常见化学发光免疫分析技术比较

四种HIV抗体检测方法的对比分析高平【摘要】目的:采用化学发光法(CLIA)、乳胶层析法、酶联免疫法(ELISA)和免疫印迹法(WB)进行HIV抗体检测,探讨不同方法学的敏感性和特异性.方法:采用化学发光法对2016年12月—2017年10月门诊和住院患者19090例血清标本进行检测,筛查阳性标本根据《全国艾滋病检测技术规范(2015年修订版)》要求,再用ELISA法和乳胶层析法进行复检,如均有反应或一个有反应一个无反应,则送疾病预防控制中心(CDC)进行抗体WB试验.结果:化学发光法检测出的150例阳性标本中,乳胶层析法检出阳性96例,阴性54例;ELISA检出阳性99例,阴性51例;WB试验检出阳性105例,阴性45例;前三种方法与WB试验符合率分别为70％、91％和94％.结论:初筛方法均具有假阳性和假阴性,HIV抗体先筛查,后WB试验有利于提高HIV抗体检测结果的准确性.化学发光法检测人血清HIV具有较高的灵敏度,自动化程度高,能够及时为临床送检标本进行HIV筛选;乳胶层析法符合率较高,操作简单,检测时间快,可用于急诊等快速检测;ELISA法灵敏度和特异性均较高,可作为HIV批量筛查.【期刊名称】《临床医药实践》【年(卷),期】2019(028)005【总页数】4页(P369-371,375)【关键词】HIV抗体;化学发光法;乳胶层析法;酶联免疫法;免疫印迹法【作者】高平【作者单位】内江市第一人民医院,四川内江 641000【正文语种】中文【中图分类】R446艾滋病(AIDS)是由于感染人类免疫缺陷病毒(HIV)引起的人类免疫功能受损的疾病，可通过性接触、血液及血制品和母婴垂直传播[1]。

近年来，在国际范围内传播和发病率呈上升趋势，在我国感染人数也在逐年增多。

由于艾滋病患者感染HIV后破坏人体内CD4+T淋巴细胞，使人体免疫力降低甚至丧失，最终患者机体在缺乏免疫保护下走向死亡。

因此，艾滋病的防治正成为全世界各个国家和民族所面临的严峻卫生问题和社会难题。

免疫学课后作业比较几种免疫标记技术的异同。

答：根据标记物种类的不同，免疫标记技术可以分为放射免疫分析、酶标记免疫分析、荧光标记免疫分析、化学发光标记免疫分析、胶体金标记免疫分析技术，它们之间具有相同点，也有不同之处，现将其归纳如下。

一、相同点主要包括以下几个方面：1、均具有高特异性。

五种免疫标记技术的免疫技术都是采用抗原抗体反应，而抗原与抗体的结合是一一对应、特异性结合的，故它们都具有非常高的特异性。

2、均具有高灵敏性。

由于五种免疫标记技术的标记技术均采用示踪物标记，例如酶、放色性核素、荧光素、胶体金以及致密物质等，当与标本中的相应抗体或抗原反应后，可以不必测定抗原抗体复合物本身，只需测定复合物中的标记物，通过化学或物理的手段使不见的反应放大，转化为可见的、可测知的光、色、电、脉冲等信号，并可借助仪器精密测定，从而间接测出微量的抗原或抗体。

3、检测对象相同。

除了放射免疫技术只能检测抗原外，其他四种免疫标记技术均可检测抗原或者抗体，即通过已知抗原(或抗体)特异性结合待测抗体（或抗原），从而定性或定量地测出抗体或抗原。

4、免疫标记的程序基本相同。

其包括纯化抗原或抗体、确定标记物质（即决定了最终的检测方式）、进行标记、对标记产物分离纯化和分析鉴定等一系列程序。

二、不同点主要包括以下几个方面：1、检测原理不一样。

首先，酶免疫技术是以酶标记的抗体（或抗原）作为主要试剂，将抗原-抗体反应的特异性和酶催化底物反应高效性和专一性结合起来的一种免疫方法，其对作为标记用的酶具有特定的要求，如活性高、纯度高等；放射免疫标记技术是以放射性同位素作为示踪物的标记免疫测定方法；免疫荧光技术是以荧光素作为标记物与已知的抗体或抗原结合，然后将荧光素标记的抗体作为标准试剂，用于检测和坚定未知的抗原，其对用于标记的荧光素也有特定的要求，如荧光效率高，与蛋白质结合稳定，易于保存等；发光免疫分析技术是将发光分析与免疫反应相结合而建立的一种新型超微量分析技术，它是使用发光剂标记抗体（或抗原），通过发光检测抗原（或抗体）反应的免疫分析方法；免疫胶体金标记技术则是以胶体金作为示踪标记物，而胶体金在碱性环境中带负电荷，与抗体蛋白质分子的正电荷基团因静电而形成牢固结合应用于抗原抗体反应的一种新型免疫检测方法。

微阵列化学发光免疫分析法与蛋白蕊微阵列化学发光免疫分析法（microarray chemiluminescent immunoassay）是一种高通量的生物分析技术，可用于检测并定量多种蛋白质，例如抗体、细胞因子和肿瘤标志物等。

与传统的免疫分析方法相比，微阵列化学发光免疫分析法具有高灵敏度、高特异性、快速、高通量和自动化等优势，因此在生物医学研究和临床诊断中得到了广泛应用。

在微阵列化学发光免疫分析法中，首先将要检测的蛋白质样品固定在载玻片、芯片或微孔板等载体上。

然后，使用特异性的抗体与被检测蛋白质结合，并加入适当的标记物质，如酶或荧光染料，以发出化学发光信号。

最后，通过荧光或酶促反应的测量，可以定量检测样品中蛋白质的含量。

与传统的免疫分析方法相比，微阵列化学发光免疫分析法有以下优势：1.高通量：微阵列技术可以同时检测上千种蛋白质，使得高通量分析成为可能。

这样，可以快速且有效地筛选大量样本，提高研究效率。

2.高灵敏度：由于信号的放大和积累，微阵列化学发光免疫分析法比传统的免疫方法更为灵敏，可以检测到较低浓度的蛋白质。

3.高特异性：由于使用特异性的抗体与被检测蛋白质结合，微阵列化学发光免疫分析法具有高特异性，可以有效地避免其他蛋白质的干扰。

4.快速：微阵列化学发光免疫分析法只需几个小时即可完成，比传统的免疫分析方法更为快速，大大缩短了实验时间。

5.自动化：由于自动化的处理和读取，微阵列化学发光免疫分析法具有更高的可重复性和准确性，可以大大减少操作误差。

微阵列化学发光免疫分析法在生物医学研究和临床诊断中具有广泛的应用。

例如，在肿瘤标志物筛选中，可以使用微阵列化学发光免疫分析法同时检测多种肿瘤标志物，通过比较其相对含量，可以辅助早期肿瘤的诊断和预后评估。

此外，该技术还可以用于药物研发、新型分子的鉴定和生物标记物的发现等领域。

总之，微阵列化学发光免疫分析法是一种高通量、高灵敏度、高特异性、快速和自动化的生物分析技术，在生物医学研究和临床诊断中有着广泛的应用前景。

时间分辨免疫荧光与化学发光法、酶联免疫法测定乙肝标志物的比较摘要目的: 比较化学发光免疫测定（CL）、酶联免疫（EIA）与时间分辨免疫荧光（TRFIA）三种方法检测乙肝病毒免疫标志物的优缺点。

方法: 用上述三种方法的检测试剂及仪器对189例临床血清标本分别进行检测，然后进行结果分析。

结果: 三者对乙肝表面抗原的检测灵敏度均达到了0.1ng/ml。

对HBcAb的测定，以CL的灵敏度最高，ELISA最低。

对表面抗体、E抗原及E抗体的检测，相互符合率均在95%以上，但对核心抗体的检测符合率，TRFIA与CL为83.23%，TRFIA与EIA为85.19%。

结论: 三种方法的检测性能相差不大，但操作性各有特点，应按各实验室具体情况加以选择。

关键词：化学发光法，酶联免疫试验，时间分辨荧光免疫测定本文作者:肖征周薇薇白立彦赵莉萍parison of chemiluminescence, ELISA and time-resolved fluoroimmunoassay in detecting Hepatitis B markers肖征，副主任医师，副教授周薇薇，主管技师白立彦，主管技师赵莉萍，主管技师解放军总医院微生物科，100853Zheng Xiao, Weiwei Zhou, Liyan Bai, Liping ZhaoGeneral Hospital of PLA, Beijing, 100853 PRCAbstractSubject:To pare three deferent assays to see their abilities in detecting hepatitis B markers.Methods：By using Chemiluminescence (CL), ELISA and Time-resolved fluoroimmunoassay (TRFIA), 189 serum samples were tested for hepatitis B markers, then the results were analyzed.Results:The three assays all can detect as low as 0.1ng/ml of HBsAg. But in HBcAb, The CL showed the highest sensitivity, ELISA showed the lowest sensitivity. The coincidences of the three methods in detecting HBsAb, HBeAg, and HBeAb are normally above 95%, but for HBcAb, the coincidence was 83.23% between TRIF and CL, and 85.19% between TRIFA and EIA.Conclusion:There were not much difference among these three methods regarding their abilities in detecting hepatitis B markers, but the maneuver flexibilities of each method differed a lot. One should consider his own lab's situation before making choice.Key words:chemiluminescence, ELISA, time-resolved fluoroimmunoassay自二十世纪七十年代以来，许多高灵敏度的测定方法应用于临床免疫学检测。

化学发光免疫分析技术原理及特点对比一、化学发光免疫分析技术原理自从二十世纪七十年代开创化学发光技术以来，世界各国科学家在这个技术的基础上不断研究发展，以改善此技术在人体医学检验上的应用，通过不懈的努力探索，最终化学发光技术进入临床测试应用，为人类健康检验做出了重要的贡献。

时至今日，化学发光免疫分析作为一种微量物质定量检测技术，已经发展的先进且成熟，在人体疾病筛查和健康检测等方面，有着十分重要的作用。

化学发光免疫分析结合了化学发光反应和免疫学的特点，通过将发光物质或酶标记在抗原或抗体上，抗原或抗体与待测物质发生特异性结合，随后加入氧化剂、化学发光底物或是电压的激发，通过氧化剂氧化发光物质，酶催化发光底物或是发光物质在电压的激发下形成高能的激发态，由于激发态不稳定，再回到基态过程中会以光的形式释放出能量，同时由于待测物浓度与发光强度在一定条件下呈线性定量关系，因此借助仪器检测发光的强度就可以确定待测物的含量。

以测定人绒毛膜促性腺激素(HCG)为例(图)，待测物HCG首先与酶标记的抗体以及发光标记物标记的抗体反应，形成双抗体夹心复合物，随后再加入与含有与发光标记物结合的磁珠，通过磁铁将复合物聚集，最后加入发光底物产生光信号进行定量。

图-人绒毛膜促性腺激素化学发光测定原理二、不同化学发光免疫分析技术特点对比根据标记物的不同，化学发光可大致分为：利用吖啶酯、鲁米诺等进行标记的直接化学发光免疫分析(Chemiluminescence immunoassay，CLIA)、利用如辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶等标记的酶促化学发光免疫分析(Chemiluminescence enzyme immunoassay，CLEIA)和利用三联吡啶钌等标记的电化学发光免疫分析(Electrochemiluminescence immunoassay，ECLIA)。

直接化学发光免疫分析发光过程十分快速，在几秒钟之内就可以完成，而酶在一般情况下稳定性较好，如辣根过氧化物酶处于室温下可以在几周内保持稳定，且具有较高的特异性，发光时间较直接化学发光法更长，可以持续几分钟到十几分钟，电化学发光法处于电解池介质中反应因而可以反复使用。

化学发光免疫分析技术化学发光免疫分析技术（Chemiluminescence Immunoassay，简称CLIA）是一种用于检测物质浓度的生化分析技术。

该技术利用免疫反应，在荧光底物的作用下产生可见光发射，从而实现对物质的检测和定量分析。

化学发光免疫分析技术的基本原理是将待测物与对应的抗原或抗体结合，形成免疫复合物。

然后，将荧光标记的抗体或抗原加入到体系中，与免疫复合物结合。

接下来，加入荧光底物，在适当的条件下，底物被激活，产生化学反应，释放出能量，从而形成荧光。

荧光信号可以通过荧光仪进行检测和定量分析。

荧光仪通过光电倍增管等装置将荧光信号转化为电信号，经过控制和处理，最终得到物质的浓度。

化学发光免疫分析技术的优势在于其灵敏度高。

由于发光底物的特殊性质，即使在低浓度下，也能产生明显的发光信号。

此外，化学发光免疫分析技术的特异性强，能够准确识别目标物质，避免误判。

另外，与其他传统的免疫分析方法相比，化学发光免疫分析技术反应速度快，可以在较短的时间内得到结果。

此外，操作简单，无需复杂的设备和技术，具有很高的实用性。

化学发光免疫分析技术在医学诊断中有着广泛的应用。

比如，可以用于检测血清中肿瘤标志物的浓度，从而实现早期诊断和预测疾病进展的风险。

此外，化学发光免疫分析技术还可以应用于感染性疾病的快速诊断，如艾滋病、结核病等。

此外，化学发光免疫分析技术还被广泛应用于生物制药工业中的药物分析。

在食品安全领域，也可以利用化学发光免疫分析技术检测食品中的有害物质，从而保障食品的质量安全。

总之，化学发光免疫分析技术是一种灵敏、特异、操作简单的生化分析技术。

在医学诊断、药物检测、食品安全检测等领域有着广泛的应用前景。

随着技术的不断发展和创新，化学发光免疫分析技术将进一步完善，并在更多的领域发挥重要的作用。

免疫学技术的迅速发展对精度的要求越来越高，一般的酶免检测技术已逐渐无法适应这种形势的需要。

现今发展的主流已不再是用放射性同位素标记的测定方法(避免污染环境及对人体损害)，而是转向于能在任何地方操作的快速均相和固相测定，最终趋向于能够枪测到皮克或10负18摩尔级的、非同位素的、自动或半自动的实验室测定技术，发光免疫分析技术顺应了这一潮流，开创了免疫诊断的新纪元。

发光免疫分析是一种灵敏度高、特异性强、检测快速及无放射危害的分析技术。

70年代末以来得到了迅速发展，目前在国际上已经实现商品化和产业化的发光免疫分析产品，基本上可以分为：化学发光、时间分辨荧光(也称时间延迟光致发光)、电化学发光(也称场致发光和电致发光)几种。

1、化学发光化学发光是指在化学反应过程中发出可见光的现象。

通常是指有些化合物不经紫外光或可见光照射，通过吸收化学能(主要为氧化还原反应)，从基态激发至激发态。

退激时通过跃迁(或将激发能转移至受体分子上)，释放能量产生光子，以光形式放出能量从而导致的发光现象。

其主要特点为消耗发光剂。

同时量子效率相对较低。

1.1 按化学反应类型分类：可分为酶促化学发光和非酶促化学发光两类。

其中酶促化学发光主要包括辣根过氧化物酶(HRP)系统、碱性磷酸酶 (ALP)系统、黄嘌呤氧化酶系统等。

酶促发光的共同特点为发光过程中作为标记物的酶基本不被消耗，而反应体系中发光剂充分过最，因此发光信号强而稳定，且发光时间较长。

因此可采用速率法测量，故检测方式简单、成本较低。

酶促反应的主要缺点为工作曲线可能随时间漂移，而且低端斜率容易呈非线性下移。

而非酶促化学发光包括吖啶酯系统、草酸酯系统、三价铁一鲁米诺系统等。

非酶促发光的共同特点为发光过程中标记物被消耗，同时作为标记物的发光剂是发光反应的瓶颈，即含量总是相对不足，因此发光信号持续时间较短；如果直接在免疫反应杯中启动发光反应，由于发光剂被很快消耗，故只能进行一次性测量。

所以重复性较差。

常见化学发光免疫分析技术比较1、化学发光免疫分析化学发光免疫分析(chemiluminescence immunoassay,CLIA），英音:［，kemi，lju：mi’nesəns] ［，imju：nəuə’sei]是将具有高灵敏度的化学发光测定技术与高特异性的免疫反应相结合，用于各种抗原、半抗原、抗体、激素、酶、脂肪酸、维生素和药物等的检测分析技术。

是继放免分析、酶免分析、荧光免疫分析和时间分辨荧光免疫分析之后发展起来的一项最新免疫测定技术。

CLIA是将具有高灵敏度的化学发光测定技术与高特异性的免疫反应相结合，用于各种抗原、半抗原、抗体、激素、酶、脂肪酸、维生素和药物等的检测分析技术。

是继放免分析、酶免分析、荧光免疫分析和时间分辨荧光免疫分析之后发展起来的一项最新免疫测定技术。

1.1、化学发光免疫分析原理化学发光免疫分析包含两个部分, 即免疫反应系统和化学发光分析系统。

化学发光分析系统是利用化学发光物质经催化剂的催化和氧化剂的氧化，形成一个激发态的中间体，当这种激发态中间体回到稳定的基态时，同时发射出光子（hv) , 利用发光信号测量仪器测量光量子产额。

免疫反应系统是将发光物质（在反应剂激发下生成激发态中间体）直接标记在抗原（化学发光免疫分析）或抗体（免疫化学发光分析) 上，或酶作用于发光底物.1。

2、化学发光免疫分析类型化学发光免疫分析法以标记方法的不同而分为两种:（1)化学发光标记免疫分析法；（2）酶标记、以化学发光底物作信号试剂的化学发光酶免疫分析法1。

2.1化学发光标记免疫分析化学发光标记免疫分析又称化学发光免疫分析（CL IA ）, 是用化学发光剂直接标记抗原或抗体的免疫分析方法.常用于标记的化学发光物质有吖啶酯类化合物-acridiniumester (AE) ，是有效的发光标记物,其通过起动发光试剂(NaOH-H2O2）作用而发光，强烈的直接发光在一秒钟内完成，为快速的闪烁发光。

三大品牌全自动化学发光免疫分析系统的对比分析㈠、ACS：180SE全自动化学发光免疫分析系统ACS全自动化学发光免疫分析系统由拜耳公司生产，采用化学发光技术和磁性微粒子分离技术相结合的免疫分析系统。

20世纪90年代初首次推出全自动化学发光免疫分析系统ACS：180。

90年代中期推出第二代产品为ACS：180SE分析系统(图2)，最近该公司又推出了ACS：CENTAUR。

第二代产品将微机与主机分开，软件程序加以改进，使操作更灵活，结果准确可靠，试剂贮存时间长，自动化程度高等优点。

1.仪器测定原理该免疫分析技术有两种方法：一是小分子抗原物质的测定采用竞争法；二是大分子的抗原物质测定采用夹心法。

该仪器所用固相磁粉颗粒极微小，其直径仅1.0μm，这样大大增加了包被表面积，增加抗原或抗体的吸附量，使反应速度加快，也使清洗和分离更简便。

其反应基本过程：⑴竞争反应：用过量包被磁颗粒的抗体，与待测的抗原和定量的标记吖啶酯抗原同时加入反应杯温育，其免疫反应的结合形式有两种，一是标记抗原与抗体结合成复合物；二是测定抗原与抗体的结合形式。

⑵夹心法：标记抗体与被测抗原同时与包被抗体结合成一种反应形式，即包被抗体-测定抗原-发光抗体的复合物。

上述无论哪种反应凡所结合的免疫复合物均被磁铁吸附于反应杯底部，上清液吸出后，再加入碱性试剂；其免疫复合物被氧化激发，发射出430nm波长的光子，再由光电倍增管将光能转变为电能，以数字形式反映光量度，计算测定物的浓度。

竞争法是负相关反应。

夹心法是正相关反应。

2.实验操作本仪器测定所用试剂均包括两种：固相磁粉和液相发光试剂。

每套试剂可放置于试剂托盘的任意位置上，由仪器扫描标签条码后自动加样。

根据测定项目不同，试剂用量在50~450μl之间。

测定标本必须用血清，禁止用血浆，以防纤维蛋白将管路堵塞。

由于是自动化仪器，其操作极其简单：①将样品编号排入样品盘。

②按试验项目将所用试剂放入试剂盘，并观察辅助试剂。

常见发光免疫分析技术的比较免疫学技术的迅速发展对精度的要求越来越高，一般的酶免检测技术已逐渐无法适应这种形势的需要。

现今发展的主流已不再是用放射性同位素标记的测定方法(避免污染环境及对人体损害)，而是转向于能在任何地方操作的快速均相和固相测定，最终趋向于能够枪测到皮克或10负18摩尔级的、非同位素的、自动或半自动的实验室测定技术，发光免疫分析技术顺应了这一潮流，开创了免疫诊断的新纪元。

发光免疫分析是一种灵敏度高、特异性强、检测快速及无放射危害的分析技术。

70年代末以来得到了迅速发展，目前在国际上已经实现商品化和产业化的发光免疫分析产品，基本上可以分为：化学发光、时间分辨荧光(也称时间延迟光致发光)、电化学发光(也称场致发光和电致发光)几种。

1、化学发光化学发光是指在化学反应过程中发出可见光的现象。

通常是指有些化合物不经紫外光或可见光照射，通过吸收化学能(主要为氧化还原反应)，从基态激发至激发态。

退激时通过跃迁(或将激发能转移至受体分子上)，释放能量产生光子，以光形式放出能量从而导致的发光现象。

其主要特点为消耗发光剂。

同时量子效率相对较低。

1.1 按化学反应类型分类：可分为酶促化学发光和非酶促化学发光两类。

其中酶促化学发光主要包括辣根过氧化物酶(HRP)系统、碱性磷酸酶 (ALP)系统、黄嘌呤氧化酶系统等。

酶促发光的共同特点为发光过程中作为标记物的酶基本不被消耗，而反应体系中发光剂充分过最，因此发光信号强而稳定，且发光时间较长。

因此可采用速率法测量，故检测方式简单、成本较低。

酶促反应的主要缺点为工作曲线可能随时间漂移，而且低端斜率容易呈非线性下移。

而非酶促化学发光包括吖啶酯系统、草酸酯系统、三价铁一鲁米诺系统等。

非酶促发光的共同特点为发光过程中标记物被消耗，同时作为标记物的发光剂是发光反应的瓶颈，即含量总是相对不足，因此发光信号持续时间较短；如果直接在免疫反应杯中启动发光反应，由于发光剂被很快消耗，故只能进行一次性测量。

化学发光免疫分析技术发光是指分子或原子中的电子吸收能量后，由基态跃迁到激发态，然后再返回到基态，并释放光子的过程。

化学发光是吸收了化学反应过程中所产生的化学能使分子激发而发光。

化学发光免疫分析是将化学发光与免疫反应相结合，用于检测微量抗原或抗体的标记免疫分析技术，分为直接化学发光免疫分析，化学发光酶免疫分析和电化学发光免疫分析。

化学发光免疫分析的类型一、直接化学发光免疫分析二、化学发光酶免疫分析三、电化学发光免疫分析发光免疫分析:是将发光分析和免疫反应相结合而建立起来的一种新的检测微量抗原或抗体的新型标记免疫分析技术。

发光:是指分子或原子中的电子吸收能量后，由基态（较低能级）跃迁到激发态（较高能级），然后再返回到基态，并释放光子的过程。

根据形成激发态分子的能量来源不同可分为:光照发光、生物发光、化学发光等。

光照发光（photoluminescence）是指发光剂（荧光素）经短波长的入射光照射后，电子吸收能量跃迁到激发态，在其回复至基态时，发射出较长波长的可见光（荧光）。

生物发光（bioluminescence）是指发生在生物体内的发光现象，如萤火虫的发光，反应底物为萤火虫荧光素，在荧光素酶的催化下，利用ATP能，生成激发态氧化型荧光素，它在回复基态时多余的能量以光子的形式释放出来。

化学发光（chemiluminescence）是指伴随化学反应过程所产生的光的发射现象。

某些物质(发光剂)在化学反应时，吸收了反应过程中所产生的化学能，使反应的产物分子或反应的中间态分子中的电子跃迁到激发态，当电子从激发态回复到基态时，以发射光子的形式释放出能量，这一现象称为化学发光。

一些化学反应能释放足够的能量把参加反应的物质激发到能发射光的电子激发态，若被激发的是一个反应产物分子，则这种反应过程叫直接化学发光。

若激发能传递到另一个未参加化学反应的分子D上，使D分子激发到电子激发态，D分子从激发态回到基态时发光，这种过程叫间接化学发光。