pierce发光底物比较

1 。

称取TMB １７．２mg(固体），加ＤＭＳＯ１ml 溶解，然后加醋酸钠缓冲液（０．１ｍｏｌ／ｌ，ｐＨ５．５）６６ml，此为底物A底物B ,取双蒸水100ml，加３０％H2O2１７微升使用时A：B 液等体积混匀即可．称取TMB 20mg(固体），先用无水乙醇10ml 溶解，充分振荡（试剂瓶要干净，干燥），加双蒸水定容到100 ml，此为底物A底物B ,取1水柠檬酸 2.1g，无水Na2HPO4 2.82g，0.75%的过氧化氢尿素0.64ml，双蒸水定容至100ml(无须调PH值，应在4.5-5.0范围。

使用时A：B 各取5ml 混匀，可用于一块96孔板显色。

过氧化氢脲比H2O2稳定，不必如H2O2现用现配，都起供氢体的作用。

2TMB(10mg/5ml无水l乙醇) 0.5ml底物缓冲液10ml0.75%过氧化氢32ul底物缓冲液:0.2M磷酸氢二钠25.7ml0.1M柠檬酸24.3ml加蒸馏水50mlTMB使用液：TMB （10mg/5ml，无水乙醇）0.5ml底物缓冲液10ml0.75% H2O2 32 Ul3.TMB加入2.5ml无水酒精中,可加热至37℃～40℃直到TMB完全溶解。

将TMB配成1%浓度，4 ℃保存半年以内使用。

使用前，用pH5.0磷酸—柠檬酸底物液9.9ml加入0.1ml（1mgTMB）1%TMB液，再按每毫升TMB加入30% H2O21ul混匀后立即使用。

2NH2SO4终止后，450nm测定OD值。

4.HRP的底物：A液：0.02%H2O2 ；用0.1M柠檬酸-0.2M磷酸氢二钠，PH4.5～5.0稀释。

B液：TMB-HCl：0.4‰；用50mM柠檬酸钠，浓HCl调PH值为2.8的溶液溶解。

A液，B液各50ul使用。

可使用起来显色比较缓慢，OD值较PIERCE的底物稍偏低一点。

5.1、TMB粉末，溶于N，N－二甲基甲酰胺，配成10mg/mL。

2、底物缓冲液：0.2Mol/LNa2HPO4 25.7mL0.1Mol/L柠檬酸24.3mL水50mL3、H2O2用时10mg/mL TMB 165uL底物缓冲液11mLH2O2 3.3uL酶标板中每孔加100Ul。

注意：试剂溶解后避免反复冻融，可根据使用量分装于小管保存于-20℃。
2)蛋白酶抑制剂
3)WestBlot 试剂
HRP偶联二抗
抗小鼠IgG AP 或HRP 偶联物
山羊抗鼠IgG AP 或HRP 偶联物专为Wstern 杂交，噬菌斑/克隆筛选实验中获得最大信噪比而设计。以抗IgG抗体亲和纯化。若用于ELISA ,推荐工作稀释度高于杂交。
Rabbit phosphorylase B 97,400 Dalton、
Bovine Serum Albumin 66,200 Dalton、
Ovalbumin 42,700 Dalton、
Carbonic Anhydrase 31,000 Dalton、
Trypsin Inhibitor 20,100 Dalton、
BugBuster （无一级氨基）蛋白抽提试剂
BugBuster(无一级氨基)是BugBuster的一种特殊配方，用于蛋白抽提物中一级氨基干扰的情况，如蛋白固定化或交联。BugBuster(无一级氨基)使用的PIPPS缓冲液具有与Tris-缓冲BugBuster相似的缓冲容量和PH范围，但不与金属离子形成复合物，使它特别适合于抽提金属依赖性蛋白。
从细胞或组织中纯化蛋白时，第一步是破碎样品和抽提相关蛋白组分，这一步骤十分关键，通常用激烈的机械或酶处理使蛋白暴露于降解性条件，会直接影响目的蛋白的完整性和活性。
为了解决这一问题，研究者用Novagen开发的BugBuster,YeasBuster和CytoBuster等蛋白抽提试剂，是特别组方的去污剂，分别用于从细菌，酵母和哺乳动物细胞中温和、有效的抽提可溶性蛋白，避免采用机械处理造成的蛋白破坏。rLysozyme?溶液与Bugbuster试剂配合使用可以增加细菌的裂解效果。加入Benzonase?核酸酶可特异性降解污染的DNA和RNA，以制备可以立即用于目的蛋白纯化的无核酸，低粘度的抽提物。蛋白酶抑制剂“鸡尾酒”式混合试剂可防止粗提物中目标蛋白降解。

Western Blot显色篇WB蛋白印迹在生物化学这一块是常规实验，就像有人说炒菜中境界最高也最难的是蛋炒饭一样，实验中常规实验也是很考验技能的，除了潜心研究原理、认真揣摩技巧以外，对于新实验试剂的信息把握，勇于尝试新方法也是非常之重要的——各大厂家都在不断开发更方便更灵敏的新产品，“idea是生产力”嘛，因此生物通这里介绍一些能把我们从日常操作中解脱出来，获得“升级版”效果WB产品。

讲完了Western Blotting的电泳转移仪器，蛋白分子量标准和转移膜之后，我们最后来探讨一下WB的检测系统。

一般的WB检测过程中，都会有封闭、一抗、二抗和底物显色这四道工序要“加工”。

我个人觉得底物显色这最后一步是最关键的，也是最有文章可以作的一个部分。

你看，光标记方式就有生物素标记，地高辛标记，各种酶标记等等，酶标的底物又有各种生色底物、化学发光法底物和荧光底物可供选择；就连识别一抗的配体也不一定非要二抗不可，也可以是抗生物素蛋白，链亲和素或者Protein A或G等，更别说各种试剂盒琳琅满目，叫人好像无从下手！不过不急，生物通帮你作个参考，让你对各种产品的优点缺点一览无遗，真正成为一个WB高手。

另外如果实验室有已经建立的固定的显色方法，那也没关系，有时候不经意浏览到的方法可能就会对你的实验有莫大的帮助——这也就达到我们的目的了。

与蛋白质组学一线专家面对面，赶快报名参加第二期蛋白质组学技术与应用高级培训班！封闭和一抗的选择没有太多的选择余地——封闭前面介绍过了；一抗？现在的抗体产品说明书一般都有注明应用范围的，说明可以用于WB的就OK。

如果没有这些信息可以遵从以下原则：单抗专一性高，但是经过SDS-PAGE变性胶电泳的蛋白质可能由于原来的识别位点构象发生改变而不被识别，多抗不如单抗专一性高但更容易得到结果。

如果还有多种抗体选择，那当然是来源于兔或者小鼠抗体为好，因为后继的检测试剂盒一般都是针对兔鼠的居多，因而选择范围更大通用性也更强。

世界知名试剂公司美国ProliantProliant 是世界上最大最有经验的动物源蛋白生产商，生产大批量各种级别的第五组分BSA ，是全球知名的BSA 供应商，市场份额高达60%，是Sigma 、Amresco 等知名品牌的供应商。

瑞士诺华制药默克集团是世界上历史最悠久的家族性医药化工企业，其历史可追溯到1668年。

从1827年开始工业化生产，到100多年前初涉液晶研究，以及2003年分子靶向肿瘤治疗药物爱必妥发布，无数的里程碑都强有力的证明了默克人的领先精神。

自1995年上市开始，默克公司全球范围内所有业务经营活动都是以默克股份两合公司的名义进行的。

今天，默克集团总资本的约70%为伊. 默克（E. Merck OHG）家族所持有，其余30%由自由股东持有。

2007年1月，默克完成了对瑞士生物科技公司雪兰诺的并购。

同年10月，默克将其仿制药业务部门出售给美国Mylan 公司。

默克医药业务包括创新性的处方药及保健药两部分。

处方药如：用于癌症、神经变异退化性疾病、心血管疾病及不孕症治疗药物。

化工业务包括：液晶材料、珠光颜料、实验室分析用品、制药和生物技术工艺生产链所需的产品及服务。

台湾/ Abnova 是世界上最大的单克隆抗体生产商之一，现有抗体产品种类近30000种，其中2/3是单克隆抗体。

和传统的单克隆抗体生产方法相比，Abnova 采用更先进的技术和设备，可以极大地提高单克隆抗体的生产效率并降低其生产的成本。

Abnova 具有每个月开发500个小鼠单克隆抗体的能力，他们的目标是：人类基因组中的每一个表达基因都至少有一种抗体。

美国/Novus 位于美国科罗拉多州，是一家著名的抗体公司。

公司的愿景是提供优质的产品，完善的客户服务以帮助客户快速找到最适合的抗体产品。

通过全球代理商和网络提供10000多种研究级抗体，涉及生命科学的各个领域。

今年6月1日起，Novus 终止向Abcam 供应贴牌产品，改为主要依靠代理商和自营网络系统营销。