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第八章 植物细胞培养及次生物质生产

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第八章 植物细胞培养及次生物质生产

第八章 植物细胞培养及次生物质生产

物中，培养液呈流动状态，进行无菌
培养的一种技术。
固定化培养的优点p95：
细胞生长较缓慢，有利于次生代谢物的积 累； 易于控制培养系统的理化环境和收集产物； 包埋后细胞受到的剪切力损伤减少；
有利于进行连续培养和生物转化；
固定化细胞培养的条件
• 选用固定化细胞培养应具有如下两个条件：
–目的产物应自然分泌到培养液中，或者通过改 变PH值、离子强度或使用渗透剂使之分泌于培 养基中； –要求产物的形成在细胞生长之后。
细胞固定化方法
• 常用的包埋固定方法：
• （1）海藻酸盐固定化
• • 滴入CaCl2使海藻酸盐形成颗粒 滴入NaCl使卡拉胶形成颗粒
• （2）卡拉胶固定化 • （3）琼脂糖固定化
• （4）琼脂固定化
常见的几种植物固定化生物反应器系统
（ b）
• ① 流化床生物反应器：
空气出口
• 细胞包裹在胶粒、金属或泡 沫颗粒中。 • 优点：细胞包埋颗粒小，传 质效率高。 • 缺点：剪切力或碰撞破坏细 胞。
细胞株（Cell Strain)
• 细胞系(Cell line)：经继代培养纯化，获得 的以一种细胞为主的能在体外长期生存的 不均一的细胞群体。 • 细胞株(Cell strain)：从一个经过生物学鉴定 的细胞系用单细胞分离培养或通过筛选的 方法由单胞系增殖形成的、生长速度快、 目标产物含量高、适宜于大规模培养的均 一的细胞群体 。
二、植物细胞培养生产代谢产物的 意义
• 提取：在不同红豆杉属植物树种和树木的不同部 位(如树皮、木材、树叶、嫩枝和幼苗等)含量有 所不同，以树皮、嫩芽中含量最高，心材最低。 一般含量为0.005% 左右。生产1kg紫杉醇需要砍 伐60年生大树3000-4000棵。若光从树皮中提取紫 杉醇，每年需砍伐150-200万棵左右的大树。破坏 宝贵资源、不可持续发展。

第8章植物的细胞培养及次生物质生产

第8章植物的细胞培养及次生物质生产

第8章植物的细胞培养及次生物质生产第8章植物的细胞培养及次生物质生产第1节单细胞培养技术1 单细胞的分离细胞来源:完整的植物器官、培养的组织通过物理的或酶处理的方法获得, 常用分散性较好的愈伤组织或悬浮培养物进行制备.1.1愈伤组织培养选择外植体→表面消毒→接种→培养→继代培养→筛选疏松愈伤组织1.2单细胞的分离方法：1）物理方法：多次继代培养得到的疏松愈伤组织转入液体培养基:a 采用合适方法震荡使细胞分散;b 向细胞悬液中吹脉冲压缩空气；过滤c 在显微镜下用吸管吸取等。

2）化学方法：加秋水仙碱；加草酸盐等；加2,4-D、CH等对分散细胞也有利。

3）酶处理：a)果胶酶；b)纤维素酶；c)葡萄糖苷酶和半乳糖苷酶等。

2 单细胞培养技术2.1平板培养将一定量的细胞接种到或混合到装有一薄层固体培养基的培养皿内进行培养的技术。

每个平板上新形成的细胞团数植板率= ——————————————?100%每个平板上接种的细胞数注意事项:最低起始细胞密度在保证获得高的植板率的前提下,尽量使接种细胞的起始密度降低（条件培养基；有机成分）.选用处于旺盛分裂期的细胞.尽量减少细胞损伤. 在单细胞悬液和融化的琼脂培养基混合时,温度不应超过350 C.最好置于黑暗或弱光下进行培养2.2 条件培养条件培养基：已经进行过一段时间细胞悬浮培养的培养基。

制作方法:配制悬浮细胞培养基→接种愈伤组织或悬浮细胞→培养→离心→上清液固体条件培养基：上清液与加琼脂的灭菌培养基趁热充分混合.2.3 看护培养和饲喂层技术在活跃生长的愈伤组织上培养单细胞,并使之生长和增殖的方法叫看护培养。

用处理过的无活性的或分裂很慢、不具备分裂代谢能力的细胞来饲养所需培养的细胞，使其分裂和生长的方法叫饲喂层培养。

2.4 微室培养：是为了进行单细胞活体连续观察而建立的一种微量细胞培养技术。

微室技术要点：(1) 对微室的要求:制作材料的光学性能要非常好；小室的厚度要符合相差显微镜的要求;选择合适的材料使小室与外界隔绝,应既能防止污染，又保证小室与外界能进行适当的气体交换.(2) 对培养基的要求:选用的培养基要保证微室中的细胞能够生长和分裂,并应有较高的光学透明度.(3) 对所观察的细胞的要求:选用生长旺盛,处于活跃分裂期并易于分散的细胞;细胞壁要较薄,细胞内含物要较少和透明度较高.2.5 其他技术液体浅层培养将欲培养的分散细胞直接接入盛有浅层液体培养基的培养皿中进行培养。

植物细胞培养与次生产物生产

植物细胞培养与次生产物生产

第三节 植物细胞规模化培养
概述
规模化培养体系建立
生物反应器
规模化培养的技术问题
一、 概 述
在植物生物技术中，应用培养细胞系统合成有用的 天然产物，很可能发展成为一个广义的化学工业的 一个组成部分。长期以来，植物一直是许多化学品 的主要资源，特别在制药和食品加工业中更是不可 缺少。据不完全统计，至少有20％左右的药物是由 植物衍生而来的，而且每年都可发现许多植物来源 的新化合物。
大规模培养体系建立
种子细胞选择
外植体选择
高产细胞选择
植物类型：植物细胞的遗传基础是天然产物生产的基本 影响因素，不同植物产生的天然产物种类之所以不同， 从根本上来说是因为它们具有不同的遗传基础。在确定 生产某一种化合物以后，首先必须准确选择那些能够产 生目的化合物的植物种类及其品种或单株。
组织器官：由于天然产物一般为次生代谢产物，而植物 次生代谢产物的积累具有组织器官特异性，因此，在起 始细胞培养时应尽量选择自然状态下产生天然产物的器 官、组织为外植体。
悬浮培养与固体培养比较有三个优点：
一是增加培养细胞与培养液的接触面，改善营养 供应；
二是在振荡条件下可避免细胞代谢产生的有害物 质在局部积累而对细胞自身产生毒害；
三是振荡培养可以适当改善气体的交换。
愈伤组织诱导
悬浮系的建立与继代培养
悬浮细胞的生长动态 悬浮细胞同步化
一. 愈伤组织诱导
愈伤组织的要求：松散性好、增殖快、再生能力强。其 外观一般是色泽呈鲜艳的乳白或淡黄色，呈细小颗粒状， 疏松易碎。
单细胞的分离：通过过滤出去大的细胞团，小细胞团一般采用酶分离法，小细胞团不能 超过6个细胞，因此过滤时网筛的网眼要选择合适。
单细胞悬浮液的制备：分离的单细胞经培养基洗涤2次以后，调整密度为

植物细胞培养-文档资料

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四、悬浮细胞的同步化
细胞同步化是指同一悬浮培养体系的所有细 胞都同时通过细胞周期的某一特定时期。 同一培养体系中，细胞不同步使悬浮细胞的 分裂、代谢以及生理、生化状态等更趋复杂化， 所以人们一直希望通过一定的技术途径，使同一 培养体系中的细胞能保持相对一致的细胞学和生 理学状态，工作中常用的处理方法： 1、物理方法 1）分选法：通过细胞体积大小分级，直接将处 于相同周期的细胞进行分选，然后将同一状态的 细胞继代培养于同一培养体系中。
2）抑制剂法 通过一些DNA 合成抑制剂处理细胞，使细 胞停留在DNA 合成前期，当解除抑制后，即可 获得处于同一细胞周期的细胞。 常用的抑制剂有5-氟脱氧尿苷，5-氨基尿 嘧啶、羟基尿等。 3）有丝分裂阻抑 用秋水仙素处理指数生长的悬浮培养物，浓度 一般控制在0.2%，处理时间以4-6小时为宜。
3、悬浮培养细胞数目的增殖变化
细胞生长各个时期的特点：
滞后期（延迟期）:细胞很少分裂，其长短与接种 量大小和继代时原种细胞所处的生长期有关 对数生长期:细胞分裂活跃，细胞数目增加，增长 速率保持不变直线生长期:细胞生长和发育最明显 的时期 缓慢期:生长逐渐缓慢,培养液消耗将尽，有毒代 谢物质增多，氧气减少。 静止期:生长几乎处于停止状态，细胞数目增加极 少,甚至开始死亡。
机械搅拌式培养系统
气压搅拌式培养系统 考虑到机械搅拌式反应器的剪切作 用难以避免，同时搅拌器转动的中轴往 往是容易使培养物污染的部位，因此， 发展出空气提升式生物反应器，但其缺 点是搅拌不均匀
旋转式培养系统： 一般用于产品中 试或某些必需裂 解细胞才能获得 目的产物的培养， 其优点是控制精 确，处理灵活， 缺点是培养体积 较小。
第二部分 细胞培养 定义 ：植物细胞培养（plant cell

条件培养基培养法

条件培养基培养法
第 八 章 植物细胞及原生质体培养
第一 节
植物细胞培养
植物细胞培养（plant cell culture）：
指对植物器官或愈伤组织上分离出来的 单细胞(或小细胞团)进行培养，形成单细无 性系或再生植物的技术。
植物细胞培养的意义：
（1）研究细胞生理代谢过程及各种影响因子；
（2）用于植物品种的改良；
C . 半连续培养：
是利用培养罐等装置进行细胞大量培养的 一种方式。在半连续培养时，当培养容器内细 胞增殖到一定数量后，倒出一半细胞悬浮液于 另一培养罐等容器，再分别加入新鲜培养基继 续培养。半连续培养能够重复获得大量均一的 培养细胞供进一步利用。
（三）优良悬浮培养体系要求：
A. 悬浮培养物分散性好，细胞团较小，一般由几 十个以下的细胞组成。
培养基中加入高密度的细胞进行培养。一
定时间后这些细胞就会向培养基中分泌一 些物质，使培养基条件化。这样的培养被 利用来进行某些单细胞的培养的方法。
二、细胞的悬浮培养(cell suspension culture)
是指将游离的植物细胞按一定的细胞密度，
悬浮在液体培养基中进行培养的方法。
适宜于大规模培养，细胞工程产业的技术


植物原生质培养和细胞融合可用产生远 缘杂种； 是目前植物细胞及基因工程的核心技术。
一、植物原生质体培养
通过一定方法除去细胞壁，而得到一个裸露 的植物细胞，即为原生质体(Protoplast)。游离 的原生质体像正常的植物细胞那样具有全能性， 在一定条件下培养可以重新再生出完整植株。
自1970年首次获得烟草原生质体再生植株 成功以来，通过原生质体获得再生植株的植 物约有280余种，其中有20种为我国首先报道。

第八章——植物细胞培养

第八章——植物细胞培养

4、PH和二氧化碳浓度
在悬浮培养时，PH变动相当大。加入EDTA使铁和其他金属离 子长期处于可利用状态。硝态氮和铵态氮之间进行调整可作 为稳定PH的一种方法。
二氧化碳对细胞培养没有太大影响，但在低密度细胞培养中， 二氧化碳对于诱导细胞分裂可能有重要作用。
植物细胞生长和活力的测定
一、悬浮培养中细胞生长的测定 1、细胞计数：把1份培养液加入到2份8%三氯化铬溶液中，在 70℃下加热2-15分钟，然后将混合物冷却，用力震荡10分钟，用 血球计数板进行细胞计数。 2、细胞总体积：将已知体积的均匀分散的悬浮液放入1个15ml刻 度离心管中，在2000g下离心5min，得到细胞沉积的体积。 细胞密实体积（PCV）：以每ml培养液中细胞总体积的ml数表示。
第八章-植物细胞培养
植物细胞培养简介
• 概念： 在培养基中培养彼此分离的细胞、使之生长、 增殖或分化。 包括固体培养和液体培养2种形式。
固体培养(solid culture)
• 在固体培养基中培养细胞=静止培养。细胞被固定、 不能移动；单细胞分裂后形成细胞团。
优缺点: 1）所得到的各个细胞团均为单细胞形成，遗传成分和 生理特性具有一致性； 2）细胞生长速度较慢； 3）不能长期、连续、大规模培养细胞。
烟草细胞接种密度和植板率
影响植板率的因素
(4) 培养基成分：用营养成分丰富的培养基或条 件化培养基，植板率高。 (5) 培养方式：采用看护培养（nurse culture） 是可以提高植板率。 平板培养是分离、筛选单细胞无性系的有效方法
看护培养（nurse culture）
植物细胞大规模培养生产次生代谢物质
如某个或某种类型的植物细胞是怎样生长、分裂和分化 的？化学物质（激素等）或者物理因素（重力、压力）等是 怎样影响这些过程的？

第8章 植物细胞悬浮培养与次生代谢物质生产

内循环气升式
气动式反应器
外循环气升式
机械搅拌式
内循环气升式
外循环气升式
例：分批培养
I 建立愈伤组织：获得均一、松 散的愈伤组织
II 建立悬浮系：培养方法 增殖规律
III 悬浮系增殖：细胞批量增殖 获得次生产物
细胞生长曲线
培 养 细 胞 数 目
5 4 3
1
2
培养时间
1 2 3 4 5
滞后期 对数生长期 直线生长期 缓慢期 静止期
3 高产细胞系的筛选
3.1 整体思路 外植体
愈伤组织外植体的筛选
悬浮培养细胞
高产细胞系筛选
3.2 高产系的稳定性及保存方法 尽量减少继代次数，用矿物油包埋法，低温保 存法（-20℃），超低温保存法（-196 ℃）保 存。
同时从高产系中不断克隆形成新的高产细胞 系。
4 植物细胞悬浮培养的方法
悬浮培养：将游离的细胞或者细胞团按一定密度，悬浮在液 体培养基中，不断搅拌或者振荡培养，使细胞快速、大量 增殖。 技术难点： 通气、剪切力的适应性；细胞同步化控制。 ①培养：培养基：基本培养基+CTK/AUX 培养条件：温度、氧气、PH、转速 ②同步化控制 ③细胞增殖的监测，适时测定细胞的数量，掌握放罐时机。
红苋菜
含有甜菜红素的愈伤
甜菜素基本合成途径
目的基因
--- Strack et al. 2003, Plant Cell Physiol, 46: 666-670.
药效问题
– 紫杉醇水溶性很差 0.77mM/L – 使用增溶剂： 聚氧乙烯蓖麻油和无水乙醇

存在问题 稳定性和水溶性较差（7mm/L） 过敏反应 产生沉淀

次生代谢产物的应用：色素、香料、药物、添加剂、 工业原料等。

植物细胞培养与次级代谢产物制备

② 将饲养细胞与需要培养细胞共混合于培养基中 培养 ③将饲养细胞放于下层，培养细胞置于上层培养 ④二者细胞共培养于液体培养基中
（3）液体浅层静置培养
将一定密度的悬浮细胞接种在三角瓶中封口静 置培养。
细胞工程 Chapter 5
（4）细胞同步化培养
①体积选择法：用大、小孔径筛网过滤、收集单 细胞。 ②冷处理法：4℃低温下处理几天使细胞同步化 后，再添加新的培养液培养。 ③饥饿法：控制营养液浓度，通过饥饿使细胞达 到同步化，再添加营养液培养。 ④抑制法：使用抑制剂如尿苷、5-氟脱氧尿苷、 秋水仙素等使细胞达到同步化。
细胞工程 Chapter 5
§5.2 植物细胞培养技术
1、植物细胞培养基
无机盐（大量、微量） 碳源（蔗糖） 有机氮源（水解酪蛋白） 有机酸、维生素 植物生长激素等
细胞工程 Chapter 5 Copyright © 2011 Wang Weidong, All rights reserved.
（3）人工诱变筛选细胞株
在前面筛选的基础上，用诱变剂筛选，系统包括：
①悬浮培养系统： 诱变剂处理后，根据悬浮培养系统中细胞生长较 快、细胞群体比较均匀的特点进行筛选。 ②愈伤组织系统：
对愈伤组织诱变处理后，再通过选择压进行筛选。
③原生质体系统： 裸露的原生体容易进行诱变和筛选。
3.2 细胞株保存
细胞工程 Chapter 5
由愈伤组织分离单细胞步骤
3）将愈伤组织在液体培养基中培养，建立悬浮培养物
优点：细胞团成小细胞团或单细胞；在培养基中均匀分布；有空气交流。
悬浮振荡培养
4）振动或酶解处理，获得单细胞。
细胞工程 Chapter 5 Copyright © 2011 Wang Weidong, All rights reserved.

植物细胞培养生产次级代谢产物的影响因素与对策

植物细胞培养生产次级代谢产物的影响因素与对策植物细胞培养技术是将植物体的某一部分经过无菌处理，置于人工培养基上使其细胞增殖，进而按需要进行培养的技术。

利用植物细胞培养技术生产有用代谢产物，已成为继微生物技术以后当代生物技术重要的发展领域。

据不完全统计，我国已对400多种植物建立了组织和细胞培养体系，并从中分离出600多种代谢产物。

1外植体的影响同一植株不同部位的组织进行培养时，其产物或产物积累量不同。

银杏叶来源的愈伤组织黄酮含量为1.5%，茎段来源的愈伤组织为1.0%，而子叶来源的愈伤组织仅为0.3%。

Mischenko等[3]在茜草愈伤组织培养过程中发现，来源于叶柄和茎的愈伤组织蒽醌累积量比来源于茎尖和叶的愈伤组织高。

徐咏梅等对杜仲乔林与叶林2种栽培模式下树皮中次生代谢物的含量差异研究发现，乔林树皮中杜仲醇、总黄酮和杜仲胶的含量均比叶林树皮中的高，而叶林树皮中绿原酸、京尼平甙酸和桃叶珊瑚甙比乔林树皮中的高。

因此，利用植物细胞培养生产次生代谢物时，选择能诱导出疏松易碎、生长快速且具有较高次生代谢物合成能力的愈伤组织的外植体非常重要。

2培养基的影响2.1培养基种类在细胞培养中，愈伤组织生长和次生代谢物产生的最佳培养基一般是不一致的。

钟青平等研究不同培养条件下的栀子愈伤组织生长和栀子黄色素的产生时发现，B5、MG-5基本培养基有利于愈伤组织生长；M-9基本培养基有利于黄色素合成。

甘烦远等认为MC培养基对红花愈伤组织生长和生育酚的形成最有效。

因此在组织培养时可以采用二步培养法，根据生长及代谢的需要，调整基本培养基。

2.2培养基组分2.2.1碳源不同的培养细胞适合生长和次生代谢物积累的碳源种类不同。

郑穗平等，在研究玫瑰茄细胞生长和花青素生成时发现，蔗糖作为碳源，细胞的生长量高，葡萄糖作为碳源，细胞花青素的含量高。

赵德修等研究发现，5%蔗糖+1%葡萄糖组合对雪莲愈伤组织生长不仅有利，而且细胞中总黄酮的含量也最高。

第八章 植物细胞培养及次生物质生产


植板率＝
每个平板接种的细胞总数
细胞平板培养 (plating culture)
• 优点：
– 单细胞在培养基中分布均匀，便于在显 微镜下对细胞进行定点观察，是单细胞 株筛选和突变体筛选的常用方法。
– 由于它具有筛选效率高、筛选量大、操 作简便等优点，被广泛应用于细胞分裂、 分化、生理生化、遗传变异、次生代谢 产物合成等。 • 缺点：通气状况不好，排泄物质易积累造 成毒害或影响组织吸收。
• 要求：松散性好、增殖快、再生能力强。其外观 一般是色泽呈鲜艳的乳白或淡黄色，呈细小颗粒 状，疏松易碎
悬浮系的建立与培养
callus
1g/10ml medium
150~250ml flask
100~120 rmp culture transfer 1 time/3d
centrifuge isolation
– 应用条件培养基（生长过愈伤组织或悬 浮细胞的液体培养基）提供单细胞生长 和分裂所需的特殊代谢物。 – 基本培养基成分的调节视不同的培养目 的而定 培养基设计时，一般均以诱导愈 伤组织形成的培养基为基础进行调整。 常用的培养基有MS、B5、LS 、N6等。 – 植物激素和其他附加成分的应用。
影响悬浮细胞生长的因素
悬浮培养细胞的同步化
• 细胞同步化：同一悬浮培养体系的所有细 胞都同时通过细胞周期的某一特定时期。 • 植物细胞在悬浮培养中容易团聚并进入不 同程度的分化状态，因此，要达到完全同 步化是十分困难的。 • 同一培养体系的植物细胞经常不能处于同 一细胞周期，这种差异使悬浮细胞分裂、 代谢以及生理生化状态等复杂化。 • 通过一定的理化措施可以使同一体系中的 细胞达到相对同步化。 什么措施？
Isolation protoplasts
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缺点：过高的剪切力，易对植物细胞 造成伤害。
气升式生物反应器
5L 气升式植物细胞（或器官）培养罐
内环式
外环式
气 升 循 环 式 生 物 反 应 器
鼓泡式生物反应器
气动式生物反应器
利用空气为动力，带动培养容器中的 液体流动。适宜于植物细胞培养的一类生 物反应器
• 优点：剪切力小，对细胞损伤小，易长期 无菌培养。 • 缺点：操作弹性小，低气速或培养后期混 合效果差；此时如果提高通气量又会产生 大量泡沫。
第八章
植物的细胞培养 及次生代谢产物生产
培养过程：
培养物 愈伤组织诱导培养基 再分化培养基
外植体 植物细胞培养（ Plant Cell Culture）:
在离体条件下，对植物单个细胞或小的 愈伤组织
不定芽 细胞群体的技术。 根形成
细胞团进行培养和继代培养，大量获得
生根培养基
植物细胞培养的类型
• 单细胞培养(单个细胞)
• 细胞悬浮培养(小的细胞团) • 大规模细胞培养(大量培养细胞)
第一节 植物的单细胞培养
一、植物细胞分离方法
• 机械分离法：从完整植物器官和组织中分 离单细胞的方法。常用的是叶片（叶肉组 织排列疏松）。将叶片轻轻研碎、过滤、 离心、收集、净化
• 优点：细胞不受酶伤害；有利于进行细胞 的生理和生化研究。
细胞固定化方法
• 常用的包埋固定方法：
• （1）海藻酸盐固定化
• • 滴入CaCl2使海藻酸盐形成颗粒 滴入NaCl使卡拉胶形成颗粒
• （2）卡拉胶固定化 • （3）琼脂糖固定化
• （4）琼脂固定化
常见的几种植物固定化生物反应器系统
（ b）
• ① 流化床生物反应器：
空气出口
• 细胞包裹在胶粒、金属或泡 沫颗粒中。 • 优点：细胞包埋颗粒小，传 质效率高。 • 缺点：剪切力或碰撞破坏细 胞。
实例分析：P87
二、悬浮培养工艺
• 1、分批培养：培养体系（培养基、培养物
）处于封闭状态，既
不向培养系统中补充
培养基也不从系统中排出培养物，（一次 性加入培养基，一次性收获培养物）。
悬 浮 细 胞 的 生 长 动 态
指
2、连续培养
在培养过程中，不断排出悬浮培养 物并注入等量新鲜培养基，使培养物不 断得到养分补充，保持其恒定体积的培 养。 •
(一)愈伤组织的诱导
外观一般是鲜艳的乳白或淡黄色，呈细 小颗粒状，松散易碎。
适于悬浮培养
适于再生植株
(二)悬浮系的建立与继代培养
愈伤组织
1-2g愈伤/10-20ml培养基
100、250ml三角瓶（30、70ml培养基）
120rpm,25℃黑暗培养, 初始培养换液1次/3d以防粘稠
蔗糖梯度离心或过滤法(淘汰过大或生理状态不好的细胞团)
悬浮培养系统的优点
• 1）可以保证良好的混合状态，增加细胞与 培养液的接触面，促进营养的吸收，获得 良好的气体传递效果。
• 2）细胞生长快，能大量提供比较均匀的细 胞。 • 3）可以借鉴发酵工程的成熟技术，容易放 大实现规模化。
②固定化反应器
• 细胞固定化：指将游离的细胞包埋在
多糖或多聚化合物制备成的网状支持
100-110rpm（悬浮细胞系稳定以后）
继代培养
继代时间为1周时（ 原悬浮液：新培养基=1：4 ）
悬浮细胞的起始密度 一般在104×105个细胞/毫 升
成功的悬浮细胞培养体系满足三个条件：
悬浮培养物分散性良好，细胞团较小，一般在20～ 50个细胞以下，在实际培养中很少有完全由单细胞 组成的植物细胞悬浮系。 均一性好，细胞形状和细胞团大小大致相同。悬浮 系外观为大小均一的小颗粒，培养基清澈透亮，细胞 色泽呈鲜艳的乳白或淡黄色。 细胞生长迅速，悬浮细胞的生长 量一般2～3天甚至更短时间便可增加 一倍。
二、植物细胞培养生产代谢产物的 意义
• 提取：在不同红豆杉属植物树种和树木的不同部 位(如树皮、木材、树叶、嫩枝和幼苗等)含量有 所不同，以树皮、嫩芽中含量最高，心材最低。 一般含量为0.005% 左右。生产1kg紫杉醇需要砍 伐60年生大树3000-4000棵。若光从树皮中提取紫 杉醇，每年需砍伐150-200万棵左右的大树。破坏 宝贵资源、不可持续发展。
作用：消除关键酶的阻碍、阻断内源性中
间体的分隔和有效贮存，大大提高次
生代谢物的产量。 烟草：天仙子胺
尼古丁产量降低 新烟碱含量大大提高
生物反应器的选择
• 适合植物细胞悬浮培养的生物反应器的特 点：
合适的氧传递； 良好的流动性； 较低的剪切力。
生物反应器的类型及特点
• 1、悬浮培养系统生物反应器
4、双层滤纸培养（饲养层培养）
把处理（如X射线处理）过的无分裂能力或分裂 很慢的细胞来饲养所需培养的细胞，使其分裂和生 长。
第二节 悬浮培养
细胞悬浮培养（Cell
suspension culture)：将 单个游离细胞或小细胞 团悬浮于液体培养基中 ，在保持良好细胞分散 状态下进行培养（悬浮 振荡培养）的技术。
• 优点：细胞不受伤害，可获得较多的游离 细胞或小的细胞团。
二、 单细胞培养技术（single cell culture）
1、平板培养(plating culture) 2、看护培养(nurse culture)
3、微室培养(micro-chamber culture) 4、双层滤纸培养(feeder layer cultur)
2、细胞株的筛选与增殖培养
• 单细胞培养
• 多次继代筛选
3、筛选细胞株的增殖培养
悬浮培养（摇瓶培养），逐级放大，获得
大量的活跃生长的种子细胞群体；
细胞株鉴定：经常鉴定，防止细胞株退化和
变异。
培养基的选择
两步培养技术 P91
• 培养基 既要满足植物 1977年Zenk提出： 细胞的生物量 (1)维持培养基(maintenance media) 增长，还要满 足细胞合成及 ——尽可能快的使细胞量增长 积累次生产物 的需要。
• 次级代谢产物(Secondary metabolites)：是通 过次级代谢合成的产物，大多是分子结构 比较复杂的小分子化合物，例如抗生素、 激素、色素、生物碱、毒素等。
பைடு நூலகம்
二、植物细胞培养生产代谢产物的 意义
例：紫杉醇（Taxol）是从红豆杉属植 中分离得到的一种双 萜类化合物。C47H51NO14， 分子量：853.90 用途： • 具有良好的抗癌活性，尤其对晚期 、转移性卵巢癌、乳 腺癌、肺癌有 、转移性卵巢癌、乳腺癌、肺癌有 十分显 著的疗效。 制备途径： • 1.直接从红豆杉中提取； • 2 化学全合成 化学半合成 ； • 3.内生真菌培养； • 4.植物细胞培养。
• 类型：
（1）半连续培养 指每隔一定时间后倒出一定量的悬浮液，并 同时补充加入等量新鲜培养液。能重复地取得大 量、均一的培养细胞，供生物研究之用。 （2）连续培养 封闭式连续培养：系统中的细胞数目不断增加。 开放式连续培养：系统中的细胞密度保持恒定。
a.恒化培养 b.恒浊培养
• 连续培养的特点
(2)生产培养基(production media) ——诱发和保持次生代谢旺盛，积累相应代谢产物
加入诱导剂或前体物
(1)诱导剂： 可引起代谢途径改变或代谢强度改变的物质。 无机离子、真菌提取液、葡聚糖等。 作用机理: 可以调节代谢进程某些酶的活性,并对某些关键酶 在转录水平上进行调节。
(2)前体物
（一）细胞株的诱导与筛选
• （1）分散性好，适合大规模悬浮培养；
• （2）均一性好，细胞大小、生理状态一致； 适合大规模培养的细
胞株应具备何条件？ • （ 3）生长速度快，培养周期短，不易染菌；
• （4）目标产物含量高，容易分离提取； • （5）细胞遗传稳定。
1、细胞株的诱导
愈伤组织的诱导与培养 单细胞的分离 细胞无性系的分离
• 2、固定化培养系系统生物反应器
植物悬浮培养的生物反应器
• 特点：具有合适的氧传递、良好的 流动性和低的剪切力。
①悬浮培养生物反应器类型
机械搅拌式
气动式（气升式，鼓泡式）
机械搅拌式生物反应器
• 机械搅拌式生物反应器通常是在微生 物发酵罐的基础上改进设计。 优点： 1）培养环境保持基本稳定（氧气，二 氧化碳，温度，pH等） 2）搅拌充分，细胞供氧和混合效果好
1、细胞平板培养
• 将一定密度的悬浮细胞接种到一薄层固体培养 基中进行培养的技术。Bergman(1960)首创
– 单细胞的分离：一般采用酶分离法，小细胞团不 能超过6个细胞。 – 单细胞悬浮液的制备：分离的单细胞经培养基洗 涤2次以后，调整密度为5×105个/毫升
– 植板：将1份已调整好密度的单细胞悬浮液与4份
35℃的固体培养基充分混合均匀，然后均匀地平 铺于培养皿中，其厚度为1-2mm左右。
克隆愈 伤组织
细胞悬浮
过滤
与培养基 混合
植板
培养
• 平板培养的效果一般用植板率来衡量。植板 率是能长出细胞团的单细胞在接种单细胞总 和中所占的比例。
每个平板形成的细胞团数
植板率＝
每个平板接种的细胞总数
×100%
• 优点：
植物细胞分离方法
• 酶解法:选择专一性水解酶在温和的条件下 将植物细胞壁物质(纤维素、果胶、多糖)降 解,从而使细胞彼此分开,获得单个细胞的方 法。
• 优点：可获得较多的游离细胞（但对禾本 科植物叶片效果不好）。
植物细胞分离方法
• 愈伤悬浮法：从未分化的疏松易碎的愈伤 组织，通过摇床振荡获得分散的单细胞或 小细胞团。
• 化学合成 ：结构复杂，全合成需要几十步合成步 骤 ，总得率仅4-5%。成本高