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Zeiss LSM 780 激光扫描共聚焦显微镜光路设置和不同扫描模式的使用作者：李华丽来源：《科技创新与应用》2015年第27期摘要：对于使用激光扫描共聚焦显微镜的研究者来说，实验设计、样品准备、仪器操作和后期图片处理是一个实验至关重要的四步，前两步是任何一个研究者都必须具备的能力，否则无从谈起上机实验，后期图片处理无非就是修饰润色使图片从视觉上更美观，而对大多数从事生物学医学领域的研究者来说，仪器的操作可能是最关键的一步，而仪器操作中光路的设置和不同扫描模式的选择可能是最难掌握和最难学习的模块，因为这部分可能涉及一些物理光谱学的知识。
文章就以自己实验室Zeiss LSM 780激光扫描共聚焦显微镜为例，简要介绍其三种光路设置和五种不同扫描模式如何选择使用，希望对使用者有所帮助。
关键词：激光扫描共聚焦显微镜；光路设置；扫描模式引言随着现代科学技术的飞速发展，各种荧光蛋白、荧光染料和精密光学元件不断出现[1-5]，激光扫描共聚焦显微镜技术得到了极大的发展，各种公司，各种型号的共聚焦系统不间断问世或完善，广泛应用在细胞生物学医学领域[6-8]。
广泛的应用使得这一设计精密又操作复杂的仪器必须让有需要的研究者方便学习和掌握。
就以蔡司公司为例，科学技术的发展和适应市场的需要，不同型号的共聚焦系统逐步上市和使用，LSM 510、510 Meta、700、710、780等在硬件技术提高的同时，操作软件也在一步步简化。
文章以华南农业大学亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室的一台超高灵敏度检测Zeiss LSM 780系统为例，介绍其光路设置和不同扫描模式的选择，因为它是目前蔡司公司推出的上述普通激光扫描共聚焦显微镜中型号最高的一款，它的光路设置和扫描模式的配置将集上述所有型号系统的内置设置于一身，希望能给实验者提供较全面的指导。
1 Zeiss LSM 780 激光扫描共聚焦显微镜三种光路设置（1）最“傻瓜式”一键操作：Zeiss LSM 780使用Zen 2011软件，软件操作界面有一个Resue按钮。
Zeiss 激光扫描共聚焦显微镜操作手册目录：1 系统的组成系统组成及光路示意图实物照片说明2 系统的使用2.1 开机顺序2.2 软件的快速使用说明2.3 显微镜的触摸屏控制2.4 关机顺序3 系统的维护1 系统的组成激光扫描共聚焦显微镜系统主要由：电动荧光显微镜、扫描检测单元、激光器、电脑工作站及各相关附件组成。
系统组成及光路示意图：电脑工作站激光器电动荧光显微镜扫描检测单元实物照片说明：电动荧光显微镜扫描检测单元CO2 培养系统控制器激光器电脑工作站2 系统的使用2.1 开机顺序（1）打开稳压电源（绿色按钮）等待2 分钟（电压稳定）后，再开其它开关（2）主开关[ MAIN SWITCH ]“ON”电脑系统[ SYSTEMS/PC ]“ON”扫描硬件系统[ COMPONENTS ]“ON”（3）打开[ 电动显微镜开关]打开[ 荧光灯开关]（注：具有5 档光强调节旋钮）（4）Ar 离子激光器主开关“ON”顺时针旋转钥匙至“—”预热等待约15分钟，将激光器[ 扳钮] 由“Standby”扳至“Laser run”状态，即可正常使用（5）打开[ 电脑开关]，进入操作系统注：键盘上也具有[ 电脑开关]2.2 软件的快速使用说明（1）电脑开机进入操作系统界面后，双击桌面共聚焦软件ZEN 图标（2）进入ZEN 界面，弹出对话框：“Start System”——初始化整个系统，用于激光扫描取图、分析等。
“Image Processing”——不启动共聚焦扫描硬件，用于已存图像数据的处理、分析。
（3）软件界面：1 功能界面切换：扫描取图（Acquisition）、图像处理（Processing）、维护（Maintain）（注：Maintain仅供Zeiss专业工程师使用）2 动作按钮；3 工具组（多维扫描控制）；4 工具详细界面；5 状态栏；6 视窗切换按钮；7 图像切换按钮；8 图像浏览/预扫描窗口；9 文档浏览/处理区域；10 视窗中图像处理模块动作按钮：Single ——扫描单张图片、并在图像预览窗口显示。
蔡司共聚焦显微镜安全操作及保养规程前言蔡司共聚焦显微镜是一种高分辨率成像设备，广泛应用于生命科学、物质科学等领域。
为保障设备安全、延长设备使用寿命，特制定本文档，介绍该设备的安全操作及保养规程。
安全操作规程1.在操作前，应查询设备的使用说明书，并全面了解设备的性能及操作方法。
2.在使用前，应先检查设备是否正常，确保仪器各部件安装牢固、电线不松动，各部件动作正常。
3.严禁将化学试剂或其他腐蚀性物质放入显微镜中，以免损坏设备。
4.操作中应遵循“先关灯后关机，先开机后开灯”的原则，确保设备正常开启或关闭。
5.切勿使用过大或过小的力量操作显微镜，以免影响设备寿命。
6.当设备因异常情况需要紧急停机时，应使用急停开关，切勿使用电源开关，避免损坏设备。
7.在设备开启状态下，切勿随意更换设备配件或涉及设备内部维修，如有异常情况应立即向厂商或专业技术人员求助。
保养规程1.在设备正常使用期间，应加强对设备的保养和维护，保持设备的清洁和干燥。
2.设备需要接通电源时，在保证电压稳定的情况下，应使用稳定的电源并加装过电压保护装置，避免对设备产生损害。
3.在操作前，应对设备进行彻底清洁，清洁过程中不得直接将水或清洁剂倒在设备上或对设备产生损害的部位。
4.在清洗设备时，应用干燥软布或软毛刷进行擦拭，切勿使用含有酸碱成分的清洁剂或物品，以免对设备产生腐蚀或损害设备表面。
5.在清洗设备表面时，不得将清洁剂或水进入仪器内部，以免对设备产生损害。
6.镜头是设备中最为重要的部分，应特别注意保养，如镜头脱落、变形、磨损或压伤等情况，应及时向专业技术人员进行维修和更换。
7.设备长时间不用时，应及时切断电源并将设备置于安全干燥的地方，保护好设备的各部件，避免设备长时间不用而导致的性能损害。
结语蔡司共聚焦显微镜是一种高精度设备，安装、操作及保养过程中需要严格遵守规程，避免对设备产生不必要的损害。
在设备的日常使用和保养过程中，我们应该掌握正确的操作和保养方法，保证设备在长期使用中保持良好的性能状态。
共聚焦显微镜操作入门指南(仅供内部使用)文档作者：李宇(liyu@) 日期：2012-12-04文档校对：李宇日期：2012-12-04卡尔蔡司中国版权所有不得复制目录1开机 (1)1 .1接通总电源 (1)1 .2打开激光器 (1)1 .3打开控制器、主控电脑 (1)2使用激光共聚焦扫描软件Zen 2010 (2)2 .1打开软件 (2)2 .2切换到明场观察模式（目镜筒） (2)2 .3放入样品并在明场模式下找到焦平面 (3)2 .4切换到共聚焦扫描模式 (6)2 .5设置激光扫描参数，找到样品最亮的焦平面位置 (6)2 .6设置Z-stack扫描上下限 (8)2 .7开始扫描 (10)2 .8分析扫描结果，进行三维观测 (11)3关机 (15)4附：目镜中，使用明场、暗场和偏光模式观察样品 (16)4 .1明场模式 (16)4 .2暗场模式 (17)4 .3偏光模式 (17)5附：使用相机（CCD）拍摄明场、暗场和偏光图 (18)5 .1拍摄明场图 (18)5 .2拍摄暗场图 (19)5 .3拍摄偏光图 (19)1 开机1 .1接通总电源图 1 从左至右依次为：墙体总电源、稳压器电源、激光器和电脑电源1 .2打开激光器图 2 转动激光器钥匙，打开激光器，LED指示灯亮1 .3打开控制器、主控电脑图 3 依次打开左图显微镜主机控制器电源、右图电脑主机电源提示：当仅使用CCD拍图，或者长时间不用机器时，建议关闭激光器，以延长其寿命。
2 使用激光共聚焦扫描软件Zen 20102 .1打开软件双击图标，然后点击“Start System ”进入软件。
2 .2切换到明场观察模式（目镜筒）2 .2.1 在共聚焦软件中切换为明场观察模式：点击“Locate ”标签，选择“Online ”，点击“BF ”（Bright Field 的缩写）。
此时系统打开卤素灯，并将明场光学模块转入光路。
图 4 切换为明场观察模式提示：如果出现硬件通讯问题，软件左下角会弹出信息对话框，此时一般的解决方法是：1）重启Zen 软件；2）如果仍无效，关闭整个系统，过5分钟后再重启系统。
蔡司显微镜常见故障分析显微镜技术指标德国蔡司(ZEISS)做为显微镜的鼻祖——国际标准的缔造者160年来一直处于光学领域领导地位，而其它显微镜厂家一直追赶和效仿蔡司，但关键技术没有学到,使得产品不够完善，在使用过程中不可避免地出现一些故障，从而影响用户的正常工作。
现就一些常见故障解析如下：1、显微镜使用一段时间图像质量下降，关机一段时间再打开图像质量就会明显好转。
诊断：镜头镀膜技术不过关，长时间使用镜头受热后镀膜发散导致。
2、手动调焦时图像清晰，松手后图像模糊。
诊断：调焦机构老化。
3、目镜观察时图像清晰，但采集到的图像却不清晰。
把采集到的图像调整清晰时, 目镜里观察图像又不清晰了。
诊断：系统齐焦性不够，观察和采集不能同步。
4、载物台下滑、平移。
诊断：载物台锁定机构采用星型齿轮，长时间使用稳定性降低。
5、图像中间清晰边缘模糊。
诊断：球差校正不完善。
生物显微镜的使用方法与步骤一、取镜和安放1.右手握住镜臂，左手托住镜座。
2.把显微镜放在实验台上，略偏左(显微镜放在距实验台边缘7厘米左右处)。
安装好目镜和物镜。
二、对光3.转动转换器，使低倍物镜对准通光孔(物镜的前端与载物台要保持2厘米的距离)。
4.把一个较大的光圈对准通光孔。
左眼注视目镜内(右眼睁开，便于以后同时画图)。
转动反光镜，使光线通过通光孔反射到镜筒内。
通过目镜，可以看到白亮的视野。
三、观察5.把所要观察的玻片标本(也可以用印有“6”字的薄纸片制成)放在载物台上，用压片夹压住，标本要正对通光孔的中心。
6.转动粗准焦螺旋，使镜筒缓缓下降，直到物镜接近玻片标本为止(眼睛看着物镜，以免物镜碰到玻片标本)。
7.左眼向目镜内看，同时反方向转动粗准焦螺旋，使镜筒缓缓上升，直到看清物像为止。
再略微转动细准焦螺旋，使看到的物像更加清晰。
8.高倍物镜的使用：使用高倍物镜之前，必须先用低倍物镜找到观察的物象，并调到视野的正中央，然后转动转换器再换高倍镜。
换用高倍镜后，视野内亮度变暗，因此一般选用较大的光圈并使用反光镜的凹面，然后调节细准焦螺旋。
Zeiss LSM 780 激光扫描共聚焦显微镜光路设置和不同扫描模式的使用对于使用激光扫描共聚焦显微镜的研究者来说，实验设计、样品准备、仪器操作和后期图片处理是一个实验至关重要的四步，前两步是任何一个研究者都必须具备的能力，否则无从谈起上机实验，后期图片处理无非就是修饰润色使图片从视觉上更美观，而对大多数从事生物学医学领域的研究者来说，仪器的操作可能是最关键的一步，而仪器操作中光路的设置和不同扫描模式的选择可能是最难掌握和最难学习的模块，因为这部分可能涉及一些物理光谱学的知识。
文章就以自己实验室Zeiss LSM 780激光扫描共聚焦显微镜为例，简要介绍其三种光路设置和五种不同扫描模式如何选择使用，希望对使用者有所帮助。
标签：激光扫描共聚焦显微镜；光路设置；扫描模式引言随着现代科学技术的飞速发展，各种荧光蛋白、荧光染料和精密光学元件不断出现[1-5]，激光扫描共聚焦显微镜技术得到了极大的发展，各种公司，各种型号的共聚焦系统不间断问世或完善，广泛应用在细胞生物学医学领域[6-8]。
广泛的应用使得这一设计精密又操作复杂的仪器必须让有需要的研究者方便学习和掌握。
就以蔡司公司为例，科学技术的发展和适应市场的需要，不同型号的共聚焦系统逐步上市和使用，LSM 510、510 Meta、700、710、780等在硬件技术提高的同时，操作软件也在一步步简化。
文章以华南农业大学亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室的一台超高灵敏度检测Zeiss LSM 780系统为例，介绍其光路设置和不同扫描模式的选择，因为它是目前蔡司公司推出的上述普通激光扫描共聚焦显微镜中型号最高的一款，它的光路设置和扫描模式的配置将集上述所有型号系统的内置设置于一身，希望能给实验者提供较全面的指导。
1 Zeiss LSM 780 激光扫描共聚焦显微镜三种光路设置（1）最“傻瓜式”一键操作：Zeiss LSM 780使用Zen 2011软件，软件操作界面有一个Resue按钮。
蔡司LSM900共聚焦显微镜的成
像原理
蔡司LSM900共聚焦显微镜的成像原理
共聚焦显微镜是指利用共聚焦显微成像技术（Confocal microscopy）作为技术基础，应用光学手段进行成像的一种光学显微镜。
共聚焦显微成像技术是一种利用逐点照明和空间针孔调制来去除样品非焦点平面的散射光的光学成像手段，相比于传统成像方法可以提高光学分辨率和视觉对比度。
共聚焦显微镜是一种利用逐点照明和空间针孔调至来去除样品非焦点平面的散射光成像技术的显微镜，是拥有高对比度和高分辨率的专业级显微镜。
常用语细胞及生物荧光样品观察分析；绿荧光蛋白分析；荧光复位杂交分析；光切片扫描以及
3D图像处理等应用中。
蔡司LSM900共聚焦显微镜的成像原理主要用于生物领域，共聚焦成像也被称为细胞CT。
能够获得焦平面细胞内一个层面的细胞图像，因无其它层面信号的干扰，能获得非常清晰的细胞图像。
共聚焦成像经过多年发张，如超分辨技术具有多种一样的实现方式相同，有多种方式能够实现共聚焦，不同的成像方式之间特点互补。
共焦成像是利用激光点扫描共焦成像的原理，即通过单个激光点激发样品中的荧光获得荧光信号，通过针孔屏蔽非焦平面信息，从而获得单片细胞图像。
在转盘可以聚焦的成像原理上，激光或普通激发光通过转盘变成多个激发点，转盘的旋转使激发光扫描整个样品，得到的荧光通过转盘的针孔去除非焦点细胞图像。
更多信息请咨询北京瑞科钟毅科技相关人员。
Axio CSM 700真实色共聚焦显微镜非接触式三维测量显微镜系统介绍:Axio CSM 700真实色共聚焦显微镜以共聚焦光学为基本原理，使用高速线扫描为成像方法，并采用氙灯为真实色光源，是一款能够快速提供工业零部件表面彩色三维轮廓，并且完全不接触测试样品的仪器设备。
它具有三大“独门绝技”：共聚焦、线扫描、白光源。
由于采用了共聚焦成像原理，Axio CSM 700将传统光学分辨率提高1.4倍，其XY方向线分辨率达到160 nm。
同时，在充分利用共聚焦能提供高度信息的基础上，Axio CSM 700配备了精度高、重复性好的Z轴自动步进装置，最小步进精度达到10nm，这使得高度上亚微米，甚至纳米尺度的非接触式精确测量成为可能。
传统共聚焦采用点扫描成像，速度较慢；而Axio CSM 700采用线扫描，成像速度大大提高，最快的WF模式扫描速度超过100幅/秒，可以说瞬间即可得到测量结果，大大提高工作效率。
同时，Axio CSM 700使用白色光源，能够展现被测试样表面的真实颜色，从而将传统黑白共聚焦扫描显微镜拓展到更广阔的应用领域。
图1 实验室系统分部图线扫描共聚焦成像原理12534图2 显微镜光路图氙灯照明器1发出的白光经过线性照明器2变成一组线光源，该组线光源随着2的精确移动从而实现在XY方向的线扫描。
扫描光束经过半反半透分光镜3，然后到达物镜最终到达样品表面4，携带样品表面高度信息的光束从样品表面4反射，经过分光镜3以及聚焦棱镜最后到达线性探测器5，该线性探测器5通过与线性照明器2的精确同步，实现仅对焦平面光线的探测，也就是满足共聚焦基本原理的探测。
最后，通过精密Z轴自动步进装置移动样品4，得到样品表面不同高度位置的一系列聚焦图像，计算机系统计算得到样品表面三维形貌。
参数指标共聚焦扫描分辨率1280 x 1024 像素水平方向（XY）线分辨率160nm高度方向（Z）精度最小Z步进精度10nmXY测量可重复性（3σ）0.01μm高度测量可重复性（σ）0.02μm高度测量范围最大可达15mm，最小0.02μm最大样品高度63mm最大放大倍数67500x （150x物镜、16x数码放大条件下）光源氙灯，波长400-700nm共聚焦扫描速度7.5fps（高速彩色模式）；>100fps（WF模式）减震装置机架缺省配置减震装置可测量得到参数2D: 长度，面积，面积比，直径，周长，形貌，角度，图像校正等。
The second exhibition of Carl Zeiss confocal laserscanning microscopeConfocal MicroscopyDr. Matthias Vaupel,Carl Zeiss MicroImaging GmbH,Göttingen, GermanyLSM 700Confocal Principledetectorpinholelenssample beamsplitterlaser mirrorsxyzfocus Main differences in comparison toclassical light & video microscopy:1) Illumination source:Laser instead of lamp2) Image acquisition:Sequential scanning of the samplewith a laser beam 3) 3D Microscopy:Height information by opticalslicingLSM 7003D Imaging: SolarSolar panel laser scribeThe confocal microscopes LSM 700 and CSM 700 –What are they good for?3D microstructure analysis, e. g.z-height propfilexyz-distances and angles intopographyroughnessthin transparent film thicknessvolume parametersbearing area curve, amplitudedensity functionImage processing and analysisReportingMaterials:Soft matter, i.e. polymersMetalPaperGlassSpecifications CSM 700Height measurement:repeatability(1σ) 0.020 μm16-bit resolution in heightHeight measurement15 mm maximum rangeMaximum sample height63 mmLateral measurement:resolution0.160 μmImage pixel resolution1280 x 1024 pixelsIllumination Xenon-Lamp(wavelength range: 400 to 700 nm)Acquisition speed7.5 fps(High-speed) ...100 fps(Wire-frame mode) Color depth3 x 8 bit(RGB)USPs and Top Features of CSM 700USPs:Confocal images in true color-> topo& colored texture (all in focus image) in just 1 step! High-speed-mode 7.5 fps (< 30 sec) at 1280 x 1024 pixelsZeiss objectives give highest Zeiss optical performanceTops:Complete Software packet, incl. Image Processing, Macro Programming, Image Stitching, ReportingFilm thickness measurementAvailable with motorized stage for scanning and stitching of large imagesSpecifications: LSM 700 on AxioScope orAxioImagerHeight measurement:repeatability0.020 μm with closed-loop-detector(Heidenhain-detector) and Axio Imager, 0.080 µm on Axio Scope mot16-bit resolution in heightHeight measurement appr. 15 mm maximum rangeMaximum sample height63 mm with Axio Imager2Lateral measurement:resolution0.120 μmImage pixel resolution4 x 1 ...2048 x 2048 pixelsrepeatability0.010 μmzoom 1x (40x)Acquisition speed5 fps(at 512 x 512 pixels, 154 fps at 512 x 16 pixels)Illumination Laser, 405 nm typical for material applicationsUSPs and Top Features of LSM 700USPs:Additional contrasting methodes: Darkfield, Pol., C-DIC, TICFluorescence: e.g. for porosity measurement and for profilometry with unlimited surface slope due to auto-fluorescence detectionZeiss objectives give highest optical performancespectral imaging of light emitted from the sampleTops:Zoom, high pixel number, and high lateral resolutionFilm thickness measurementAvailable with motorized stage for scanning and stitching of large imagesComplete Software packet, incl. Image Processing, Macro Programming, Image Stitching Additional application tools available via AxioVision: Automatic Analysis of Grains, and of nonmetallic inclusions in steelDefine the no. of slices or slice distance or set according toZXtilted surface in original z-image plane surface after automatic z-levellingstep-height of small structures (e.g. stripes) is conserved with z-levellingArtefact-free z-stack record in a field of view with strong contrastProblem:Sample surface areas with very lowand high reflectivity in the same field of viewSolutions:Change NA via objectiveApply F/Z Noise Cut or “Fill Holes”filter and interpolate incorrect pixels Record several z-stacks with different exposure time/gain factor/lightintensity Possible reasons:scattered light due to roughnesslateral inhomogeneous material distribution surface slope angle is larger than half of the acceptance angle of the objectiveOvercome the theoretical diffraction limitation of surface tilt angle by fluorescenceFluorescence ModePolymer Foil in Orthogonal Projections (Epiplan-Neofluar 50x/0.8)x Reflection Modeyz zλ= 543 nmProfilometry with unlimited surface slope due to auto-fluorescence detectiondisplays removedfrom the height map to profiles and 3D visualisationHeight mapProfile3D ViewRoughness and Waviness –a practical examplewaviness of the road:average height differencealong the road, typicallymeasured on the km-distance scaleroughness of the road:average grain size of theasphalt, typically measuredon the mm-scale©Vaupel©Vaupeluninspiring andambitious formulasahead()∫=l sk dx x z l R 031()∫=l q dx x z l R 021()∫=lku dx x z l R 041()∫=l a dx x z l R 01asphalt, typically measuredRoughness and waviness –Fourier FilteringPrimary profile:P(Section Curve)Roughness:RWaviness:WMeasurement items for roughness curves –Examplelubricant reservoirshigh friction and wear quicklyMeasurement items for roughness curves –BAC: Bearing Area Curve (Load Curve)Curve of the load length ratio of the roughness curve expressed as a function of cutting level cused for QC of steel productionOnly available in ZEN and CSM-Software !Roughness in ZEN 2009Roughness –StandardsThe definitions of roughness parameters are from DIN 4287Profiles2D standards exist only for tactile instruments.In those standards are described:- 1. Type of sensor (tip diameter, material)- 2. Type of acquisition (scan length)- 3. Type of processing (filter, cut-off wavelength)-Standards don‘t exist for optical instruments.Topographies3D standards neither exist for tactile nor for optical methods.Tactile and optical confocal scanning –in Comparison。
