制等，揭示了次级代谢调控网络的复杂性，并阐述了通过调控通路重构实现达托霉素优质高产的策略。

关键词：达托霉素；生物合成；调控网络；A 因子级联调控途径；磷酸双组分系统中图分类号：Q939.97文献标志码：AAn overview on regulatory mechanism of daptomycin biosynthesisFANG Jiaole 1，2，LYU Zhongyuan 1，2，SUN Chenfan 1，2，LIU Yifan 1，2，XU Weifeng 1，2，MAO Xuming 1，2，LI Yongquan 1，2（1Institute of Pharmaceutical Biotechnology ，Zhejiang University ，Hangzhou 310058，Zhejiang ，China ；2Zhejiang ProvincialKey Laboratory for Microbial Biochemistry and Metabolic Engineering ，Hangzhou 310058，Zhejiang ，China ）Abstract:Daptomycin is a new cyclic lipopeptide antibiotic,produced by Streptomyces roseosporus ,with strong resistance to Gram-positive bacteria.Due to its special manner to block the biosynthesis of peptidoglycan,it is difficult for bacteria to develop resistance to daptomycin.Therefore,daptomycin is also known as the ‘last line of defense ’after vancomycin.After approval of daptomycin for injection (brand name cubicin)used to treat infections caused by some sensitive Gram-positive strains,domestic daptomycin products still mainly rely on imports to keep up with demand.In response to this urgent need,there have been many studies on the structure,收稿日期：2020-03-10修回日期：2020-11-05基金项目：国家新药创制重大专项（2018ZX09711001-006-013）；国家自然科学基金（3173002和31520103901）引用本文：方教乐，吕中原，孙晨番，刘一帆，徐炜锋，毛旭明，李永泉.达托霉素生物合成过程的调控机制研究进展［J ］.合成生物学，2020，1（6）：722-731Citation：FANG Jiaole，LY U Zhongyuan，SUN Chenfan，LIU Yifan，XU Weifeng，MAO Xuming，LI Yongquan.An overview on regulatory mechanism of daptomycin biosynthesis ［J ］.Synthetic Biology Journal，2020，1（6）：722-731DOI :10.12211/2096-8280.2020-020特约评述第1卷physicochemical properties,functional mechanisms and synthesis of daptomycin.The biosynthetic pathway of daptomycin has no typical pathway-specific regulators,suggesting that its synthetic regulation may have a unique mechanism.Based on analysis of daptomycin biosynthetic gene cluster,this article mainly summarizes researches on the regulatory mechanism during daptomycin biosynthesis.Screening and identifying regulatory pathways for daptomycin biosynthesis is of great significance for enriching the secondary metabolic regulation of streptomyces, and will also provide important candidate targets for improving daptomycin production.This review aims to give directions for the targeted transformation to obtain high-yield strains more efficiently,and to provide a theoretical reference for the improved biosynthesis of daptomycin.The regulation of microbial secondary metabolism can be divided into three levels,namely global regulation,pleiotropic regulation and pathway-specific regulation. Through analyzing and constructing a regulatory network for the synthesis of secondary metabolites,we can see the key targets of genetic transformation and provide an entry point for high-yield strategies for secondary metabolism,thereby helping us to more effectively carry out targeted high-yield transformation of bacteria and increase the yield of metabolites.With the identifications of gene functions in the daptomycin synthesis gene cluster and the clarification of the daptomycin biosynthesis regulatory network,more genetically targeted transformation and breeding optimization methods have emerged.At the same time,with the development and optimization of the fermentation process,the goal of greatly increasing production of daptomycin biosynthesis in China can be achieved.Keywords:daptomycin;biosynthesis;regulatory network;A-factor;PhoR-PhoP20世纪70年代青霉素的发现，以及之后不断研发出来的抗生素，成为对付病菌感染的有效武器；但抗生素的过度使用，导致了致病菌特别是革兰阳性菌产生耐药性，形势日益严峻。