DNA与稠杂环芳烃农药相互作用的电化学发光测定法

DNA电致化学发光分析方法研究电致化学发光(ECL)是在化学发光基础上发展起来的一种新的分析方法,它是化学发光与电化学相结合的产物,兼具化学发光和电化学分析的优点,同时又延伸出一些独特的优势,例如灵敏度高、抗干扰能力强、重现性好、可进行原位现场分析、动态范围宽等。

自2002年有关Si纳米粒子的ECL研究被报道以来,半导体纳米晶(SNCs)作为新型的ECL材料近年来备受关注。

与传统的分子发射物相比,半导体纳米晶有着独特的优点,例如尺寸/表面缺陷控制的发光、无光漂白、稳定性好。

因此,基于半导体纳米晶的ECL已经被广泛地应用于生物传感和生物分析中。

本论文研究了多种SNCs的ECL性能,并以这些物质为ECL发光体,结合DNA杂交技术、界面能量转移技术和酶的循环放大技术,实现了 DNA的序列识别及含量测定,为新型DNA传感器的开发提供了新的思路和方法。

1.基于金纳米粒子和等温循环双重放大的超灵敏ECL法检测DNA将具有等温放大效应的“DNA机器”与Au 纳米粒子对CdS半导体纳米晶膜ECL距离可控的猝灭与增强现象相结合,发展了一种新型超灵敏的ECL DNA传感界面。

ECL体系中的这种界面能量转移给生物识别元件的转换提供了一种新的方法,且等温DNA放大反应可以在室温条件下进行,因此避免了热循环的一些要求。

此研究结果不仅为超低浓度DNA检测提供了一种新的方法,还给DNA生物传感器对其他分析物的检测带来广阔的应用前景。

2.基于等温循环放大和双纳米粒子标记的三茎式探针的超灵敏单核苷酸多态性ECL检测方法基于等温循环协助的标记有Au和CdTe两种纳米粒子(NPs)的三茎式探针,我们研发了一种新型的电致化学发光(ECL)检测单核昔酸多态性的方法。

本体系是由电极表面的CdS纳米晶(NCs)膜作为电致化学发光体,然后,将标记Au NPs的二倍茎结构探针DNA连接到纳米晶膜上,最后再与标记CdTe NPs的DNA链杂交形成三茎式结构的探针DNA。

新型DNA电致化学发光探针及其在DNA分析中的应用研究【摘要】：脱氧核糖核酸(DNA)被称为生命体内的遗传物质，研究发现人类的许多遗传疾病都与DNA分子中碱基序列的变异有关。

检测与疾病有关的变异对基因筛选、遗传疾病的早期诊断和治疗具有十分深远的意义。

DNA杂交分析技术是目前生物化学和分子生物学研究中应用最广泛的技术之一，是定性或定量检测特异DNA序列片段的有力工具。

目前，它已广泛应用在生命科学，尤其是医学的各个领域。

传统的DNA分子杂交采用的是放射性标记的检测方法，这种方法虽然灵敏度高，但存在放射性物质对人体及环境的危害。

自20世纪80年代以来，各种非同位素如酶、荧光素、生物素、地高辛标记的化学发光法和荧光分析法以及以电活性物质做标记的电化学方法相继问世，这些方法虽然在一定程度上克服了同位素标记的缺陷，但由于存在灵敏度不够高或检测系统庞杂或仪器价格昂贵或标记物不稳定等缺陷，还不能完全取代传统方法。

因此寻求简单、灵敏、可靠、价廉的非放射性标记的DNA检测方法具有十分重要的现实意义。

电致化学发光(ECL)分析是一种通过电极反应而产生化学发光的微量分析方法。

它将电化学技术与化学发光检测结合起来，弥补了电化学方法和化学发光方法的不足，具有灵敏度高、选择性好、动力学范围宽、检测快速方便、仪器价格便宜等优点，近几年来在分析化学，尤其在生物分析领域引起了人们的极大关注。

本论文通过研究了多种ECL活性物质的发光性能，并以这些物质为标记物制备了多种高灵敏度的DNA-ECL探针，结合DNA杂交技术和DNA固定化技术，将高灵敏度的ECL检测手段应用于生命物质DNA的序列识别及含量测定，为DNA传感器的研究和基因芯片的开发提供了新的思路和方法。

摘要论文主要研究内容如下:第一章绪论简单介绍了ECL分析方法的概念、原理和特点，重点介绍了各种ECL反应类型及其在分析化学中的应用，系统总结了各种ECL传感器，展望了ECL分析的未来发展方向。

电化学发光免疫分析方法检测蔬菜中噻虫啉的含量单云;张红琳;彭智敏【摘要】The problem of the pesticide residue results from a wide use of chemical pesticides. It is of great impor-tance to deal with the problem of pesticide residues in vegetables. In this paper, an electrochemiluminescence im-munoassay method was established to detect the thiacloprid content of pesticide residues. This method used CdS nanocrystals ( NCs) and graphene as ECL emitters and antigen Label respectively. When thiacloprid ( the antigen) labeled with graphene was bound to antibody on the CdS NCs film through the formation of immunocomplex, ECL e-mission from CdS NCs film was greatly enhanced. The ECL increment (ΔI) increased with the concentration of thi-acloprid . The logarithm of the concentration of thiacloprid is linearly related to the logarithm of ECL increment with-in the range of 0. 1~10 pg. mL-1(R = 0.99). At a S/N ratio of 3, the detection limit was 0. 1 pg. mL-1. Satis-factory results were obtained when this method was applied to the detection of pesticide residues in real samples. Graphene, easily being modified, has a very broad prospect as a label to be used in other immunoassay as well as in DNA hybridization analysis.%化学农药的广泛使用，不可避免的产生了农药残留问题.蔬菜作为人类食物之一，其农药残留问题尤其重要.本文采用饱和硫酸铵盐析法提纯噻虫啉，并合成了CdS纳米晶，制备了具有稳定且强电致化学发光的CdS纳米晶膜，在纳米晶膜上建立了农药残留物噻虫啉含量的电化学发光免疫检测方法.该方法利用具有优良导电性的石墨烯作为抗原标记物，实现了噻虫啉的灵敏检测.标记上石墨烯的噻虫啉与纳米晶膜表面的抗体免疫结合后引起纳米晶膜发光的增强，发光强度的增加随着噻虫啉的含量的增加而增大.发光强度的对数与噻虫啉浓度的对数在0.1~10 pg·mL-1范围内呈线性关系(R=0.99).在S/N比为3时，检测限为0.1 pg·mL-1.利用该方法检测实际蔬菜样品中的农药残留量，取得了令人满意的结果.鉴于石墨烯良好的可修饰性，其作为标记物在其他免疫反应、DNA杂化分析中具有十分广阔的前景.【期刊名称】《南京晓庄学院学报》【年(卷),期】2014(000)006【总页数】5页(P1-5)【关键词】噻虫啉;电致化学发光;石墨烯;农药残留;检测【作者】单云;张红琳;彭智敏【作者单位】南京晓庄学院生物化工与环境工程学院，江苏南京211171;南京晓庄学院生物化工与环境工程学院，江苏南京211171;南京晓庄学院生物化工与环境工程学院，江苏南京211171【正文语种】中文【中图分类】S481.8噻虫啉是一种新型氯代烟碱类杀虫剂，我们所熟悉的这类杀虫剂除了噻虫啉还包括呋虫胺、噻虫嗪、噻虫胺、吡虫啉、啶虫咪，这类农药最开始是用烟碱为原料生产的，但是现在是用相关的化学原料所合成的[1].其是防治刺吸式和咀嚼式口器害虫的高效药剂之一[2].通过之前的田间试验表明，噻虫啉对梨果类水果、棉花、蔬菜和马铃薯上的重要害虫有优异的防效.除对蚜虫和粉虱有效外，它对各种甲虫(如马铃薯甲虫、苹花象甲、稻象甲)和鳞翅目害虫如苹果树上的潜叶蛾和苹果蠹蛾也有效，并且对相应的所有作物都适用[3].虽然噻虫啉杀虫剂有很多优点，但是现代社会的农药残留问题依旧严重[4].电致化学发光(ECL)是一种物质在电极表面反应后经历高能电子传递而形成激发态进而发射光子的发光过程[5].虽然早在二十世纪二十年代Harvey课题组就报道了电解过程中的发光现象，但是直到六十年代中期，Hercules和Bard等人首次详细地对ECL过程进行了研究[5].经历了40多年的发展，如今ECL已经成为一种有力的分析手段而广泛应用于免疫分析、食品与水质检验、生化武器探测等各个领域.此外，ECL作为一种灵敏的检测方法还被成功地开发成流动注射分析(FIA)、高效液相色谱(HPLC)、毛细管电泳和全微分析(μTAS)等分析体系中的检测器.目前研究的电致化学发光活性物质主要有三类，包括以三联吡啶合钌类金属配合物为主的无机类物质、鲁米诺为代表的有机类和新兴的半导体纳米晶材料[5].由于纳米晶具有独特的量子尺寸决定的电化学性质和ECL可控的优点，纳米晶ECL已经越来越引起科研工作者的兴趣.各种纳米晶如CdTe[6]，CdSe[7]，PbS[8]的ECL在生物化学和分析领域已得到广泛研究，已广泛应用于儿茶酚衍生物[9]、DNA检测[10]，免疫分析[11].石墨烯是元素碳除了碳纳米管，富勒烯和金刚石之外又一新的同素异形体，是由碳原子排列成的平面二维蜂窝状晶格[12].确切地说，石墨烯是由碳原子以六角结构组成的二维单层片状材料.碳原子以sp2杂化成键，其中平面内的碳碳α键较强，而平面外的π键电子是离域的，这使得石墨烯能很好地传导电子，并且层与层之间存在弱的相互作用[13].由于石墨烯具有性能优异、成本低廉、可加工性好等众多优点，人们普遍预测石墨烯在电子、信息、能源、材料和生物传感等领域具有重大的应用前景，可望在21世纪掀起一场新的技术革命[13].本研究将免疫反应和化学反应相结合，以电极为载体，在其上组装抗体、待测抗原和标记物，通过抗原抗体结合，抗原抗体结合物与标记物结合等的电极发光强度的变化，计算出被测物的含量.利用石墨烯作为电致化学发光免疫检测噻虫啉的标记物，建立一种检测市场上蔬菜的噻虫啉残留量的方法，为食品安全的快速检测奠定基础.1.1 仪器ECL-时间曲线由MPI-A型多功能电化学和电致化学发光分析系统记录(中国西安瑞迈电子仪器有限公司);直径为3 mm的玻碳电极(GCE)、Pt丝和饱和甘汞电极(SCE)分别作为工作、对和参比电极.工作窗口置于光电倍增管前，测量时光电倍增管设置在500 V;CdS纳米晶形貌由日本JEOL 2000型透射电子显微镜(TEM)表征，加速电压为200 KV;材料的UV-vis吸收光谱由Shimadzu UV-3600型紫外—可见—近红外光谱仪上记录(Shimadzu Co.).纳米晶的结构由X-射线衍射仪(XRD，Bruker AXS)表征.1.2 材料待纯化的兔抗人血清白蛋白免疫血清2.1 噻虫啉多克隆抗体的纯化参照文献[14]介绍的方法用饱和硫酸铵法纯化噻虫啉多克隆抗体.用紫外分光光度计读取OD280和OD260的OD值，计算蛋白质含量：蛋白质含量(mg/ml)=(1.45×OD280-0.74×OD260)(mg/ml)2.2 CdS纳米晶的合成取一定量的Cd(NO3)2·4H2O溶解于30 ml的超纯水中，置于恒温油浴中边搅拌边加热到70 ℃，最后加入新鲜配制的30 ml的Na2S溶液，立刻就能观察到橙红色的产物出现.Cd(NO3)2·4H2O 浓度控制在0.02 M.反应在70 ℃下回流 3 h.反应混合物经离心分离后，纳米晶沉淀用无水乙醇洗涤1次，超纯水洗涤3次.制备的纳米晶超声分散于超纯水中，形成浓度为1 mg·mL-1的胶体溶液，4 ℃储存，用于进一步表征与制备纳米晶膜.2.3 CdS纳米晶膜的制备在玻碳电极表面滴涂前，首先在800#、1 500#和4 000#砂纸上依次打磨该电极.打磨成镜面的玻碳电极用水和乙醇超声清洗后用氮气吹扫干净.10 μL 浓度为1 mg·mL-1 的CdS纳米晶胶体溶液滴涂到干净的玻碳电极表面，室温下空气中干燥，最后得到均匀致密的纳米晶膜.CdS纳米晶膜置于0.1 M NaCl+0.1 M Tris-HCl(pH7.4)缓冲液中保存，用于进一步修饰.2.4 CdS纳米晶膜的修饰CdS纳米晶膜浸入到 1.0 mL含有3 mM MPA 的0.1 M NaCl+0.1 M tris-HCl (pH7.4)缓冲液中，4 ℃下组装羧基功能团6 h.组装上MPA的CdS：纳米晶膜用水和Tris-HCl缓冲液充分润洗后，用EDC/NHS活化膜上的羧基功能团.纳米晶膜经充分润洗后置于40 μL浓度为50 μg·mL-1 的抗体溶液中，4 ℃组装抗体16 h. 最后，组装上抗体的纳米晶膜置于40 μL的 2.0% BSA 溶液中，4 ℃ 封闭非特异性活性吸附点 2 h.组装后的膜记为Ab-CdS.2.5 石墨烯的制备以石墨为原料，采用文献[15]的方法制备石墨烯.2.6 抗原/石墨烯复合物的制备300 μL浓度为1 mg·mL-1 的石墨烯分散于0.01 MPB (pH7.4)中，与300 μL不同浓度的抗原溶液混合，室温反应2 h.在上述混合液中加入100 μL的 2.0% 的BSA溶液，封闭石墨烯表面的非特异性活性吸附点，反应1 h.制备的复合物记为Ag/石墨烯(注：抗原用Ag代替).2.7 抗原标记ECL检测修饰好的Ag/石墨烯在CdS纳米晶膜上连接，室温下免疫反应1 h，接着用0.01M PB (pH7.4)缓冲液充分润洗，以去除未结合的Ag/石墨烯.抗原的浓度与Ag/石墨烯纳米粒子连接前后的ECL强度变化值相关.电致化学发光免疫传感器的组装过程及检测示意图如图1所示.3.1 CdS纳米晶的表征CdS纳米晶的TEM和XRD如图2、3所示.从图2中可以看出，CdS纳米晶呈圆形颗粒，尺寸约为5 nm左右.由于纳米晶的小尺寸，CdS纳米晶的三个特征衍射峰有展宽现象.与CdS标准卡(JCPDS，No. 10-454)相比，从2θ=20°到60°之间出现的特征衍射峰对应着体相CdS的(111)、(220)和(311)晶面，说明CdS纳米晶是立方闪锌矿结构[16].CdS纳米晶的紫外可见吸收光谱如图4所示.图中纳米晶的带边吸收起自505 nm，吸收峰在470 nm附近.CdS体材的带隙宽度为2.42 eV，吸收边位置在512 nm处[17].与CdS体材相比，吸收边发生小幅蓝移，显示出了量子尺寸效应.3.2 石墨烯的表征从石墨烯的TEM图中可以看出，本方法所制备的石墨烯为多层片状结构，尺寸约为200～300 nm(图5).3.3 ECL检测噻虫啉的含量CdS纳米晶膜在共反应剂离子存在下能产生既强也稳定的ECL发射.图6中给出了免疫传感器组装过程中各步的ECL信号比较与抗原检测时ECL信号的变化.线a是裸 CdS纳米晶膜的ECL-电势曲线.可以看出，CdS纳米晶与共反应剂离子的反应产生了一个峰位置位于约-1.35 V的强ECL发射峰.CdS纳米晶膜的发光强度是厚度相关的.当纳米晶膜的厚度越过最优化值慢慢增加时，膜的ECL发射强度会缓慢下降并伴随着离子的还原峰电流的缓慢降低.为了实现抗原的灵敏检测，此处的CdS纳米晶膜厚度是检测最优化的，以降低检测背景信号同时提高检测灵敏度.当在裸CdS纳米晶膜修饰MPA后再通过EDC/NHS活化连接上捕获抗体时ECL发射强度(用峰高表示)下降了约10% (图6，线a和线b).当进一步用BSA来封闭膜上的活性非特异性吸附点后，CdS 纳米晶膜的ECL发射强度又有小幅降低(图6，线 c). EDC/NHS活化CdS纳米晶膜上的MPA羧基基团只造成纳米晶膜的ECL发射强度非常小的下降，因此在组装ECL免疫传感器过程中观察到的这两步ECL强度下降主要是由于抗体蛋白和BSA对ECL反应过程中电子传递的部分阻碍造成的[18].当传感器连接上未标记有石墨烯的抗原时，ECL有小幅下降.相反，当传感器连上抗原/石墨烯复合物后，ECL强度大幅度增加(图6，线d和线e).这种增加是由于石墨烯良好的电子传递能力引起的[19].纳米晶膜ECL强度的增加值随抗原浓度的增加而变大.ECL强度增加值(ΔI)与抗原浓度在0.1～10 pg·mL-1范围内呈对数线性关系(R=0.99).在S/N为3时，检测限为0.1 pg·mL-1.3.4 蔬菜中噻虫啉含量的测定我们用该免疫传感器检测了四个实际蔬菜样品中的噻虫啉靶标物的含量.这四个样品来自南京某超市，分别称取1 g样品，用20 ml PBS匀浆，一部分稀释100倍，作为抗原组装到之前已经组装抗体的电极上培养，结果如下：从上表可以看出，这四种样品中噻虫啉的含量极少或没有.【相关文献】[1]张敏恒，赵平，严秋旭，等.新烟碱类杀虫剂市场与环境影响[J].农药.2012， 51(12)：1-5.[2]谢心宏，王福久.噻虫啉(Thiacloprid)——一种新的叶面施用杀虫剂[J].农药.2001，40(1)：47-48.[3]胡敏，张强，吴兵兵，等.噻虫啉对蚜虫杀虫活性及田间药效评价[J].现代农药.2006，5(3)：58-59.[4]常国彬，温小遂，熊惠龙，等.噻虫啉林间防治松褐天牛药效试验[J].辽宁林业科技.2011， 1：25-28.[5]Wujian Miao. Electrogenerated Chemiluminescence and Its BiorelatedApplication[J].Chem. Rev. 2008， 108， 2506-2553.[6]Bae Y， Myung N， Bard A J.Electrochemistry and Electrogenerated Chemiluminescence of CdTe Nanoparticles[J]. Nano Lett. 2004， 4， 1153-1161.[7]Ding S N， Xu J J， Chen H Y.Enhanced solid-state electrochemiluminescence of CdS nanocrystals composited with carbon nanotubes in H2O2 Solution[J]. Chem. Commun. 2006， 3631-3633.[8]Sun L， Bao L，Hyun B， et al. Electrogenerated chemiluminescence from PbS quantum dots [J].Nano Lett. 2009， 9, 789-793.[9]Jiang H， Ju， H. Electrochemiluminescence sensors for scavengers of hydroxyl radical based on its annihilation in CdSe quantum dots film/peroxide system[J]. Anal. Chem. 2007，79, 8055-8060.[10]Shan Y， Xu J J， Chen H Y. Distance-dependent quenching and enhancing of electrochemiluminescence from a CdS：Mn nanocrystal film bu Au nanoparticles for highly sensitive detection of DNA[J]. Chem. Commun. 2009， 905-907.[11]Jiang H， Ju H. Enzyme-quantum dots architecture for highly sensitive electrochemiluminescence biosensing of oxidase substrates[J] Chem. Commun. 2007,404-406.[12]李占成. 高质量石墨烯的可控制备[D]. 博士学位论文.中国科学技术大学：2012.[13]Castro Neto AH， Guinea F， Peres NMR， et al. The electronic properties of graphene[J]. Reviews of Modem Physics， 2009，81(1)， 109-162.[14]伯吉斯(Richard R.Burgess)， Murray P.Deutscher蛋白质纯化指南(第2版)[M].北京：科学出版社，2011.[15]Guoxiu Wang， Juan Yang， Jinsoo Park， et al. Facile Synthesis and Characterization of Graphene Nanosheets[J]. J. Phys. Chem. C 2008， 112， 8192-8195.[16]Mishra S K, Srivastava R K, Prakash S G, et al. Structural, optical and photo conductivity characteristics of manganese doped cadmium sulfide nanoparticles synthesized by co-precipitation method. J. of Alloys and Compounds 2012, 513, 118-124. [17]Nag A, Sarma D D. White Light from Mn2+-doped CdS Nanocrystals: A New Approach [J]. J. Phys. Chem. C 2007, 111, 13641-13644.[18]Hu X F, Mao C J, Song J M, et al. Fabrication of GO/PANi/CdSe nanocomposites for sensitive electrochemilumi nescence biosensor [J]. Biosens. Bioelectron. 2013, 41, 372-378.[19]Guo Z Y, Hao T T, Du S P, et al. Multiplex electrochemiluminescence immunoassay of two tumor markers using multicolor quantum dots as labels and graphene as conducting bridge [J]. Biosens. Bioelectron. 2013, 44, 101-107.。