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第一章绪论一、生物药物的定义生物药物是指运用生物学、医学、生物化学等的研究成果，利用生物体、生物组织、体液或其他代谢产物，综合应用化学、生物技术、分离纯化工程和药学等学科的原理与方法加工、制成的一类用于预防、治疗和诊断疾病的物质。
四、生物药物的分类（一）、按照药物的化学本质和化学特性分类1、氨基酸类药物及其衍生物2、多肽和蛋白质类药物3、酶类药物4、核酸及其降解物和衍生物5、多糖类药物6、脂类药物7、维生素（二）、按原料来源分类1、人体组织来源的生物药物2、动物组织来源的生物药物3、微生物来源的生物药物4、植物来源的生物药物5、海洋生物来源的生物药物（三）、按功能用途分类1、治疗药物2、预防药物3、诊断药物4、其他用途五、我国生物药物面临的问题，如何解决？新药物研发周期长，研发费用高昂，成功率低，上市后专利有效期短，商业化压力大等。
创新和变革第二章生物药物的质量管理和控制一、生物药物质量检验的程序与方法1、取样2、鉴别3、检查4、含量测定5、写出检验报告二、药物的ADME的定义药物在体内的整个过程通常用ADME表示，A表示吸收，即药物在体内的吸收；D表示分布即药物在体内的分布，；M表示代谢，即药物在体内的代谢转化；E表示排泄，即药物及其代谢产物自体内的排除三、生物药物常用的定量分析方法1、酶法2、电泳法（包括自由界面电泳、区带电泳和高效毛细管电泳）3、理化测定法4、生物检定法四、什么叫基因工程药物？GMP、GLP、GCP的定义？1、采用新的生物技术方法，利用细菌、酵母或哺乳动物细胞作为活性宿主，进行生产的作为治疗、诊断等用途的多肽和蛋白质类药物。
2、GMP—药品生产质量管理规范GLP—药品非临床研究质量管理规范GCP—药品临床研究质量管理规范第三章抗生素的概述一、抗生素的定义抗生素是生物再其生命活动过程中产生的（或并用化学、生物或生物化学方法衍生的）、在低微浓度下能选择性地抑制他种生物机能的化学物质。
代谢工程之利用谷氨酸棒状杆菌来生产L-精氨酸精氨酸是一种为不同工业和医疗产品所应用的重要的氨基酸。
这里我们报道了代谢工程中利用谷氨酸棒状杆菌来生产精氨酸的改进方法。
首先进行的是随机诱变，来增加谷氨酸棒状杆菌对精氨酸类似物的耐受性。
接下来进行是系统性的代谢工程来进一步对菌株进行改良。
涉及精氨酸操纵子调控阻遏物的去除，NADPH水平的最优化，破坏L-谷氨酸的生成来增加精氨酸的前体物质还有限制精氨酸合成反应的通量优化。
最终菌株的流加培养发酵在5L和大规模1500L的生物反应器中进行，分别允许生产92.5g/L和81.2g/L的精氨酸，产量为每g 碳源（葡萄糖加蔗糖）可分别产出0.40g和0.35g精氨酸。
这里描述的系统代谢工程结构对于构建棒状杆菌菌株来进行精氨酸及相关产品的工业生产是有用的。
L-精氨酸是一种工业中重要的半必需氨基酸，它在食品和补加健康食品、制药以及化妆品中有很多应用。
与其他的氨基酸和有价值的化学物质相比，利用谷氨酸棒状杆菌作为精氨酸生产工程菌有很大优势，因为它带有强烈的面向L-谷氨酸形成的通量。
跟大肠杆菌相比，谷氨酸棒状杆菌不含有argA和argE基因，但取而代之，它含有可以编码乙酰转移酶的argJ基因，可以催化两种不同的精氨酸生物合成途径的生化反应。
重要的是，谷氨酸棒状杆菌缺乏精氨酸降解酶以及在大肠杆菌中发现的精氨酸脱氨酶，因此，细胞内生产的精氨酸不能被积极地降解。
可被谷氨酸棒状杆菌利用的碳源范围也相对广阔，包括己糖和戊糖两种。
对于精氨酸的过度生产来说，调节子对精氨酸生物合成操纵子的抑制以及精氨酸对乙酰谷氨酸激酶的反馈抑制在谷氨酸棒状杆菌中被显著地移除了。
在这次研究中，我们针对谷氨酸棒状杆菌ATCC 21831菌株进行代谢工程研究，最初经过随机诱变来增强精氨酸的产量。
逐步地合理地代谢工程建立在针对通过菌株工程步骤实现的精氨酸产量逐步增加的代谢结果的分析的基础上。
由本次研究建立的最终菌株的流加培养获得了有效的精氨酸产量，使用5L和大规模1500L生物反应器使浓度分别达到92.5和81.2g/L。
放线菌萜类化合物生物合成研究进展李文利;湛桂花;郑华【摘要】萜类化合物(Terpenoids)是自然界中化学结构最为丰富的一类化合物.近年来,从放线菌中分离到了一系列结构新颖的萜类化合物.通过直接克隆或基因组采掘(Genome mining)的方法,它们的生物合成基因簇被相继分离和鉴定,从而推动了放线菌中萜类化合物生物合成途径及关键酶的分子作用机理的研究.文章主要综述了近5年放线菌萜类化合物生物合成研究进展.%Terpenoids are the most diverse class of natural products. Recently, a series of terpenoids with novel structures have been isolated from actinomyces. Their biosynthetic gene clusters have been identified and characterized either by direct cloning or genomic mining, which promoted investigations of their biosynthetic pathways, as well as the key enzymatic mechanisms. This paper provides a brief overview of the major research published in the last five years.【期刊名称】《遗传》【年(卷),期】2011(033)010【总页数】6页(P1087-1092)【关键词】放线菌;萜类化合物;生物合成;基因簇;直接克隆;基因组采掘【作者】李文利;湛桂花;郑华【作者单位】中国海洋大学医药学院海洋药物教育部重点实验室,青岛266003;中国海洋大学医药学院海洋药物教育部重点实验室,青岛266003;中国海洋大学医药学院海洋药物教育部重点实验室,青岛266003【正文语种】中文萜类化合物(Terpenoids)又称类异戊二烯(Isoprenoids), 是自然界中结构多样性最为丰富的一类化合物[1～4], 其基本结构骨架是由异戊二烯(C5)单元组成的, 根据所含 C5数目的不同, 可分为单萜(Monoterpenes, C10)、倍半萜(Sesquiterpenes,C15)、双萜(Diterpenes, C20)、三萜(Triterpenes, C30)和四萜(Tetraterpenes,C40)。
综合实验2：土霉素摇瓶发酵实验一、实验目的1、 熟悉放线菌的微生物学特性及培养方法2、 了解和掌握种子制备和摇瓶发酵技术和方法3、 了解抗生素发酵的一般规律和代谢调控理论4、 熟悉和掌握常用的比色分析方法的操作技术二、实验原理土霉素是四环类抗生素，其在结构上含有四并苯的基本母核，随环上取代基的不同或位置的不同而构成不同种类的四环素类抗生素。
其结构和命名如图。
R 1 R 2 R 3 R 4 R 5 土霉素 H OH CH 3 OH H 四环素 H OH CH 3 H H 金霉素 Cl OH CH 3 H H 去甲基金霉素 Cl OH H H H 多西环素 H H CH 3 OH H 米诺环素 N(CH 3)2 H H H H美他环素H =CH 2OHCH 2(NH)CH(COOH)(CH 2)4NH 2土霉素具有广谱抗菌性，能抑制多种细菌、较大的病毒及一部分原虫。
土霉素能抑制细菌的生长，在浓度高的时候也具有杀菌的作用。
它的作用机制是干扰蛋白质的合成。
由于它的毒副作用小，所以其在医疗上用途广泛，主要是应用于呼吸道和肠道感染。
土霉素是由龟裂链丝菌产生的，属于放线菌中的链霉菌属，它们具有发育良好的菌丝体，菌丝体分支，无隔膜，直径约0.4～1.0米，长短不一，多核。
菌丝体有营养菌丝、气生菌丝3N2H R 5C H 3 41和孢子丝之分，孢子丝再形成分生孢子。
而龟裂链丝菌的菌落灰白色，后期生褶皱，成龟裂状。
菌丝成树枝分支，白色，孢子灰白色，柱形。
龟裂链丝菌的菌落形态显微镜观察的菌丝特征土霉素是典型的次级代谢产物，其发酵的特点之一就是分批过程分为菌体的生长期、产物期和菌体期三个阶段。
龟裂链丝菌的生长和土霉素的生物合成受到许多发酵条件的影响：温度、发酵pH值、溶氧、接种量、泡沫等。
同时还受到一些代谢调控机制的控制：磷酸盐的调节作用、ATP的调节和产生菌生长速率的调节等。
三、仪器与材料（一）培养基1、斜面高氏一号培养基可溶性淀粉2% 氯化钠0.05% 硝酸钾0.1% 三水磷酸氢二钾0.05%七水硫酸镁0.05% 七水硫酸亚铁0.001% 琼脂1.5%-2.0% pH：7.4-7.62、种子培养基淀粉3% 黄豆饼粉0.3% 硫酸铵0.4% 碳酸钙0.5% 玉米浆0.4% 氯化钠0.5% 磷酸二氢钾0.015% pH：7.0-7.23、发酵培养基淀粉15% 黄豆饼粉2% 硫酸铵1.4% 碳酸钙1.4% 氯化钠0.4% 玉米浆0.4% 磷酸二氢钾0.01% 氯化钴10µg/ml 消沫剂0.01% 淀粉酶0.1%-0.2% pH：7.0-7.2（二）实验菌种：龟裂链丝菌（购于广东省微生物研究所）（三）仪器：玻璃试管、试管架、吸管（1ml，2ml，10ml）、吸耳球、离心管、容量瓶、烧杯、三角瓶（250 ml，500ml）、量筒（250ml，500ml，1000ml）、玻璃棒、试纸、塑料漏斗、电炉、接种铲（针）、振荡培养箱、恒温箱、台秤等四、实验步骤1．斜面孢子的制备无菌条件下，从冷藏的产生菌的斜面孢子中，刮取适量孢子涂在高氏斜面上，然后置36.5～37℃的恒温箱培养3天，再置30℃的恒温室培养1天。
名词解释发酵工程:是利用微生物的生长代谢活动来生产各种有用生物化学产品的技术过程。
代谢调节：是指在代谢途径水平上酶活性和酶合成（酶量）的调节。
组成酶：细胞内总是适量存在的，不依赖于酶底物或底物结构类似物的存在而合成的酶。
诱导酶：依赖于酶底物或底物结构类似物的存在而合成的酶。
其基因以隐性状态存在于染色体中。
分解代谢物阻遏：微生物与容易同化的碳源或氮源相接触，使有些酶的合成速率相对降低的作用。
反馈阻遏：生物合成途径的终点代谢产物极其衍生物在转录的水平上抑制该途径的所有酶的生物合成。
反馈抑制：是微生物细胞中变构调节的典型方式，因此非常重要，应用广泛。
概念：生物合成途径的最终代谢产物抑制该途径的前面第一或第二个酶的催化活性。
通过变构调节进行抑制初级代谢产物：是微生物在生长过程中产生的、为菌体生长所必须的小分子化合物，包括单糖、氨基酸、核苷酸维生素以及用来合成这些物质的小分子物质。
次级代谢产物：又称次生代谢产物或分化代谢物，是由微生物在生长后期产生的，为菌体生长非必须但对产生菌的生存具有一定价值的，分子结构相对复杂的小分子化合物。
操纵子：指启动基因、操纵基因和一系列紧密连锁的结构基因的总称。
转录的功能单位。
很多功能上相关的基因前后相连成串，由一个共同的控制区进行转录的控制，包括结构基因以及调节基因的整个DNA序列。
操纵基因：操纵子中与阻遏物结合的一段特定核苷酸序列。
对相邻的结构基因的转录活动有控制作用。
代谢控制发酵：用人工诱变的方法，有意识地改变微生物的代谢途径，最大限度地积累产物，这种发酵形象地称为代谢控制发酵，最早在氨基酸发酵中得到成功应用。
原生质体：在高渗溶液中出去细胞壁的细胞。
培养基：选用各种营养物质，经配制成适合不同微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质。
糖化：在工业生产上将淀粉水解为葡萄糖的过程，得到的水解糖液叫淀粉糖。
前体物质：最终所需的代谢产物的前身或其结构中的一部分。
在生物合成中直接结合到产物分子中，自身结构变化不大，能显著提高产量的小分子物质。
代谢调控下放线菌抗生素生物合成的不同方法
放线菌基因组中存在大量沉默的次级代谢产物生物合成基因簇，可以作为药物开发的重要来源，下面是小编搜集的一篇关于代谢调控下放线菌抗生素生物合成方法探究的，欢迎阅读借鉴。
微生物能够产生多种具有生物活性的次级代谢产物，其中大部分活性次级代谢产物来源于放线菌[1],这些物质具有抗菌、抗肿瘤、杀虫、免疫抑制和免疫激活等功效，被广泛地应用于业、农业、兽业、食品工业等领域。近年来，随着抗生素耐药菌的不断出现，深入研究放线菌的次级代谢调控过程，提高放线菌抗生素的生物合成，发现和生产新抗生素变得越来越迫切。
代谢调控是通过重组DNA技术或其他技术，有目的地改变生物体中已有的代谢网络和表达调控网络，改善细胞的性能，并用于化学转化、能量转移及大分子装配的过程。本文总结了通过代谢调控来提高放线菌抗生素生物合成的不同方法(图1),主要包括调节调控基因表达，增加基因簇拷贝数及基因簇的异源表达，过表达抗性基因和转运基因，提高前体代谢通量和核糖体工程。
1、调节调控基因的表达 抗生素的生物合成基因一般成簇存在，除了含有结构基因之外，通常还包含调控基因以及抗生素的抗性基因和转运基因。抗性基因、调控基因和转运基因组成了一种协同机制，共同调控抗生素的生物合成。
调控因子是一类在基因表达调控中，能直接或间接地识别或结合在各顺式作用元件序列上，参与调控靶基因转录效率的蛋白质。抗生素生物合成基因簇的转录起始普遍依赖全局或途径特异调控蛋白的调控。全局调控因子不仅调控多种抗生素的产生，还参与放线菌的形态学分化，其调控的方式较为复杂和广泛。而途径特异性调控因子主要参与特定的抗生素的生物合成过程，与全局调控因子相比，其调节的方式更为直接。有些调控因子既可以作为全局调控因子，也可以对抗生素的生物合成进行途径特异性调控。例如TetR家族转录调节因子(TetRfamilytranscriptionalregulator,TFR).
TFRs是一类常见的原核转录调控蛋白家族，参与调控多种代谢和生理过程，如抗生素的生物合成、三羧酸循环和生物膜的形成。TFRs通常以同源二聚体的形式存在，每一个单体包括一个相对保守的N端DNA结合(DNB)区域，一个C端配体结合和聚合作用(LBD)区域。通常DNB区域具有保守的螺旋-转角-螺旋的特征性结构，而LBD区域则根据结合配体的不同而表现出序列和结构的多样性。
TFRs的C端区域介导自身形成同源二聚体，二聚体化的TFRs的N端DNB结构域与被调控基因的上游启动子区域结合，使RNA聚合酶-启动子转录复合物不能转变成有效的转录状态，从而阻止下游受调控基因的转录起始[3].但是当TFRs与小分子配体结合后，会使构象发生改变并从DNA上解离，从而启动下游基因的转录[4].
1.1途径特异性调控因子 途径特异性调控基因一般存在于次级代谢产物的生物合成基因簇内，主要包括链霉菌抗生素调控蛋白(SARP)家族。途径特异性调控因子的作用分为正向调节和负向调节，通过途径特异性正调控基因的过表达，负调控基因的敲除可以提高抗生素的生物合成。近年来，途径特异性调控因子应用于提高放线菌抗生素的生物合成取得了较多的进展(表1).
Zhu等[5]从深海放线菌(Marinactinosporather-motoleransSCSIO00652)中发现了一种核苷类抗生素A201A,利用全基因组扫描(whole-genomescan-ning)技术，对基因组片段化后建立的基因组文库进行测序，识别并确证了其生物合成基因簇，并通过序列比对分别推测了基因簇中不同基因的功能，查找并验证了一个负向调控基因mtdA.HPLC分析基因敲除菌株的发酵提取物，发现抗生素A201A的产量提高了近25倍。
Zhang等[6]发现PapR6是普那霉素(pristina-mycinII)生物合成的一种途径特异性激动剂，papR6基因敲除菌株普那霉素的产量明显降低，过表达papR6基因后的菌株普那霉素的合成明显增加。凝胶阻滞实验(electrophoreticmobilityshiftassay,EMSAs)分析表明：PapR6蛋白与snaF基因的上游区域发生特异性结合。snaF基因是snaFE1E2GHIJK操纵子的第1个基因，负责前体异丁酰基辅酶A和中间体C11α，β-不饱和硫酯的生成。转录分析结果表明，papR6基因敲除后的菌株snaFE1E2GHIJK操纵子的表达量明显减少。这些结果证明了PapR6调控因子通过直接调控结构基因snaF的表达上升，增加前体和中间体的产生，从而提高普那霉素的生物合成。
1.2全局调控因子 除了途径特异性调控因子以外，全局调控因子则是位于抗生素生物合成基因簇之外，可以调控多种次级代谢途径，并不局限于一种抗生素的生物合成途径，因此其调控的范围更加广泛、模式更加复杂。近年来，全局调控因子应用于提高抗生素生物合成并取得了较多进展(表2).
Crp是天蓝色链霉菌Streptomycescoelicolor的一种全局调控因子，与菌体的形态学分化有关。
Gao等[15]首次证明了Crp参与了调控链霉菌的次级代谢和抗生素的生物合成。利用染色质免疫共沉淀-芯片(ChIP-chip)技术分析Crp蛋白的基因结合位点，在22个与次级代谢相关的基因簇中，有8个是与Crp蛋白结合的位点。对这些次级代谢基因进行转录分析，发现基因的转录水平明显受到了影响，其中有6个基因簇与ChIP-chip技术分析的Crp蛋白的结合位点相同。crp基因敲除后的菌株抗生素Act、Red和CDA的生物合成明显下降。这些数据都表明Crp蛋白可以通过与抗生素的生物合成基因簇相互作用，从而影响多种次级代谢过程，在天蓝色链霉菌中作为一种全局正向调控因子，调控多种抗生素的生物合成。
WblA(sco)是天蓝色链霉菌中的一种全局负调控因子，负调控抗生素Act、Red和CDA的产生[20-21].Rabyk等[22]在链霉菌Streptomycesgha-naensis中发现了wblA(gh)基因，敲除该基因后，默诺霉素(moenomycin)的产量增加了2.3倍。
Noh等[23]构建了一个阿霉素(doxorubicin,DXR)和道诺霉素(daunorubicin,DNR)高产菌株的全基因库，以wblA(sco)作为探针，利用种间DNA微矩阵分析(interspeciesDNAmicroarrayanalysis),发现链霉菌Streptomycespeucetius中存在wblA(spe)与wblA(sco)具有95%的氨基酸序列相似度。基因wblA(spe)敲除后的菌株，DXR和DNR的产量有将近70%的增长。这些结果表明：wblA(spe)和wblA(gh)、wblA(sco)一样，是一种全局负调控基因，调控多种抗生素的生物合成。wblA基因广泛存在于各种链霉菌中，负调控各类抗生素的生物合成。
2、调控抗生素生物合成基因簇的表达 2.1增加抗生素生物合成基因簇的拷贝数 在抗生素的生物合成基因簇已知的条件下，增加基因簇的拷贝数可以达到直接增加抗生素生物合成的目的，但是由于同样受到其他调控因素的影响，抗生素的产量提高有限。井冈霉素A(validamycinA,VAL-A)是一种抗真菌类抗生素，用于治疗水稻和其他植物的纹枯病。Zhou等[27]通过在链霉菌Streptomyceshygro-scopicus5008中集成zouA-介导的DNA扩增系统，在VAL-A基因簇内部扩增了约3~5个VAL-A的生物合成基因簇，工程菌摇瓶培养后，VAL-A的产量比野生菌株提高了34%.
Liao等[28]在尼克霉素的产生菌Streptomycesansochromogenes7100的染色体中插入了35kb的尼克霉素生物合成基因簇，工程菌的尼克霉素产量明显提高。其中尼克霉素X产量达到880mg/L,是野生菌株的4倍;尼克霉素Z的产量达到180mg/L,是野生菌株的1.8倍。
达托霉素(daptomycin)是链霉菌Stretptomycesroseosporus产生的一种天然的环脂肽类抗生素，具有广谱的革兰阳性菌杀菌活性。Liao等[29]在链霉菌Stretptomycesroseosporus中敲除达托霉素的结构基因dptJ,工程菌的达托霉素的产量降低了50%,而dptJ基因加倍的菌株，达托霉素的产量提高了110%.
2.2调控抗生素生物合成基因簇的异源表达由于从自然界中分离的野生菌株对其性质研究有限，代谢网络复杂，中间产物复杂、不稳定或者终产物表达量低，限制了其体内抗生素生物合成途径的研究。构建研究背景清晰的、容易进行基因操作的异源表达的宿主，有利于发掘与研究新抗生素。 较为常用的异源表达宿主有Streptomycescoelicolor、Streptomycesavermitilis以及Streptomyceslividans等。
多种放线菌基因组测序分析结果表明，目前被发现的放线菌次级代谢产物仅为总量的10%,甚至更少[30].基因组挖掘(genomemining)通过生物信息学技术分析基因组序列中酶和基因簇的保守区，识别次级代谢生物合成基因簇，并通过基因技术改造菌株，使低产菌株变高产，激活沉默的生物合成基因簇。基因组挖掘与异源表达结合是激活沉默的生物合成基因簇，发现新抗生素的一种有效的方法(图2).
Luo等[31]应用基因组挖掘技术从链霉菌Streptomycesgnseus中发现了一个沉默的PTM(Pol-ycyclictetramatemacrolactam)生物合成基因簇SGR810-815,应用plug-and-play的合成生物学方法，在基因簇上游加入6种不同来源的启动子，将基因簇重新构建和组装后，在链霉菌Streptomyceslividans中异源表达，其中来源于Cellulomonasflavi-gena的rpsLp启动子使基因簇相比于中等强度的hrdB启动子表达量提高了150倍。通过HPLC-MS分析发酵产物，发现了3种新的PTMs抗生素。
Komatsu等[32]在链霉菌Streptomycesavermitilis中外源表达了20个次级代谢产物的整个基因簇序列，结果发现绝大多数基因得到表达，甚至包括原来沉默的基因，因此异源表达可以作为唤醒沉默基因表达、发现新抗生素的一种手段。
3、调控抗性基因的表达 抗性基因与菌体对抗生素的耐受性有关，当大多数的抗性蛋白都与抗生素结合后，抗生素的量超过宿主菌自身的耐受，抗性蛋白就会抑制相关基因的表达，阻止抗生素生物合成过程的继续。因此，增加抗性基因的表达，提高菌体对自产抗生素的耐受性，可以提高抗生素的生物合成。
