细菌药敏试验及其耐药表型检测

第章细菌药敏试验及其耐药表型检测细菌药敏试验是临床细菌感染治疗中非常重要的检测手段，通过该技术可以检测不同抗生素对细菌的敏感性，进而为合理使用抗生素提供科学的依据。

然而，在临床应用过程中，随着抗生素不合理使用的增加，细菌耐药性也随之快速发展。

因此，针对不同耐药表型的检测越来越受到关注。

一、细菌药敏试验细菌药敏试验是一种用于判断细菌对不同抗生素敏感性的方法。

常见的细菌药敏试验方法包括纸片扩散法、E测试、革兰氏染色法、微量稀释法等。

其中纸片扩散法是最常用的一种方法，其原理是将待检细菌涂在琼脂平板上，然后在板上放置一些含有不同抗菌药物的试纸，细菌耐药性差的部分会被试纸上的抗生素杀灭，出现纯净孔（抑菌圈），通过抑菌圈的直径可以初步判断细菌对抗生素的敏感性或耐药性。

细菌药敏试验有很多应用价值，如能够帮助医生选择合适的抗生素治疗细菌感染，避免了不必要的抗生素使用，同时也可作为科研人员研究细菌抗药机制的工具，为抗菌药物的开发提供依据。

二、耐药表型检测随着细菌抗药性问题的不断加重，对不同耐药表型检测的需求也越来越迫切。

耐药表型是指细菌对特定抗生素的耐药情况。

由于不同的细菌及其不同的菌株对抗生素的敏感程度有所不同，因此抗菌药物在应用过程中会出现不同菌株对不同药物的耐药表型。

目前，针对不同耐药表型检测的方法主要有两种：基于分子生物学技术的方法和基于药敏试验的方法。

1. 基于分子生物学技术的方法基于分子生物学技术的方法是检测细菌耐药性最常用的方法之一。

该方法通过检测细菌中特定的基因或者基因片段，以此确定细菌耐药性的表型。

常见的基于分子生物学技术的方法包括PCR检测、基因芯片技术、实时荧光定量PCR等。

2. 基于药敏试验的方法基于药敏试验的方法是已经成熟的检测方法之一，其通过将药敏试验的结果与临床药物疗效相结合，进而确定细菌耐药性表型。

通过检测不同抗生素对不同菌株的敏感性，可以初步反映出细菌的耐药性状态。

当然，这种方法不仅涉及到耗时、耗材、人力等成本的问题，而且还受到试验条件、条件操作等方面的影响。

细菌耐药性检测方法1、细菌耐药表型检测：判断细菌对抗菌药物的耐药性可根据NCCLS标准，通过测量纸片扩散法、肉汤稀释法和E试验的抑菌圈直径、MIC值和IC值获得。

也可通过以下方法进行检测：（1）耐药筛选试验：以单一药物的单一浓度检测细菌的耐药性被称为耐药筛选试验，临床上常用于筛选耐甲氧西林葡萄球菌、万古霉素中介的葡萄球菌、耐万古霉素肠球菌及氨基糖苷类高水平耐药的肠球菌等。

(2)折点敏感试验：仅用特定的抗菌药物浓度（敏感、中介或耐药折点MIC)，而不使用测定MIC时所用的系列对倍稀释抗生素浓度测试细菌对抗菌药物的敏感性，称为折点敏感试验. （3）双纸片协同试验:双纸片协同试验是主要用于筛选产超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）革兰阴性杆菌的纸片琼脂扩散试验。

若指示药敏纸片在朝向阿莫西林/克拉维酸方向有抑菌圈扩大现象（协同），说明测试菌产生超广谱β—内酰胺酶（4)药敏试验的仪器化和自动化:全自动细菌鉴定及药敏分析仪如：Vitek—2、BD-Pheonix、Microscan等运用折点敏感试验的原理可半定量测定抗菌药物的MIC值。

2．β—内酰胺酶检测：主要有碘淀粉测定法（iodometric test）和头孢硝噻吩纸片法（nitrocefin test）.临床常用头孢硝噻吩纸片法，β—内酰胺酶试验可快速检测流感嗜血杆菌、淋病奈瑟菌、卡他莫拉菌和肠球菌对青霉素的耐药性。

如β—内酰胺酶阳性，表示上述细菌对青霉素、氨苄西林、阿莫西林耐药；表示葡萄球菌和肠球菌对青霉素(包括氨基、羧基和脲基青霉素)耐药。

3．耐药基因检测：临床可检测的耐药基因主要有：葡萄球菌与甲氧西林耐药有关的MecA 基因,大肠埃希菌与β-内酰胺类耐药有关的blaTEM、blaSHV、blaOXA基因，肠球菌与万古霉素耐药有关的vanA、vanB、vanC、vanD基因.检测抗菌药物耐药基因的方法主要有：PCR扩增、PCR-RFLP分析、PCR—SSCP 分析、PCR-线性探针分析、生物芯片技术、自动DNA测序4．特殊耐药菌检测（1）耐甲氧西林葡萄球菌检测：对1цg苯唑西林纸片的抑菌圈直径≤10㎜，或其MIC≥4цg/ml的金黄色葡萄球菌和对1цg苯唑西林纸片的抑菌圈直径≤17㎜，或MIC≥0。

实验七细菌的药敏试验及耐药性检测【目的和要求】1.掌握纸片扩散法（K-B法）、液体稀释法两种药敏试验的原理和方法。

2.熟悉上述两种药敏试验方法的应用。

3.了解几种细菌耐药表型检测的原理、方法及意义。

【试剂与器材】1．培养基：一般需氧和兼性厌氧菌采用水解酪蛋白（M-H）琼脂或M-H液体培养基（pH7.2~7.4）。

对于营养要求高的细菌，则需在M-H培养基中加入其它营养成分。

2．抗菌药物纸片：直径为6.0~6.35mm的滤纸片上，含有一定量的某种抗菌药物。

市场有售，但生产厂家须获得国家食品药品监督管理局（SFDA）批准。

不同种类的待测菌药敏试验选择不同的抗菌药物，药敏纸片的选择见表7-1。

3．待测细菌接种普通营养琼脂经35℃16~18h的纯培养物。

4. 0.5%麦氏比浊管配制方法如下：0.048mol BaCl2 (1.17% W/V BaCl2 . 2H2O) 0.5ml0.18mol H2SO4 (1%, V/V) 99.5ml将二液置冰水浴中冷却后混合，置螺口试管中，放室温暗处保存。

用前混匀。

有效期为6个月。

5.其它：无菌生理盐水、无菌棉签、无菌试管、酒精灯、镊子、生物安全柜、培养箱等。

【实验容】一、纸片扩散法（K-B法）药敏试验1．原理将含有定量的抗菌药物纸片贴在已接种待测细菌的琼脂平板表面，纸片上的药物随即溶于琼脂中，并沿纸片周围由高浓度向低浓度扩散，形成逐渐减少的梯度浓度。

在纸片周围，一定浓度的药物抑制了细菌的生长从而形成了透明的抑菌环，抑菌环的大小则反映了待测菌对该种药物的敏感程度。

K-B法是由Kirby - Bauer 建立，美国NCCLS推荐，目前为世界所公认的标准纸片扩散法（定性法）。

2．方法（1）培养基的准备：将无菌M-H琼脂加热融化，趁热倾注入无菌的直径90mm平皿中。

琼脂厚为4mm（约23~25ml培养基），琼脂凝固后塑料包装放4℃保存，在5日用完，使用前应在37℃培养箱放置30min使表面干燥。

实验七细菌的药敏试验及耐药性检测【目的和要求】1.掌握纸片扩散法（K-B法）、液体稀释法两种药敏试验的原理和方法。

2.熟悉上述两种药敏试验方法的应用。

3.了解几种细菌耐药表型检测的原理、方法及意义。

【试剂与器材】1．培养基：一般需氧和兼性厌氧菌采用水解酪蛋白（M-H）琼脂或M-H液体培养基（pH7.2~7.4）。

对于营养要求高的细菌，则需在M-H培养基中加入其它营养成分。

2．抗菌药物纸片：直径为6.0~6.35mm的滤纸片上，含有一定量的某种抗菌药物。

市场有售，但生产厂家须获得国家食品药品监督管理局（SFDA）批准。

不同种类的待测菌药敏试验选择不同的抗菌药物，药敏纸片的选择见表7-1。

3．待测细菌接种普通营养琼脂经35℃16~18h的纯培养物。

4. 0.5%麦氏比浊管配制方法如下：0.048mol BaCl2 (1.17% W/V BaCl2 . 2H2O) 0.5ml0.18mol H2SO4 (1%, V/V) 99.5ml将二液置冰水浴中冷却后混合，置螺口试管中，放室温暗处保存。

用前混匀。

有效期为6个月。

5.其它：无菌生理盐水、无菌棉签、无菌试管、酒精灯、镊子、生物安全柜、培养箱等。

【实验内容】一、纸片扩散法（K-B法）药敏试验1．原理将含有定量的抗菌药物纸片贴在已接种待测细菌的琼脂平板表面，纸片上的药物随即溶于琼脂中，并沿纸片周围由高浓度向低浓度扩散，形成逐渐减少的梯度浓度。

在纸片周围，一定浓度的药物抑制了细菌的生长从而形成了透明的抑菌环，抑菌环的大小则反映了待测菌对该种药物的敏感程度。

K-B法是由Kirby - Bauer 建立，美国NCCLS推荐，目前为世界所公认的标准纸片扩散法（定性法）。

2．方法（1）培养基的准备：将无菌M-H琼脂加热融化，趁热倾注入无菌的直径90mm平皿中。

琼脂厚为4mm（约23~25ml培养基），琼脂凝固后塑料包装放4℃保存，在5日内用完，使用前应在37℃培养箱放置30min使表面干燥。

细菌耐药性检测方法1、细菌耐药表型检测：判断细菌对抗菌药物的耐药性可根据NCCLS标准，通过测量纸片扩散法、肉汤稀释法和E试验的抑菌圈直径、MIC值和IC值获得。

也可通过以下方法进行检测：（1）耐药筛选试验：以单一药物的单一浓度检测细菌的耐药性被称为耐药筛选试验，临床上常用于筛选耐甲氧西林葡萄球菌、万古霉素中介的葡萄球菌、耐万古霉素肠球菌及氨基糖苷类高水平耐药的肠球菌等。

（2）折点敏感试验：仅用特定的抗菌药物浓度（敏感、中介或耐药折点MIC），而不使用测定MIC时所用的系列对倍稀释抗生素浓度测试细菌对抗菌药物的敏感性，称为折点敏感试验。

（3）双纸片协同试验：双纸片协同试验是主要用于筛选产超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）革兰阴性杆菌的纸片琼脂扩散试验。

若指示药敏纸片在朝向阿莫西林/克拉维酸方向有抑菌圈扩大现象（协同），说明测试菌产生超广谱β-内酰胺酶（4）药敏试验的仪器化和自动化：全自动细菌鉴定及药敏分析仪如：Vitek-2、BD-Pheonix、Microscan等运用折点敏感试验的原理可半定量测定抗菌药物的MIC值。

2．β-内酰胺酶检测：主要有碘淀粉测定法（iodometric test）和头孢硝噻吩纸片法（nitrocefin test）。

临床常用头孢硝噻吩纸片法，β-内酰胺酶试验可快速检测流感嗜血杆菌、淋病奈瑟菌、卡他莫拉菌和肠球菌对青霉素的耐药性。

如β-内酰胺酶阳性，表示上述细菌对青霉素、氨苄西林、阿莫西林耐药；表示葡萄球菌和肠球菌对青霉素（包括氨基、羧基和脲基青霉素）耐药。

3．耐药基因检测：临床可检测的耐药基因主要有：葡萄球菌与甲氧西林耐药有关的MecA 基因,大肠埃希菌与β-内酰胺类耐药有关的blaTEM、blaSHV、blaOXA基因，肠球菌与万古霉素耐药有关的vanA、vanB、vanC、vanD基因。

检测抗菌药物耐药基因的方法主要有：PCR扩增、PCR-RFLP分析、PCR-SSCP 分析、PCR-线性探针分析、生物芯片技术、自动DNA 测序4．特殊耐药菌检测（1）耐甲氧西林葡萄球菌检测：对 1цg苯唑西林纸片的抑菌圈直径≤10㎜，或其MIC≥4цg/ml的金黄色葡萄球菌和对1цg苯唑西林纸片的抑菌圈直径≤17㎜，或MIC≥0.5цg/ml 的凝固酶阴性葡萄球菌被称为耐甲氧西林葡萄球菌（MRS）。

药敏实验常见问题、常见耐药机制及耐药表型解读药物敏感性试验可以监测细菌对抗药物的敏感性，为临床合理用药、新药研究、监测耐药变迁、发现耐药机制等提供客观依据。

常见问题为什么临床微生物学实验室有时候出具的报告只有细菌名，而没有出具药敏结果？目前国内药敏报告主要参照CLSI M100标准出具药敏报告。

该标准只给出了临床常见细菌诸如肠杆菌科细菌、非发酵菌、葡萄球菌、肺炎链球菌、草绿色链球菌、某些厌氧菌的判读标准。

若鉴定细菌不在该文件范围内，则无法给出药敏结果。

如单核细胞增生李斯特菌、诺卡菌、布鲁菌等特殊细菌，需要特殊的培养基或培养条件，而许多实验室不具备这些条件，因此只能出具细菌名。

尽管只有细菌名称，但对临床抗感染治疗依然具有指导意义。

在条件允许的情况下，检验人员可以尽可能多地向临床提供该菌相关的知识，如该菌的染色性质（革兰阳性还是阴性）、球菌还是杆菌、药敏情况等。

如何解释部分抗菌药物体外敏感试验的药物种类与临床实际使用抗菌药物种类不一致？抗菌药物体外敏感试验中，由某一药物的药敏结果可以“预测”或“指示”其他药物敏感或耐药的药物。

若存在这种预测药或指示药，则无须加做药敏试验。

临床需要掌握相关专业知识，实验室需向临床解释结果。

表1 药敏试验常用试验药物及代表药物如何解释抗菌药物在体外敏感试验显示敏感，临床治疗却无效？常见原因如下：①分离株如果是定植菌、污染菌，则无须抗菌药物治疗。

治疗无效是正常情况。

②患者免疫力、基础性疾病不改善，临床治疗常无效。

③如果有感染灶未发现或未予清除，单纯的抗菌药物治疗可能无效。

④实验室结果应准确无误。

如果耐药错误判断为敏感，则治疗无效。

⑤“90~60规则”提示，有10%的患者敏感时治疗无效。

如果临床统计结果与该规则比较一致，则应该视为正常情况。

⑥药敏试验适用于浮游菌感染。

如果是生物膜感染，则药敏试验不适用。

⑦药物使用要符合说明书剂量，与CLSI M100等文件剂量一致或更高。

低于CLSI M100等文件的剂量建议，则敏感可能无效。

细菌耐药性检测方法1、细菌耐药表型检测：判断细菌对抗菌药物的耐药性可根据NCCLS标准，通过测量纸片扩散法、肉汤稀释法和E试验的抑菌圈直径、MIC值和IC值获得。

也可通过以下方法进行检测：（1）耐药筛选试验：以单一药物的单一浓度检测细菌的耐药性被称为耐药筛选试验，临床上常用于筛选耐甲氧西林葡萄球菌、万古霉素中介的葡萄球菌、耐万古霉素肠球菌及氨基糖苷类高水平耐药的肠球菌等。

（2）折点敏感试验：仅用特定的抗菌药物浓度（敏感、中介或耐药折点MIC），而不使用测定MIC时所用的系列对倍稀释抗生素浓度测试细菌对抗菌药物的敏感性，称为折点敏感试验。

（3）双纸片协同试验：双纸片协同试验是主要用于筛选产超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）革兰阴性杆菌的纸片琼脂扩散试验。

若指示药敏纸片在朝向阿莫西林/克拉维酸方向有抑菌圈扩大现象（协同），说明测试菌产生超广谱β-内酰胺酶（4）药敏试验的仪器化和自动化：全自动细菌鉴定及药敏分析仪如：Vitek-2、BD-Pheonix、Microscan等运用折点敏感试验的原理可半定量测定抗菌药物的MIC值。

2．β-内酰胺酶检测：主要有碘淀粉测定法（iodometric test）和头孢硝噻吩纸片法（nitrocefin test）。

临床常用头孢硝噻吩纸片法，β-内酰胺酶试验可快速检测流感嗜血杆菌、淋病奈瑟菌、卡他莫拉菌和肠球菌对青霉素的耐药性。

如β-内酰胺酶阳性，表示上述细菌对青霉素、氨苄西林、阿莫西林耐药；表示葡萄球菌和肠球菌对青霉素（包括氨基、羧基和脲基青霉素）耐药。

3．耐药基因检测：临床可检测的耐药基因主要有：葡萄球菌与甲氧西林耐药有关的MecA 基因,大肠埃希菌与β-内酰胺类耐药有关的blaTEM、blaSHV、blaOXA基因，肠球菌与万古霉素耐药有关的vanA、vanB、vanC、vanD基因。

检测抗菌药物耐药基因的方法主要有：PCR扩增、PCR-RFLP分析、PCR-SSCP 分析、PCR-线性探针分析、生物芯片技术、自动DNA测序4．特殊耐药菌检测（1）耐甲氧西林葡萄球菌检测：对1цg苯唑西林纸片的抑菌圈直径≤10㎜，或其MIC≥4цg/ml的金黄色葡萄球菌和对1цg苯唑西林纸片的抑菌圈直径≤17㎜，或MIC≥0.5цg/ml 的凝固酶阴性葡萄球菌被称为耐甲氧西林葡萄球菌（MRS）。