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细菌耐药性检测方法 Prepared on 22 November 2020细菌耐药性检测方法1、细菌耐药表型检测：判断细菌对抗菌药物的耐药性可根据NCCLS标准，通过测量纸片扩散法、肉汤稀释法和E试验的抑菌圈直径、MIC值和IC值获得。
也可通过以下方法进行检测：（1）耐药筛选试验：以单一药物的单一浓度检测细菌的耐药性被称为耐药筛选试验，临床上常用于筛选耐甲氧西林葡萄球菌、万古霉素中介的葡萄球菌、耐万古霉素肠球菌及氨基糖苷类高水平耐药的肠球菌等。
（2）折点敏感试验：仅用特定的抗菌药物浓度（敏感、中介或耐药折点MIC），而不使用测定MIC时所用的系列对倍稀释抗生素浓度测试细菌对抗菌药物的敏感性，称为折点敏感试验。
（3）双纸片协同试验：双纸片协同试验是主要用于筛选产超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）革兰阴性杆菌的纸片琼脂扩散试验。
若指示药敏纸片在朝向阿莫西林/克拉维酸方向有抑菌圈扩大现象（协同），说明测试菌产生超广谱β-内酰胺酶（4）药敏试验的仪器化和自动化：全自动细菌鉴定及药敏分析仪如：Vitek-2、BD-Pheonix、Microscan等运用折点敏感试验的原理可半定量测定抗菌药物的MIC值。
2．β-内酰胺酶检测：主要有碘淀粉测定法（iodometric test）和头孢硝噻吩纸片法（nitrocefin test）。
临床常用头孢硝噻吩纸片法，β-内酰胺酶试验可快速检测流感嗜血杆菌、淋病奈瑟菌、卡他莫拉菌和肠球菌对青霉素的耐药性。
如β-内酰胺酶阳性，表示上述细菌对青霉素、氨苄西林、阿莫西林耐药；表示葡萄球菌和肠球菌对青霉素（包括氨基、羧基和脲基青霉素）耐药。
3．耐药基因检测：临床可检测的耐药基因主要有：葡萄球菌与甲氧西林耐药有关的MecA基因,大肠埃希菌与β-内酰胺类耐药有关的blaTEM、blaSHV、blaOXA基因，肠球菌与万古霉素耐药有关的vanA、vanB、vanC、vanD基因。
检测抗菌药物耐药基因的方法主要有：PCR扩增、PCR-RFLP分析、PCR-SSCP 分析、PCR-线性探针分析、生物芯片技术、自动DNA 测序4．特殊耐药菌检测（1）耐甲氧西林葡萄球菌检测：对 1цg苯唑西林纸片的抑菌圈直径≤10㎜，或其MIC≥4цg/ml 的金黄色葡萄球菌和对1цg苯唑西林纸片的抑菌圈直径≤17㎜，或MIC≥цg/ml的凝固酶阴性葡萄球菌被称为耐甲氧西林葡萄球菌（MRS）。
实验七细菌的药敏试验及耐药性检测【目的和要求】1.掌握纸片扩散法（K-B法）、液体稀释法两种药敏试验的原理和方法。
2.熟悉上述两种药敏试验方法的应用。
3.了解几种细菌耐药表型检测的原理、方法及意义。
【试剂与器材】1．培养基：一般需氧和兼性厌氧菌采用水解酪蛋白（M-H）琼脂或M-H液体培养基（pH7.2~7.4）。
对于营养要求高的细菌，则需在M-H培养基中加入其它营养成分。
2．抗菌药物纸片：直径为6.0~6.35mm的滤纸片上，含有一定量的某种抗菌药物。
市场有售，但生产厂家须获得国家食品药品监督管理局（SFDA）批准。
不同种类的待测菌药敏试验选择不同的抗菌药物，药敏纸片的选择见表7-1。
3．待测细菌接种普通营养琼脂经35℃16~18h的纯培养物。
4. 0.5%麦氏比浊管配制方法如下：0.048mol BaCl2 (1.17% W/V BaCl2 . 2H2O) 0.5ml0.18mol H2SO4 (1%, V/V) 99.5ml将二液置冰水浴中冷却后混合，置螺口试管中，放室温暗处保存。
用前混匀。
有效期为6个月。
5.其它：无菌生理盐水、无菌棉签、无菌试管、酒精灯、镊子、生物安全柜、培养箱等。
【实验内容】一、纸片扩散法（K-B法）药敏试验1．原理将含有定量的抗菌药物纸片贴在已接种待测细菌的琼脂平板表面，纸片上的药物随即溶于琼脂中，并沿纸片周围由高浓度向低浓度扩散，形成逐渐减少的梯度浓度。
在纸片周围，一定浓度的药物抑制了细菌的生长从而形成了透明的抑菌环，抑菌环的大小则反映了待测菌对该种药物的敏感程度。
K-B法是由Kirby - Bauer 建立，美国NCCLS推荐，目前为世界所公认的标准纸片扩散法（定性法）。
2．方法（1）培养基的准备：将无菌M-H琼脂加热融化，趁热倾注入无菌的直径90mm平皿中。
琼脂厚为4mm（约23~25ml培养基），琼脂凝固后塑料包装放4℃保存，在5日内用完，使用前应在37℃培养箱放置30min使表面干燥。
抗菌药物敏感性实验与细节耐药性监测来源：查验医学在线2009-4-15 南网编辑2010-7-6一、需氧菌及兼性厌氧菌的药物敏感实验(一)纸片琼脂扩散法纸片琼脂扩散法又称Kirby-Bauer实验，是操作最简易、利用最普遍的抗菌药物敏感性实验。
1．实验原理将含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测试菌的琼脂平板上。
纸片中所含的药物吸收琼脂中的水分溶解后不断向纸片周围区域扩散形成递减的梯度浓度。
在纸片周围抑菌浓度范围内测试菌的生长被抑制，从而形成透明的抑菌圈。
抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的敏感程度，并与该药对测试菌的最低抑菌浓度(MIC)呈负相关关系，即抑菌圈越大，MIC越小。
2．培育基和抗菌药物纸片(1)培育基：水解酪蛋白(Mueller-Hin-ton，MH)培育基是CLSI/NCCLS采用的兼性厌氧菌和需氧菌药敏实验标准培育基，pH值为～，对那些营养要求高的细菌如流感嗜血杆菌、淋病奈瑟菌、链球菌等需加入补充物质。
琼脂厚度为4mm。
配制琼脂平板当天利用或置塑料密封袋中4℃保留，利用前应将平板置35℃孵育箱孵育，使其表面干燥。
(2)抗菌药物纸片：选择直径为6.35mm，吸水量为20ul的专用药敏纸片用逐片加样或浸泡方式使每片含量达到规定所示。
含药纸片密封贮存2～8℃或-20℃无霜冷冻箱内保留，β-内酰胺类药敏纸片应冷冻贮存，且不超过l周。
利用前将贮存容器移至室温平衡l～2h，避免开启贮存容器时产生冷凝水。
3．细菌接种细菌接种采用直接菌落或细菌液体生长方式。
用麦氏比浊标准的菌液浓度。
校正浓度后的菌液应在15min内接种完毕。
接种步骤如下：①用无菌棉拭子蘸取菌液，在管内壁将多余菌液旋转挤去后，在琼脂表面均匀涂片接种3次，每次旋转60°，最后沿平板内缘涂抹1周；②平板置室温下干燥3～5min，用纸片分离器或无菌镊将含药纸片紧贴于琼脂表面；③置35℃孵育箱孵育16～18h后阅读结果，对甲氧西林和万古霉素药敏感实验结果应孵育24h。
第七章-细菌耐药性检测一教学大纲要求1.临床常用抗菌药物2.抗菌药物敏感试验3.细菌的耐药性和产生机制4.细菌的耐药性检查5.厌氧菌、真菌及分支杆菌体外药敏试验二教材内容精要㈠、抗菌药物1. 青霉素类青霉素类抗生素是具有内酰胺环的一类抗生素。
作用机制为抑制细菌细胞壁的合成。
种类包括青霉素G、青霉素V、苯唑西林、氯唑西林、双氯西林、氟氯西林、氨苄西林、阿莫西林、羧苄西林、替卡西林、阿洛西林、美洛西林、哌拉西林、美西林等。
2. 头孢菌素类第一代头孢菌素类对革兰阳性细菌（包括青霉素敏感或耐受的葡萄球菌）的抗菌活性较第二、三代强。
常用品种包括头孢唑啉、头孢拉定、头孢氨苄、头孢羟氨苄、头孢硫咪等。
第二代头孢菌素对革兰阳性细菌的活性与第一代相似或略差，对多数革兰阴性细菌的抗菌活性较强，但对铜绿假单胞菌无抗菌活性。
对β-内酰胺酶较稳定，主要包括头孢克洛、头孢夫辛、头孢夫辛酯、头孢孟多等。
第三代头孢菌素对革兰阳性菌的抗菌活性不如第一、二代，对革兰阴性细菌有较强的抗菌活性。
对第一、二代头孢菌素耐药菌也较敏感。
但是其抗革兰阳性细菌的活性仍然较弱。
对β-内酰胺酶有较强的稳定，组织穿透力较弱，半衰期较长。
主要包括头孢噻肟、头孢曲松、头孢他啶、头孢哌酮、头孢妥伦匹酯、头孢唑肟、头孢地嗪、头孢他美酯、头孢美唑、头孢泊肟酯、头孢克肟等。
第四代头孢菌素与第三代相比，抗菌谱更广泛。
对革兰阳性球菌的抗菌活性增强，对β-内酰胺酶更稳定。
因此，对革兰阴性细菌的抗菌活性仍然较强。
主要包括头孢吡肟、头孢匹罗等。
3. 碳青霉烯类碳青霉烯类为一组新型β-内酰胺类抗生素，超广谱高效能抗菌作用，对革兰阴性细菌、阴性细菌、需氧菌、厌氧菌均有很强的抗菌活性，对β-内酰胺酶稳定。
有亚胺培南、美罗培南、帕尼培南等。
4.头霉素类cephamycins包括头孢西丁、头孢美唑、头孢替坦、头孢米诺等。
抗菌谱广，对革兰阴性菌、阳性菌、厌氧菌及需氧菌均有较强的活性，对质粒或染色体介导的β-内酰胺酶具有高度稳定性。
药敏试验与耐药监测制度1. 背景介绍1.1 医院药敏试验与耐药监测制度的目的是为了保障药物治疗的有效性和安全性，防备或掌控耐药菌株的传播和扩散，提高患者治疗效果和医疗质量。
1.2 本制度适用于医院各科室和试验室涉及药敏试验和耐药监测的相关工作人员。
2. 药敏试验管理2.1 药敏试验的目的是评估细菌对药物的抗药性，为临床供应合理的抗菌治疗方案。
药敏试验应由具备相应资质和专业技能的医疗人员负责。
2.2 药敏试验人员应具备相关的专业知识和操作技能，并经过相关培训和资格认证。
2.3 药敏试验应在合适的试验室环境下进行，确保试验室设备的正常运行并定期进行维护。
2.4 药敏试验应依照标准操作规程进行，确保结果的准确性和可靠性，并做好记录和归档工作。
2.5 药敏试验结果应及时向临床医生反馈，并帮助订立合理的治疗方案。
3. 耐药监测管理3.1 耐药监测的目的是及时了解和监测细菌对药物的耐药情况，采取相应的措施防备和掌控耐药菌株的传播和扩散。
3.2 耐药监测工作应由特地的耐药监测小组负责，小构成员应具备相关的专业知识和技能，并定期进行培训和沟通。
3.3 耐药监测应涵盖医院内各科室的临床标本和环境标本，监测范围包含革兰阳性菌、革兰阴性菌和真菌等。
3.4 耐药监测应建立一个完善的数据库，并定期进行数据分析和报告。
3.5 耐药监测结果应及时向相关部门汇报，并订立相应的防控策略。
4. 药敏试验与耐药监测质控4.1 药敏试验和耐药监测应建立质量管理体系，并订立相关的质量掌控标准和程序。
4.2 药敏试验和耐药监测的操作人员应严格依照规定的操作流程和质量掌控标准进行操作。
4.3 药敏试验和耐药监测设备应定期进行校准和维护，并记录相关情况。
4.4 药敏试验和耐药监测的结果应进行双盲复核，并进行结果的比对和分析，确保结果的准确性和可靠性。
4.5 药敏试验和耐药监测过程中发生的异常情况和问题应及时报告，进行分析和处理。
5. 相关违规行为处理5.1 对于违反本制度规定的人员，将依照医院相关纪律处分管理方法进行处理。
实验七细菌的药敏试验及耐药性检测【目的和要求】1.掌握纸片扩散法（K-B法）、液体稀释法两种药敏试验的原理和方法。
2.熟悉上述两种药敏试验方法的应用。
3.了解几种细菌耐药表型检测的原理、方法及意义。
【试剂与器材】1．培养基：一般需氧和兼性厌氧菌采用水解酪蛋白（M-H）琼脂或M-H液体培养基（pH7.2~7.4）。
对于营养要求高的细菌，则需在M-H培养基中加入其它营养成分。
2．抗菌药物纸片：直径为6.0~6.35mm的滤纸片上，含有一定量的某种抗菌药物。
市场有售，但生产厂家须获得国家食品药品监督管理局（SFDA）批准。
不同种类的待测菌药敏试验选择不同的抗菌药物，药敏纸片的选择见表7-1。
3．待测细菌接种普通营养琼脂经35℃16~18h的纯培养物。
4. 0.5%麦氏比浊管配制方法如下：0.048mol BaCl2 (1.17% W/V BaCl2 . 2H2O) 0.5ml0.18mol H2SO4 (1%, V/V) 99.5ml将二液置冰水浴中冷却后混合，置螺口试管中，放室温暗处保存。
用前混匀。
有效期为6个月。
5.其它：无菌生理盐水、无菌棉签、无菌试管、酒精灯、镊子、生物安全柜、培养箱等。
【实验内容】一、纸片扩散法（K-B法）药敏试验1．原理将含有定量的抗菌药物纸片贴在已接种待测细菌的琼脂平板表面，纸片上的药物随即溶于琼脂中，并沿纸片周围由高浓度向低浓度扩散，形成逐渐减少的梯度浓度。
在纸片周围，一定浓度的药物抑制了细菌的生长从而形成了透明的抑菌环，抑菌环的大小则反映了待测菌对该种药物的敏感程度。
K-B法是由Kirby - Bauer 建立，美国NCCLS推荐，目前为世界所公认的标准纸片扩散法（定性法）。
2．方法（1）培养基的准备：将无菌M-H琼脂加热融化，趁热倾注入无菌的直径90mm平皿中。
琼脂厚为4mm（约23~25ml培养基），琼脂凝固后塑料包装放4℃保存，在5日内用完，使用前应在37℃培养箱放置30min使表面干燥。
