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第章细菌药敏试验及其耐药表型检测细菌药敏试验是临床细菌感染治疗中非常重要的检测手段，通过该技术可以检测不同抗生素对细菌的敏感性，进而为合理使用抗生素提供科学的依据。
然而，在临床应用过程中，随着抗生素不合理使用的增加，细菌耐药性也随之快速发展。
因此，针对不同耐药表型的检测越来越受到关注。
一、细菌药敏试验细菌药敏试验是一种用于判断细菌对不同抗生素敏感性的方法。
常见的细菌药敏试验方法包括纸片扩散法、E测试、革兰氏染色法、微量稀释法等。
其中纸片扩散法是最常用的一种方法，其原理是将待检细菌涂在琼脂平板上，然后在板上放置一些含有不同抗菌药物的试纸，细菌耐药性差的部分会被试纸上的抗生素杀灭，出现纯净孔（抑菌圈），通过抑菌圈的直径可以初步判断细菌对抗生素的敏感性或耐药性。
细菌药敏试验有很多应用价值，如能够帮助医生选择合适的抗生素治疗细菌感染，避免了不必要的抗生素使用，同时也可作为科研人员研究细菌抗药机制的工具，为抗菌药物的开发提供依据。
二、耐药表型检测随着细菌抗药性问题的不断加重，对不同耐药表型检测的需求也越来越迫切。
耐药表型是指细菌对特定抗生素的耐药情况。
由于不同的细菌及其不同的菌株对抗生素的敏感程度有所不同，因此抗菌药物在应用过程中会出现不同菌株对不同药物的耐药表型。
目前，针对不同耐药表型检测的方法主要有两种：基于分子生物学技术的方法和基于药敏试验的方法。
1. 基于分子生物学技术的方法基于分子生物学技术的方法是检测细菌耐药性最常用的方法之一。
该方法通过检测细菌中特定的基因或者基因片段，以此确定细菌耐药性的表型。
常见的基于分子生物学技术的方法包括PCR检测、基因芯片技术、实时荧光定量PCR等。
2. 基于药敏试验的方法基于药敏试验的方法是已经成熟的检测方法之一，其通过将药敏试验的结果与临床药物疗效相结合，进而确定细菌耐药性表型。
通过检测不同抗生素对不同菌株的敏感性，可以初步反映出细菌的耐药性状态。
当然，这种方法不仅涉及到耗时、耗材、人力等成本的问题，而且还受到试验条件、条件操作等方面的影响。
细菌耐药表型检测细菌耐药表型的检测细菌耐药机制：1.产生药物灭活酶：细菌通过耐药因子可产生破坏抗生素或使之失去抗菌活性的酶，使药物在作用于菌体前即被破坏或失效。
水解酶：主要是β内酰胺酶，包括广谱酶、超广谱酶、金属酶、AmpC酶。
钝化酶：氨基糖苷类钝化酶，使氨基糖苷类抗生素分子结构发生改变，使药物不易进入细菌体内。
修饰酶：2．抗菌药物作用靶位的改变：细菌通过改变药物作用靶位的结构来降低药物和细胞靶位的亲和力，引起对抗菌药物的耐药性。
如细菌可改变青霉素结合蛋白（PBP S）的结构，降低与β—内酰胺类抗生素的亲合力，减少细菌与β—内酰胺类抗生素的结合，从而对β—内酰胺类抗菌药物耐药。
3.细菌细胞膜通透性改变：抗菌药物不易进入由于细菌细胞壁或细胞膜通透性的改变，致使抗菌药物无法进入细胞内而发挥抗菌作用。
细菌可改变细胞壁的孔蛋白通道，使青霉素类、头孢菌素类和氨基糖苷类抗生素不能进入菌体；4.细菌将抗菌药物泵出细菌细胞外（外排泵）：细菌还可合成新的蛋白插入细胞膜即产生新的膜转运系统，对抗菌药物产生外排作用，近年来发现了许多临床常见致病菌具有与其多重耐药相关的主动外排系统或外排泵，如绿脓杆菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、肠球菌、淋球菌等，促使抗菌药物快速从菌体排出，从而导致细菌的耐药性。
总之,细菌耐药性机制是一个相当复杂的问题，其中，细菌产生灭活酶或钝化酶引起的耐药性在临床上具有重要意义。
多重耐药菌往往综合上述几种耐药机制，使之对许多抗微生物药物产生耐药。
细菌耐药性的发生和发展是抗微生物药物的广泛应用，特别是无指征滥用的后果。
一、β-内酰胺酶检测使用范围：葡萄球菌、肠球菌、流感嗜血杆菌、淋病奈瑟菌、卡它莫拉菌。
方法：头孢硝基噻吩显色法（Nitrocefin）：制配纸片→灭菌水湿润→涂测试菌（G+菌可直接挑待测菌；G-菌提取细菌裂解液）于纸片上，10min观察纸片颜色，显红色为阳性（葡萄球菌应放置1h内观察）。
临床意义：若β-内酰胺酶阳性，则提示:流感、淋病、卡它对青霉素、氨苄西林、阿莫西林耐药葡萄、肠球对青霉素、氨基、羧基、脲基青霉素耐药对产该酶的菌株禁止应用青霉素类、广谱青霉素类抗菌药物，应根据药敏试验结果应用含酶抑制剂药物或头孢菌素联合氨基糖苷类或氟喹诺酮类，根据情况可选用糖肽类及碳青霉烯类抗菌药物。
细菌耐药表型的检测细菌耐药机制：1.产生药物灭活酶：细菌通过耐药因子可产生破坏抗生素或使之失去抗菌活性的酶，使药物在作用于菌体前即被破坏或失效。
水解酶：主要是β内酰胺酶，包括广谱酶、超广谱酶、金属酶、AmpC酶。
钝化酶：氨基糖苷类钝化酶，使氨基糖苷类抗生素分子结构发生改变，使药物不易进入细菌体内。
修饰酶：2．抗菌药物作用靶位的改变：细菌通过改变药物作用靶位的结构来降低药物和细胞靶位的亲和力，引起对抗菌药物的耐药性。
如细菌可改变青霉素结合蛋白（PBP S）的结构，降低与β—内酰胺类抗生素的亲合力，减少细菌与β—内酰胺类抗生素的结合，从而对β—内酰胺类抗菌药物耐药。
3.细菌细胞膜通透性改变：抗菌药物不易进入由于细菌细胞壁或细胞膜通透性的改变，致使抗菌药物无法进入细胞内而发挥抗菌作用。
细菌可改变细胞壁的孔蛋白通道，使青霉素类、头孢菌素类和氨基糖苷类抗生素不能进入菌体；4.细菌将抗菌药物泵出细菌细胞外（外排泵）：细菌还可合成新的蛋白插入细胞膜即产生新的膜转运系统，对抗菌药物产生外排作用，近年来发现了许多临床常见致病菌具有与其多重耐药相关的主动外排系统或外排泵，如绿脓杆菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、肠球菌、淋球菌等，促使抗菌药物快速从菌体排出，从而导致细菌的耐药性。
总之,细菌耐药性机制是一个相当复杂的问题，其中，细菌产生灭活酶或钝化酶引起的耐药性在临床上具有重要意义。
多重耐药菌往往综合上述几种耐药机制，使之对许多抗微生物药物产生耐药。
细菌耐药性的发生和发展是抗微生物药物的广泛应用，特别是无指征滥用的后果。
一、β-内酰胺酶检测使用范围：葡萄球菌、肠球菌、流感嗜血杆菌、淋病奈瑟菌、卡它莫拉菌。
方法：头孢硝基噻吩显色法（Nitrocefin）：制配纸片→灭菌水湿润→涂测试菌（G+菌可直接挑待测菌；G-菌提取细菌裂解液）于纸片上，10min观察纸片颜色，显红色为阳性（葡萄球菌应放置1h内观察）。
临床意义：若β-内酰胺酶阳性，则提示:流感、淋病、卡它对青霉素、氨苄西林、阿莫西林耐药葡萄、肠球对青霉素、氨基、羧基、脲基青霉素耐药对产该酶的菌株禁止应用青霉素类、广谱青霉素类抗菌药物，应根据药敏试验结果应用含酶抑制剂药物或头孢菌素联合氨基糖苷类或氟喹诺酮类，根据情况可选用糖肽类及碳青霉烯类抗菌药物。
实验七细菌的药敏试验及耐药性检测【目的和要求】1.掌握纸片扩散法（K-B法）、液体稀释法两种药敏试验的原理和方法。
2.熟悉上述两种药敏试验方法的应用。
3.了解几种细菌耐药表型检测的原理、方法及意义。
【试剂与器材】1．培养基：一般需氧和兼性厌氧菌采用水解酪蛋白（M-H）琼脂或M-H液体培养基（pH7.2~7.4）。
对于营养要求高的细菌，则需在M-H培养基中加入其它营养成分。
2．抗菌药物纸片：直径为6.0~6.35mm的滤纸片上，含有一定量的某种抗菌药物。
市场有售，但生产厂家须获得国家食品药品监督管理局（SFDA）批准。
不同种类的待测菌药敏试验选择不同的抗菌药物，药敏纸片的选择见表7-1。
3．待测细菌接种普通营养琼脂经35℃16~18h的纯培养物。
4. 0.5%麦氏比浊管配制方法如下：0.048mol BaCl2 (1.17% W/V BaCl2 . 2H2O) 0.5ml0.18mol H2SO4 (1%, V/V) 99.5ml将二液置冰水浴中冷却后混合，置螺口试管中，放室温暗处保存。
用前混匀。
有效期为6个月。
5.其它：无菌生理盐水、无菌棉签、无菌试管、酒精灯、镊子、生物安全柜、培养箱等。
【实验内容】一、纸片扩散法（K-B法）药敏试验1．原理将含有定量的抗菌药物纸片贴在已接种待测细菌的琼脂平板表面，纸片上的药物随即溶于琼脂中，并沿纸片周围由高浓度向低浓度扩散，形成逐渐减少的梯度浓度。
在纸片周围，一定浓度的药物抑制了细菌的生长从而形成了透明的抑菌环，抑菌环的大小则反映了待测菌对该种药物的敏感程度。
K-B法是由Kirby - Bauer 建立，美国NCCLS推荐，目前为世界所公认的标准纸片扩散法（定性法）。
2．方法（1）培养基的准备：将无菌M-H琼脂加热融化，趁热倾注入无菌的直径90mm平皿中。
琼脂厚为4mm（约23~25ml培养基），琼脂凝固后塑料包装放4℃保存，在5日内用完，使用前应在37℃培养箱放置30min使表面干燥。
