退变髓核细胞拉伸实验的形态学研究

退变髓核细胞拉伸实验的形态学研究
目的：探讨退变髓核细胞拉伸实验对髓核细胞形态学的影响，为临床牵引治疗腰椎间盘突出症提供理论依据。

方法：取椎间盘突出症患者术中取出的废弃髓核组织6例，将培养后的髓核细胞接种到拉伸板上，分别以5%、10%和15%拉伸幅度拉伸24 h，高倍镜下观察细胞形态学变化；腰椎间盘突出症患者使用体重20%、30%、35%牵引力的重量牵引，拍摄牵引前、牵引30 min时的腰椎侧位X线片，测量并计算各椎间隙高度的变化。

结果：退变髓核细胞5%幅度拉伸24 h后髓核细胞形态轻度好转，10%幅度拉伸24 h后髓核细胞形态接近正常髓核细胞，15%幅度拉伸24 h后髓核细胞形态变差。

不同组的细胞个数存在统计学差异（P＜0.05），表现为10%拉伸幅度组>5%拉伸幅度组>对照组>15%拉伸幅度组；腰椎间盘突出症患者牵引30 min时三组椎间隙增加幅度存在统计学差异（P＜0.05），表现为20%体重组5% tensile range group>the control group>15% tensile range pared with the increasing range of intervertebral space before and after traction，there was significant difference（P＜0.05）.The increasing range of intervertebral space showed that 20% weight group＜30% weight group＜35% weight group.Conclusion：The restoration of degenerative nucleus pulposus cells is slow by using the tensile range of 5%.It is no good for the restoration of degenerated nucleus pulposus cells by using the tensile range of 15%.The restoration of degenerative nucleus pulposus cells is fast by using the tensile range of 10%.It is suitable for the patients with lumbar disc herniation by using the weight of 30% of their body weight.【Key words】Human nucleus pulposus cells；Degeneration；Tensile；Morphological
脊柱退变始于椎间盘，30岁后即可发生，生物力学的改变及外力的作用使椎间盘退变进一步加剧，引起纤维环撕裂最终导致椎间盘膨出或突出而出现一系列临床症状[1]。

腰椎间盘突出症是一种常见多发病，以腰痛、下肢放射性疼痛为特点，可严重影响患者的工作和生活，大多数患者可以通过非手术治疗取得满意的疗效[2]。

牵引治疗腰椎间盘突出症有明显效果，是非手术治疗腰椎间盘突出症的主要方法之一。

椎间盘体内环境复杂，互相影响因素多，研究其退变机制比较困难。

但将椎间盘细胞或组织分离出来并置于人工环境中培养制备模型，能够排除干扰因素而针对单因素研究，容易控制人为干预，是研究椎间盘退变机制及其治疗的好方法[3]。

本研究通过对人退变髓核细胞的拉伸来模拟临床中牵引治疗腰椎间盘突出症，比较拉伸前后退变髓核细胞形态学及细胞数量的变化，结合临床牵引对椎间隙拉伸幅度的改变，为临床上腰椎间盘突出症牵引治疗提供一定的理论依据。

1 材料与方法
1.1 退变髓核细胞的拉伸实验
1.1.1 髓核细胞的培养选择2012年9-12月在本科手术治疗的腰椎间盘突出症志愿者60例，男30例，女30例，年龄55～67岁。

取术中废弃髓核组织（伦
理委员会审核同意）经病理检查证实为退变椎间盘组织，于无菌条件下提取髓核细胞并原代培养[4-5]，培养7～15 d，待细胞贴满瓶底且呈类圆形或梭形时，经处理后吹匀细胞并接种到BioFlex细胞培养板，于恒温37 ℃、恒湿的CO2孵箱内继续培养48 h，高倍镜下观察细胞形态。

1.1.2 Flexcercell 4000柔性基底拉伸系统的组成及原理采用美国Flexercell 公司生产的细胞柔性基底加载装置（FX-4000 tension，太原理工大学生物力学实验室），本装置由计算机控制器、负压输出控制器、负压真空泵、基底板、密封垫、载入平台及BioFlex培养板组成，用来对体外培养的组织或细胞施加拉伸。

该系统是通过一个真空泵抽吸特制的柔性细胞培养膜，形成负压而使培养膜产生拉伸应力，使黏附生长的细胞受到拉伸张力的作用[6]。

细胞所受力的大小与培养膜的牵拉幅度呈正比，整个加载装置放置于恒温37 ℃、恒湿的CO2孵箱内，加载程序由FX-4000软件自动控制。

1.1.3 加载程式程式：胶原I型基底膜；空白对照组（A组）、5%拉伸幅度组（B组）、10%拉伸幅度组（C组）及15%拉伸幅度组（D组）；加载时间24 h，频率0.1 Hz，波形为正弦波。

1.1.4 退变髓核细胞的接种、拉伸将培养瓶中髓核细胞以1×104个/mL的密度接种到BioFlex培养板上，孵箱内培养48 h，细胞贴壁、融合生长后更换为10%胎牛血清的DMEM/F12高糖培养液，依预定程式进行加载，加载完成后卸载，高倍镜下拍照。

1.2 临床腰椎间盘突出症的牵引实验对经MRI证实的L3/4、L4/5及L5/S1椎间盘突出症患者（男性志愿者，55岁，体重80 kg），用多功能牵引床分别以体重的20%、30%、35%牵引力（当牵引力达体重的40%时，志愿者无法耐受）各牵引6次，1次/d。

检查腰椎间盘突出症的理想手段为CT和MRI，但随着X 线设备的发展，CR的出现，诊断精确度越来越高，因此X线检查仍具有重要的临床价值及意义[7]。

拍摄牵引前、牵引30 min时床旁腰椎侧位X线片（移动式DR X线机），测量各椎间隙高度。

以牵引前L3/4、L4/5及L5/S1椎间隙作标准，比较牵引30 min时各椎间隙高度的变化（%），即得出L3/4、L4/5及L5/S1椎间隙牵引增加的幅度。

牵引实验分为三组，即20%体重牵引组、30%体重牵引组和35%体重牵引组，比较三个牵引组经过牵引30 min时各椎间隙增高程度的差异。

1.3 统计学处理采用PEMS 3.1统计学软件对数据进行处理，计量资料以（x±s）表示，三组比较采用方差分析，三组间两两比较采用方差分析，计数资料比较采用字2检验，以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果
2.1 牵引实验
2.1.1 牵引前后各组腰3/4的椎间隙高度的比较由表1可知，牵引前三组腰3/4椎间隙高度无统计学差异（P>0.05），牵引30 min时三组椎间隙高度和牵引
前后椎间隙增加幅度均存在统计学差异（P＜0.05），表现为20%体重组0.05），牵引30 min时三组椎间隙高度和牵引前后椎间隙增加幅度均存在统计学差异（P ＜0.05），表现为20%体重组0.05），牵引30 min时三组椎间隙高度和牵引前后椎间隙增加幅度均存在统计学差异（P＜0.05），表现为20%体重组<30%体重组<35%体重组，且各组牵引前后的椎间隙高度存在统计学差异（P＜0.05）。

2.2 细胞实验
2.2.1 退变椎间盘髓核细胞拉伸前后比较图1为拉伸24 h后未经染色的退变髓核细胞：A为对照组；B为5%拉伸幅度；C为10%拉伸幅度；D为15%拉伸幅度。

对比退变髓核细胞拉伸前后细胞形态，A组呈类圆形、梭形及星形，且生长滞缓、细胞折光性差，有明显老化现象。

与A组相比，B组髓核细胞形态多呈类圆形及梭形，星形及不规则形；C组髓核细胞形态则以类圆形为主，突起沿着细胞长轴的两端且细胞突起短而粗，细胞折光性好；D组髓核细胞形态多呈星形及不规则形，细胞体积增大，核变大，细胞突起呈树枝状向四周伸出，部分突起未端呈喇叭状膨大，且有次级突起，细胞折光性差，接近凋亡状态。