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![乙酰胆碱酯酶生物传感器的制备以及对有机磷的检测应用[发明专利]](https://img.taocdn.com/s1/m/1e9c96245e0e7cd184254b35eefdc8d376ee1490.png)
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910403325.7(22)申请日 2019.05.15(71)申请人 贵州大学地址 550025 贵州省贵阳市花溪区贵州大学花溪北校区科技处(72)发明人 李升 曲立梅 (74)专利代理机构 贵阳中新专利商标事务所52100代理人 刘艳(51)Int.Cl.G01N 27/30(2006.01)G01N 27/327(2006.01)G01N 27/48(2006.01)(54)发明名称乙酰胆碱酯酶生物传感器的制备以及对有机磷的检测应用(57)摘要本发明通过合成铜纳米线。
将铜纳米线与rGO -TEPA进行混合，修饰到玻碳电极上，室温干燥之后，再将乙酰胆碱酯酶与壳聚糖戊二醛混合物修饰到电极上，放在冰箱孵育直至其干燥，构建乙酰胆碱酯酶-壳聚糖-戊二醛/还原性氧化石墨烯-四乙烯五胺-铜纳米线/玻碳电极(AChE -CS/rGO -TEPA -Cu NWs/GCE)生物传感器。
本发明利用有机磷对乙酰胆碱酯酶的抑制作用构建了一种用于有机磷检测的电化学生物传感器。
简单方便并且具有灵敏度高等优点，为有机磷的检测技术开拓了新的空间。
权利要求书1页 说明书3页 附图5页CN 110031521 A 2019.07.19C N 110031521A1.一种乙酰胆碱酯酶生物传感器，其特征在于：所述的生物传感器是在玻碳电极表面依次负载铜纳米线-rGO -TEPA和乙酰胆碱酯酶-壳聚糖-戊二醛混合物。
2.如权利要求1所述的一种乙酰胆碱酯酶生物传感器的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)化学还原合成法制备铜纳米线；(2)将步骤(1)中所制得的铜纳米线与rGO -TEPA进行物理混合并超声处理得到均匀的混合液；(3)将步骤(2)中所制得的铜纳米线与rGO -TEPA的混合液滴加于玻碳电极表面，外面修饰乙酰胆碱酯酶混合液，置于4℃冰箱中孵育至电极干燥，即得到AChE -CS/rGO -TEPA -Cu NWs/GCE乙酰胆碱酯酶生物传感器。
![一种检测有机磷农药的电化学酶生物传感器、制备方法及应用[发明专利]](https://img.taocdn.com/s1/m/6e1510ab690203d8ce2f0066f5335a8103d26645.png)
专利名称：一种检测有机磷农药的电化学酶生物传感器、制备方法及应用
专利类型：发明专利
发明人：王雪,杨爽,单佳佳,白旭婷
申请号：CN202210063399.2
申请日：20220120
公开号：CN114487044A
公开日：
20220513
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明提供一种检测有机磷农药的电化学酶生物传感器、制备方法及应用，属于电化学分析领域。
所述电化学酶生物传感器是由共价有机框架/多壁碳纳米管复合材料与乙酰胆碱酯酶依次修饰在玻碳电极表面制备而成，其中共价有机框架/多壁碳纳米管复合材料以多壁碳纳米管为载体，在载体表面形成共价有机框架材料。
采用三电极体系，即参比电极为银/氯化银电极，对电极为铂丝电极，工作电极由共价有机框架/多壁碳纳米管复合材料和乙酰胆碱酯酶依次修饰在玻碳电极表面组成，采用差分脉冲伏安法对马拉硫磷进行检测。
本发明构建的电化学酶生物传感器具有灵敏度高、制备方法简单、选择性高等优点，在有机磷农药残留的检测领域有很好的应用前景及价值。
申请人：大连理工大学
地址：124221 辽宁省盘锦市辽东湾新区大工路2号
国籍：CN
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《ZnO及ZnO-石墨烯复合材料气敏性能研究》篇一ZnO及ZnO-石墨烯复合材料气敏性能研究摘要：本文重点研究了氧化锌（ZnO）及其与石墨烯复合材料的气敏性能。
通过制备不同比例的ZnO/石墨烯复合材料，分析其气敏传感性能的优化过程及原理。
本论文的研究旨在揭示ZnO基复合材料在气体传感领域的应用潜力，为未来气敏传感器件的研发提供理论依据。
一、引言随着科技的不断发展，气体传感器在环境监测、工业安全和智能生活等领域得到了广泛应用。
其中，ZnO因其良好的物理化学性质，被广泛应用于气敏传感器件中。
然而，单纯的ZnO气敏传感器仍存在响应速度慢、灵敏度低等缺点。
因此，将ZnO与具有高导电性的石墨烯材料复合，以提高其气敏性能成为研究热点。
二、材料制备与表征1. 材料制备本实验采用溶胶-凝胶法结合热处理工艺制备了不同比例的ZnO/石墨烯复合材料。
通过调整石墨烯的掺杂比例，获得了不同组分的复合材料。
2. 材料表征利用X射线衍射（XRD）、扫描电子显微镜（SEM）和拉曼光谱等手段对所制备的ZnO及ZnO/石墨烯复合材料进行表征，分析其晶体结构、形貌和成分。
三、气敏性能测试1. 测试方法采用静态配气法对所制备的ZnO及ZnO/石墨烯复合材料进行气敏性能测试。
在室温下，向测试腔中注入不同浓度的目标气体（如乙醇、甲醛等），记录传感器件的电阻变化。
2. 测试结果与分析实验结果表明，ZnO/石墨烯复合材料的气敏性能明显优于纯ZnO。
随着石墨烯掺杂比例的增加，复合材料的响应速度和灵敏度均有所提高。
此外，复合材料还表现出良好的选择性和稳定性。
四、气敏性能优化原理1. 石墨烯的作用石墨烯的高导电性和大比表面积有助于提高ZnO基复合材料的气敏性能。
石墨烯的掺杂能够增强材料的电子传输能力，提高传感器件的响应速度。
同时，石墨烯的引入增大了材料的比表面积，有利于气体分子的吸附和脱附。
2. 晶体结构与气敏性能的关系ZnO的晶体结构对其气敏性能具有重要影响。
基于rGO-AuNPS修饰丝网印刷电极的电化学生物传感器快
速检测甲基对硫磷
耿俊豪;李雪芝;周建平;陈昌华
【期刊名称】《食品与机械》
【年(卷),期】2024(40)1
【摘要】目的:实现对甲基对硫磷的快速检测。
方法:基于金纳米颗粒和还原氧化石墨烯制备了用于对甲基对硫磷进行定量检测的乙酰胆碱酯酶传感器。
采用层层组装方法,将还原氧化石墨烯、金纳米颗粒、乙酰胆碱酯酶依次修饰在丝网印刷电极表面。
对传感器的催化活性、阻抗特性、传感器的抑制率与甲基对硫磷浓度的关系、实际样品检测进行了评估。
结果:制备的乙酰胆碱酯酶生物传感器对乙酰硫代胆碱氯化物表现出优异的亲和力,米氏常数为2.76 mmol/L。
在最佳条件下,可以有效检测甲基对硫磷,线性范围为5~500 ng/mL,检出限为0.692 ng/mL。
结论:该方法操作简单、成本低、稳定性好,适用于有机磷类农药的快速检测。
【总页数】8页(P47-54)
【作者】耿俊豪;李雪芝;周建平;陈昌华
【作者单位】新疆大学智能制造现代产业学院
【正文语种】中文
【中图分类】TP2
【相关文献】
1.基于纳米金修饰丝网印刷电极的乙醇生物传感器
2.基于聚谷氨酸修饰玻碳电极的甲基对硫磷电化学传感器
3.副溶血弧菌CHY5-M1M噬菌体的分离鉴定及生物学特性分析
4.基于复合纳米微粒修饰丝网印刷电极的对乙酰氨基酚检测用电化学生物传感器
5.基于铂修饰丝网印刷电极检测土壤中铵态氮的电化学传感器
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基于复合纳米材料-离子液体的新型乙酰胆碱酯酶生物传感器的研制并用于有机磷农药的检测的综述1 引言目前食品安全是全社会广泛关注的焦点问题。
近几年，虽然国内外不断加大对食品安全监管的力度，但“从农田到餐桌”的食品产业链条依然危机四伏，不断通过各种媒体进入公众视野的如“瘦肉精”猪肉中毒事件、“劣质奶粉事件”、“苏丹红事件”、“多宝鱼”、“二噁英”、“农药残留”等事件，使民众对食品安全忧心忡忡。
在原料农、牧产品的生产中，大量不合理的使用兽药、化肥、激素，使农业及农村环境污染日益加剧，大量有毒有害物质附着沉淀在农（畜）产品中，如水果、蔬菜中的有机磷、有机氯农药的残留，在草莓、番茄、香蕉、西瓜等农产品中使用催熟剂，粮食作物中铅、镉等重金属污染，猪肉中瘦肉精、禁用兽药等的残留都会引起慢性、急性食物中毒，食品安全从原料开始，便受到严重的威胁。
在水产品养殖业中，不法业主为了提高水产品的成活率和出品率，不惜使用禁用鱼药，甚至使用激素类药物，有些药物代谢速度非常慢，因此大量残留在成品中，严重威胁着人民群众的身体健康。
在食品安全检测中，农药残留量已经成为重要的检测指标。
农药残留检测技术和标准是保证食品安全的重要支撑。
时代的发展对食品农药残留检测的灵敏度要求越来越高，检测范围也在扩大。
农药残留检测不仅要检测农药的目标物，还要对其毒性比较大的代谢物进行检测。
这无疑对食品农药残留的检测提出了更高的要求。
现在常用的检测手段有色谱法、色谱-质谱联用法和波谱法[1,2]，这些方法虽然选择性和灵敏度较好，但仪器复杂、价格昂贵、操作繁琐、使用成本高、难以在现场使用，因而普及困难。
因此，迫切需要研究和开发一些快速、方便、可靠的食品安全检测技术。
生物传感器分析技术与传统的检测方法相比具有选择性好、灵敏度高、分析速度快、成本低、能在线检测等优点，它作为一种检测手段已在食品安全检测领域得到广泛的研究与应用。
生物传感器[3]的应用大大缩短了农药残留的检测所用的时间，而且基于电化学方法的生物传感器，为仪器的小型化、智能化提供了可能。
![一种检测有机磷农药的乙酰胆碱酯酶传感器制备方法[发明专利]](https://img.taocdn.com/s1/m/5141e02605087632301212db.png)
专利名称：一种检测有机磷农药的乙酰胆碱酯酶传感器制备方法
专利类型：发明专利
发明人：郭业民,孙霞,王相友,刘君峰,翟晨
申请号：CN201310488146.0
申请日：20131018
公开号：CN103499619A
公开日：
20140108
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明涉及一种检测有机磷农药的乙酰胆碱酯酶传感器的制备方法，属于生物化工技术领域。
本发明的第一步为石墨烯-纳米金复合物修饰工作电极：以石墨烯和纳米金为原料制备的石墨烯-纳米金复合物滴涂到工作电极表面。
本发明的第二步乙酰胆碱酯酶传感器的制备：制备的煅烧类水滑石与乙酰胆碱酯酶混合的混合物滴涂到石墨烯-纳米金复合物修饰的工作电极表面。
石墨烯-纳米金复合物可以促进电子转移，提高传感器的灵敏度；煅烧类水滑石拥有良好的生物相容性，具有较强的吸附性，可以作为乙酰胆碱酯酶的固定载体，使酶更加稳定的固定在工作电极上，制备的乙酰胆碱酯酶传感器检测时间短，灵敏度高，稳定性好，可以用于实际样品的检测。
申请人：山东理工大学
地址：255086 山东省淄博市高新技术产业开发区高创园D座1012室
国籍：CN
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基于功能化石墨烯-聚乙烯醇复合膜固定乙酰胆碱酯酶的甲拌磷传感器郑莹莹;刘志敏;李婕;展海军【摘要】将功能化离子液体修饰石墨烯(IL-GR)分散在聚乙烯醇(PVA)中,制得IL-GR-PVA分散液,与乙酰胆碱酯酶(AChE)溶液混匀后滴涂在电极表面,利用PVA良好的成膜特性,制得新型有机磷检测酶电极AChE/IL-GR-PVA/GCE,并用于有机磷农药的检测.采用透射电镜(TEM)表征了IL-GR的形貌,采用循环伏安法(CV)和差示脉冲伏安法(DPV)研究了酶电极的电化学性质.结果表明,IL-GR-PVA复合膜具有良好的导电性和生物相容性,能很好地保持AChE的生物活性,并显著促进了其电化学过程.在优化实验条件下,抑制率(I％)与甲拌磷浓度的负对数在1.0×10-14～1.0×10-9 mol/L和1.0×10-9～1.0×10-6moL/L范围内呈良好的线性关系,检出限(S/N=3)为8.0×10-15 mol/L.该传感器制备简单,稳定性好,灵敏度高,为有机磷农药的测定提供了新方法.【期刊名称】《分析测试学报》【年(卷),期】2015(034)010【总页数】6页(P1152-1157)【关键词】石墨烯;离子液体;聚乙烯醇;甲拌磷;传感器【作者】郑莹莹;刘志敏;李婕;展海军【作者单位】河南工业大学化学化工学院,河南郑州450001;河南工业大学化学化工学院,河南郑州450001;河南工业大学化学化工学院,河南郑州450001;河南工业大学化学化工学院,河南郑州450001【正文语种】中文【中图分类】O657.1;F767.2随着现代农业的发展，农药被广泛用于农业生产，其中有机磷(OPs)农药是目前使用最多的品种，其高毒性和高残留性所带来的环境污染问题及对人类健康的威胁，已引起人们的广泛关注。
因此，建立快速、灵敏的OPs检测方法非常必要。
近年来，基于乙酰胆碱酯酶(AChE)的电化学生物传感器已在有机磷农药残留检测方面得到很好的应用，相对于传统的色谱法［1－2］，电化学生物传感器具有灵敏度高、响应时间短、线性范围宽、成本低等优点［3－4］。
聚结晶紫-石墨烯复合膜修饰电极测定食品中的辛硫磷
陈美凤;马心英
【期刊名称】《食品与发酵工业》
【年(卷),期】2013(039)010
【摘要】利用电化学方法把结晶紫聚合到石墨烯修饰电极上,制备了聚结晶紫-石墨烯修饰电极.研究了辛硫磷在此电极上的电化学行为,建立了测定辛硫磷残留的新方法.辛硫磷在聚结晶紫-石墨烯修饰电极上的还原峰电流与其浓度在8.0×10-8～2.0×10-5 mol/L内呈良好线性关系,检出限为4.0×10-8 mol/L.该方法用于实际样品分析.
【总页数】4页(P235-238)
【作者】陈美凤;马心英
【作者单位】菏泽学院化学化工系,山东菏泽,274015;菏泽学院化学化工系,山东菏泽,274015
【正文语种】中文
【相关文献】
1.以聚(3-己基噻吩)-石墨烯-Nafion修饰的玻碳电极为工作电极示差脉冲伏安法测定细颗粒物PM
2.5中铅的含量 [J], 金党琴;龚爱琴;丁邦东;周慧;田连生;韩磊;黄文江
2.用聚苏木精/TiO2-石墨烯复合膜修饰玻碳电极差分脉冲伏安法测定水样中对苯二酚 [J], 卢先春;王丹利;许春萱
3.聚三聚氰胺-石墨烯复合膜修饰电极对多巴胺与尿酸的同时测定 [J], 刘冉彤;宋诗
稳;胡凯;张腾;余紫婷;何国苗
4.聚L-组氨酸/石墨烯复合膜修饰电极对多巴胺和尿酸的同时测定 [J], 简选;于浩;金君;王毅;刘珍叶;齐广才
5.用石墨烯/聚二烯丙基二甲基氯化铵复合修饰电极为工作电极的循环伏安法同时测定人血清中尼莫地平和硝苯地平的含量 [J], 王安亭; 卫应亮; 王永刚; 汪丹; 李欣然
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传感器技术在有机磷农药残留检测中的应用【摘要】快速有效地检测农产品中有机磷农药残留是目前急需解决的问题。
本文分析了传感器技术在多种有机磷农残检测手段中的应用和存在的不足，特别是近年来发展迅猛的生物传感器技术呈现的多样化特点。
目前仍然缺乏一种简便、高效、快速、无损的检测技术，这已经成为当前研究者关注的热点。
【关键词】有机磷农药；传感器；检测1.引言有机磷农药是20世纪30年末问世的第二代人工合成农药，具有广谱、高效、品种多和残毒期短等特点，经常被用作杀虫剂喷洒在果树和蔬菜上。
如果残留在水果和蔬菜上的有机磷或环境中的有机磷进入到有机体内，大部分会对生物体内胆碱酯酶有抑制作用，使其失去分解乙酰胆碱的能力，造成乙酰胆碱积累，引起神经功能紊乱，从而导致肌体的损害。
因此，对农产品中的有机磷残留进行快速、高效的检测具有重要意义。
以理化方法为主的波谱法、色谱法、色质联用法等传统检测手段，操作复杂，耗时长。
在国内外近年来开展的快速、高效的检测方法研究中，传感器技术特别是生物传感器技术得到广泛应用，起到了重要作用。
2.常用传感器检测技术2.1 电子鼻（气敏传感器）检测技术电子鼻因模拟嗅觉系统而得名，是模仿生物鼻的一种电子系统，是二十世纪90年代发展起来的分析、识别和检测复杂嗅觉及大多数挥发性气体成分的仪器。
电子鼻主要是由气敏传感器阵列和模式识别系统两部分组成。
气敏传感器相当于人类嗅觉系统中的嗅觉细胞，是电子鼻检测性能优劣的基础。
单个气敏传感器的功能十分有限，目前还没有发现只对某种气体单一敏感的传感器材料，单个传感器对不同的响应可能会有变化，但它不具备自动识别气体种类和数量的能力。
因此由具有光谱响应特性、高灵敏度、对不同气体（气味）灵敏度不同的气敏传感器组成传感器阵列，利用其交叉敏感性，来提高电子鼻的检测性能。
利用信号预处理方法滤除模式采集过程中引入的噪声和干扰，提高信噪比，同时消除信号的模糊和失真，人为增强有用信号。
基于石墨烯纳米复合材料的有机磷生物传感器李云霞;马莉萍;王艳凤;聂莹莹;韩根亮【摘要】采用还原氧化石墨烯(RGO)/纳米金(AuNPs)/壳聚糖(CS)纳米复合材料固定化乙酰胆碱酯酶(AChE),制备了高灵敏度的电化学生物传感器用于有机磷农药——毒死蜱的检测.CS/SiO2复合溶胶凝胶网格状的结构为酶的固定化提供了良好的载体,石墨烯纳米复合材料不仅为AChE提供了良好的生物相容环境,且有效提高了传感器的灵敏度.传感器在最佳条件下对毒死蜱检测的线性范围为0.1～10.0ng/mL,检出限为0.05 ng/mL(S/N=3).【期刊名称】《甘肃科学学报》【年(卷),期】2014(026)003【总页数】5页(P42-45,49)【关键词】乙酰胆碱酯酶;石墨烯;电化学生物传感器;有机磷农药;毒死蜱【作者】李云霞;马莉萍;王艳凤;聂莹莹;韩根亮【作者单位】甘肃省科学院传感技术研究所,甘肃兰州 730000;甘肃省科学院传感技术研究所,甘肃兰州 730000;甘肃省科学院传感技术研究所,甘肃兰州 730000;甘肃省科学院传感技术研究所,甘肃兰州 730000;甘肃省科学院传感技术研究所,甘肃兰州 730000【正文语种】中文【中图分类】TP212.3有机磷类农药(OPs)是目前使用最广泛的一类农药,它们是一种神经毒物,会抑制人及动物体内胆碱酯酶活性,引起中枢神经系统功能紊乱,出现中毒、致癌症状[1]以至危及生命.目前有机磷农药残留分析的主要方法[2]有气相色谱法、气相色谱—质谱联用法、高效液相色谱法、高效液相色谱—质谱联用法等,这些方法虽然分析精度高、定量准确,但是样品的前处理复杂,耗时长,且不能现进行场检测.电化学酶生物传感器具有分析速度快、灵敏度高、可在线检测等优点,已被广泛应用到食品安全检测领域中,近年来,基于AChE的有机磷电化学生物传感器的研制备受关注.研究表明,将纳米材料应用到生物传感器中可显著提高传感器性能,采用纳米材料构建生物传感器是目前的研究热点,Au[3,4]、Ag[5]、Pt[6]等贵重金属以及碳纳米管[7]、导电聚合物薄膜[8]等均已被成功地用于固定生物酶.作为明星级碳材料的石墨烯因其较大的比表面积、良好的电子传导能力和生物相容性,在传感器构建领域具有很好的应用潜力[9,10].研究采用电化学的方法将氧化石墨烯在电极表面还原,然后以金纳米颗粒、壳聚糖将乙酰胆碱酯酶固定到传感器表面,建立了有机磷农药——毒死蜱的电化学检测方法,其具有较好的选择性和灵敏度.1 实验部分1.1 试剂与仪器实验试剂:乙酰胆碱酯酶(AChE,500UN,电鳗,Sigma公司).氯化乙酰胆碱(ATCh,Sigma公司),毒死蜱标准样品(农业部环境保护科研检测所),氧化石墨烯(GO,0.5 mg/mL),金氯酸(HAuCl4,国药集团化学试剂有限公司),柠檬酸三钠(上海化学试剂公司),壳聚糖(CS,天津市化学试剂三厂),氯化钾(KCl,国药集团化学试剂有限公司),磷酸氢二钾(Na2HPO4,天津市化学试剂三厂),磷酸二氢钾(KH2PO4,天津市化学试剂三厂)实验用水均为三重纯水.实验仪器:电化学工作站(AUTOLAB荷兰瑞士),SZ-97自动三重纯水蒸馏器(上海亚荣生化仪器厂).1.2 乙酰胆碱酯酶生物传感器的构建AuNPs/CS/AChE混合液的制备:称取0.5 g壳聚糖溶于100 mL 0.05 mol/L乙酸中,超声振荡1 h,得到透明5 g/L的壳聚糖溶胶.取15 μL正硅酸乙酯,60 μL乙醇,600 μL壳聚糖溶胶混合,超声振荡30 min,得CS/SiO2复合溶胶—凝胶,静置2 h后,加入14 μL 1 mol/L NaOH溶液,调节pH 7.0.用微量进样器分别移取5 μL乙酰胆碱酯酶溶液(557 U/mL),5μL CS/SiO2复合溶胶—凝胶,5 μL纳米金混合均匀,得到AuNPs/CS/AChE混合液.将玻碳电极用0.05 μm的抛光粉打磨成镜面,依次在乙醇和三次蒸馏水中超声清洗5 min,N2吹干.将0.5 mg/mL的氧化石墨烯滴涂到玻碳电极表面,室温下自然晾干后,采用循环伏安法在0.1 mol/L的KCl中扫描至稳定,形成还原态氧化石墨烯(RGO),扫描范围为0.3～-1.5 V.将电极从溶液中取出,N2吹干后,将AuNPs/CS/AChE混合液滴涂到RGO/GCE修饰电极上,在4 ℃冰箱中晾干待用.1.3 电化学检测采用三电极检测装置:修饰电极为工作电极,饱和甘汞电极为参比电极,铂丝为对电极.所有检测均在室温下进行,测试底液在测试前通入高纯氮气除氧.2 结果分析与讨论2.1 氧化石墨烯的还原研究采用循环伏安法将氧化石墨烯还原,在0.1 mol/L的KCl中扫描数圈,扫描范围为-1.5～0.3 V.2.2 修饰电极的电化学行为研究采用循环伏安法(CV)对电极的修饰过程进行了表征.不同修饰电极在1.0 mmol/L ATCh溶液中的循环伏安图见图1.由图1可知,裸玻碳电极a、氧化石墨烯修饰的玻碳电极b和石墨烯修饰的玻碳电极c均没有出现明显的氧化还原峰,但是c与a相比,背景电流明显增大,而b与a相比,背景电流并无明显变化,这说明氧化石墨烯由于强氧化的作用使得石墨结构遭到破坏,几乎不导电,而还原后,其结构得到很大程度的修复,导电性提高,显著增大了电极的有效表面积.RGO/AuNPs/CS/AChE修饰的玻碳电极d背景电流也较c曲线增大,这表明金纳米颗粒和石墨烯具有协同作用,可提高电极导电性；纳米材料的使用可实现酶与电极之间的直接电子转移；该修饰电极对硫代乙酰胆碱有催化作用,成功实现了乙酰胆碱酯酶的固定化.图1 不同修饰电极在1.0 mmol/L ATCh溶液中的循环伏安图Fig.1 Cyclic voltammogram of different modifiedelectrodes in 0.1 mmol/L ATCh solutionRGO/AuNPs/CS/AChE/GCE在2.0 mmol/L的K3Fe(CN)6(含KCl 0.1 mol/L)溶液中,在不同扫描速度下的循环伏安图见图2.图2中从a到k,扫速分别为:10 mV/s、20 mV/s、30 mV/s、40 mV/s、50 mV/s、70 mV/s、100 mV/s、150 mV/s、200 mV/s、300 mV/s、400 mV/s.图2 RGO/AuNPs/CS/AChE/GCE 2.0 mmol/L的K3Fe(CN)6(含KCl 0.1 mol/L)溶液中不同扫速下的循环伏安图，插图为峰电流与扫速平方根的线性关系图Fig.2 Cyclic voltammograms of the modified electrodes in K3Fe(CN)6 at different scan rates, and the inset is the linear relationship of peak currents and square root of scan rates从图2中可以看出,随着扫速的增加,峰电流值逐渐增加.图2中的插图为峰电流与扫速平方根的关系图,还原峰和氧化峰电流值都与扫速的平方根成正比,表明电极上的氧化还原反应是典型的扩散控制.2.3 传感器对毒死蜱标准样品的电化学响应为了测定农药标准样品毒死蜱的抑制作用,先将RGO/AuNPs/CS/AChE/GCE在含有0.5 ng/mL的毒死蜱丙酮溶液浸泡10 min,然后转移到5 mL 含有1.0 mmol/L ATCh的PBS溶液中进行循环伏安扫描得到抑制后的曲线b,见图3.曲线a为RGO/AuNPs/CS/AChE/GCE在1.0 mmol/L ATCh的PBS溶液中的循环伏安.对比a、b两条曲线,毒死蜱对乙酰胆碱酯酶催化硫代乙酰胆碱的反应有明显的抑制作用.图3 RGO/AuNPs/CS/AChE/GCE在毒死蜱抑制前、后对硫代乙酰胆碱催化的CV 图Fig.3 CV of acetylthiocholine catalyzed by the modifiedelectrode before and after it is inhibited by chlorpyrifos2.4 实验条件的优化支持电解质的pH值是影响传感器性能的一个重要因素,实验中考察了pH为6.5～8.5的PBS缓冲溶液作为测试底液对电极响应的影响(见图4).图4表明,传感器在pH为7.5的反应体系中电流最大,酶在生理pH范围内最有利于与底物相结合并发生催化作用,因此实验中选用pH为7.5的PBS缓冲溶液为测试底液.在0.1 mol/L,pH=7.5的PBS(含0.1 mol/L KCl)中加入不同浓度的ATCh,ATCh的浓度范围为0.4～1.2 mmol/L,研究底液浓度对传感器响应的影响(见图5).图4 磷酸缓冲溶液pH值对传感器响应电流的影响Fig.4 Effects of PBS pH on the sensor current response图5 底物用量对传感器响应的影响Fig.5 Effects of acetylthiocholine on the sensor current response图5表明,ATCh浓度范围在0.4～1.0 mmol/L时,响应电流随ATCh浓度的增加而增大,当浓度达到1.0 mmol/L时,随着ATCh浓度的增加,响应电流基本保持不变,说明在ATCh为1.0 mmol/L时,乙酰胆碱酯酶催化底物的反应达到动态平衡.因此,ATCh的浓度选择为1.0 mmol/L.2.5 农药标准样品的检测采用计时电流法对有机磷农药毒死蜱进行检测.先将制备好的RGO/AuNPs/CS/AChE/GCE修饰电极放入含有1.0 mmol/L ATCh的PBS(pH=7.5)溶液中,施加0.15 V恒电位,进行计时电流法测量.扫描稳定后将电极取出,分别在不同浓度的毒死蜱溶液中浸泡10 min,毒死蜱浓度分别为0.05 ng/mL、0.1 ng/mL、0.5 ng/mL、1.0 ng/mL、5.0 ng/mL、10.0 ng/mL.取出后用蒸馏水冲洗,再次放入含有1.0 mmol/L ATCh的PBS(pH=7.5)溶液中,施加0.15 V恒电位,进行计时电流法测量,修饰电极在不同浓度毒死蜱中的电流响应见图6.图6中a表示浓度为0,b表示浓度为0.05 ng/mL,c表示浓度为0.1 ng/mL,d表示浓度为0.5 ng/mL,e表示浓度为1.0 ng/mL,f表示浓度为5.0 ng/mL,g表示浓度为10.0 ng/mL,随着毒死蜱浓度的增加,测定底物时电流信号明显减小.计算不同浓度的毒死蜱对修饰电极抑制后的抑制率,以抑制率对农药浓度的负对数作图,见图7.结果表明,农药的抑制率与农药浓度的负对数在一定范围内呈线性关系,线性范围为0.1～10.0 ng/mL,检出限为0.02 ng/mL(S/N=3).图6 RGO/AuNPs/CS/AChE/GCE修饰电极于不同浓度毒死蜱溶液中浸泡后在含有1.0 mmol/L ATCh的PBS(pH=7.5)溶液中的计时电流测量Fig.6 Timing current measurement of the sensor after it is inhibited by chlorpyrifos图7 农药测定标准曲线Fig.7 The standard curve of detection of pesticide3 结论构建了将AChE固定到RGO/AuNPs/CS复合材料上的酶生物传感器,用于检测有机磷农药.研究结果表明,CS/SiO2复合溶胶-凝胶网格状的结构为酶的固定化提供了良好的载体；RGO/AuNPs/CS复合材料不仅有利于保持酶的生物活性,而且提高了电极的导电能力,加速了酶与电极之间的电子转移.该修饰电极显示出较好的灵敏度和稳定性,农药的抑制率与农药浓度的负对数在一定范围内呈线性关系,线性范围为0.1～10.0 ng/mL,检出限为0.05 ng/mL(S/N=3).参考文献:【相关文献】[1] 张晓鹏,张馨,王伟,等.95%水胺硫磷慢性毒性和致癌性研究[J].中国食品卫生杂志,2010,22(3):229-232.[2] 陈珠灵,陈飞,陈红青.高效液相色谱法测定蔬菜中3 种有机磷农药残留量[J].福州大学学报:自然科学版,2005,33(1):98-100.[3] 马莉萍,刘斌,宋玉哲,等.不同形貌纳米金修饰铂电极的葡萄糖生物传感器[J].功能材料,2009,40(5):530-533.[4] 马莉萍,左显维,王艳凤,等.基于Au NPs-CeO2 @PANI 纳米复合材料固定化酶的葡萄糖生物传感器[J].传感技术学报,2013,26(5):606-610.[5] 陈续胄,李建平.辣根过氧化物酶在纳米银修饰玻碳电极上的直接电化学研究[J].传感技术学报,2007,20(11):2 371-2 376.[6] 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收稿日期：２０１２－０９－２７基金项目：国家自然科学基金（２１２７５０３９）；河南省教育厅高校青年骨干教师基金项目（００１１３５）作者简介：景雁凤（１９８７－），女，内蒙古乌兰察布人，硕士研究生，主要从事环境电化学分析研究．*通信作者摘要：将乙酰胆碱酯酶（AChE ）固定到石墨烯-氧化锌（GR-ZnO ）纳米复合物修饰的玻碳电极表面，构建了一种用于辛硫磷检测的高灵敏电化学生物传感器.纳米复合物不仅为保持AChE 的生物活性提供了适宜的微环境，并且对辛硫磷的传感性能的改善显示出强大的协同效应.抑制率与辛硫磷浓度的对数值在1.0×10-11mol/L 到1.0×10-6mol/L 范围内呈良好的线性关系，检测限为3.4×10-12mol/L （S /N =3）.关键词：石墨烯-ZnO 复合物；乙酰胆碱酯酶；辛硫磷中图分类号：TS207.3文献标志码：B基于石墨烯-氧化锌复合物的乙酰胆碱酯酶生物传感器用于辛硫磷的测定景雁凤，刘志敏*，赵振江，郑莹莹，展海军（河南工业大学化学化工学院，河南郑州450001）0引言辛硫磷是农业生产中应用广泛的一种有机磷农药，它可以抑制乙酰胆碱酯酶的活性，导致体内神经递质乙酰胆碱的大量蓄积，从而产生恶心、头疼等中毒症状，严重的可以导致死亡[1]，因此对其快速检测显得非常重要.传统的检测方法主要是色谱法，但这些方法样品处理复杂，不适于进行现场检测[2].基于电化学方法的传感器，由于仪器易于微型化，为实现现场检测分析提供了可能.石墨烯是由单层碳原子密集排列成的二维蜂窝晶格结构的一种碳材料，具有导电性能好、比表面积大和电子转移速率快等优点，目前已用作制备电化学传感器的电极材料[3-5].但石墨烯的团聚限制了它的广泛应用.研究表明，石墨烯-氧化物复合材料具有良好的分散性和稳定性[6]，这些特性使其有望用于电化学传感器的构建并用于实际测定研究.基于此，本文构建了一种基于石墨烯-ZnO （GR-ZnO ）复合物的乙酰胆碱酯酶生物传感器，并用于快速灵敏的检测辛硫磷农药.1材料与方法1.1仪器与试剂Prestige-21傅立叶变换红外光谱仪：日本岛津公司；Hitachi-800透射电子显微镜：日本日立公司；X －射线粉末衍射仪：XRD ，D/max 2550，日本理学公司；CHI650C 电化学工作站：上海辰华仪器有限公司.采用三电极系统：玻碳电极（GCE ，Φ=3mm ）及复合物修饰电极为工作电极，饱和甘汞电极（SCE ）为参比电极，铂丝电极为对电极.氯化乙酰胆碱（ATCl ）和乙酰胆碱酯酶（AChE ，C3389，236U/mg ）购于Sigma 公司；辛硫磷（纯度≥99.99%）购自北京上立方联合化工技术研究院；戊二醛（25%）由上海国药集团提供；其他试剂均为分析纯.试验用水为二次蒸馏水.1.2GR-ZnO 复合物的制备首先采取文献［7］中方法合成石墨氧化物（GO ）和石墨烯（GR ）.GR-ZnO 复合物采用改进的文献方法合成[8].在200mL 蒸馏水中首先加入0.2g GO ，超声2h ，然后与100mL 含有0.2g Zn （NO 3）2的溶液混合均匀，之后加入3mL 氨水和0.2mL 水合肼，120℃反应4h.产物用蒸馏水洗至中性，60℃干燥12h ，即制得GR-ZnO 复合物.文章编号：1673-2383(2013)02-0072-05河南工业大学学报（自然科学版）Journal of Henan University of Technology （Natural Science Edition ）第34卷第2期2013年4月Vol.34，No.2A pr.2013网络出版网址：/kcms/detail/41.1378.N.20130423.1840.016.html 网络出版时间：2013-4-2318:40:40PM第２期1.3乙酰胆碱酯酶生物传感器的制备壳聚糖（CHI ）首先溶解在1%的冰醋酸中制得0.5%g/mL 壳聚糖分散液.然后将适量GR-ZnO 复合物加入到上述分散液中，超声分散后得到GR-ZnO/CHI 分散液.GR-ZnO/CHI 分散液与0.5%戊二醛等体积混合，之后取5μL 溶液滴加至电极表面，晾干后再滴加5μL 的乙酰胆碱酯酶溶液，冰箱中干燥即得乙酰胆碱酶生物传感器（AChE/ZnO-GR/CHI/GCE ）.1.4抑制率的计算方法乙酰胆碱酯酶能够催化底物氯化乙酰胆碱水解，催化活性受有机磷农药的抑制，导致水解产物硫代胆碱浓度减小，故电流减小.农药的浓度越大，电流减小的越显著，即对酶的抑制率增加.抑制率可由下式计算[9]：抑制率（A %）＝［（I 0－I 1）/I 0］×100%，式中:I 0为ATCl 在AChE/ZnO-GR/CHI/GCE 的响应电流；I 1是辛硫磷抑制后ATCl 在AChE/ZnO -GR/CHI/GCE 的响应电流.2结果与讨论2.1谱学表征2.1.1GR 的透射电镜表征采用透射电镜研究了合成GR 的表面形貌，如图1所示，石墨烯呈现透明的，有小褶皱的薄片状.2.1.2GO 、GR 和GR-ZnO 复合物的红外光谱表征图2中（a ）为GO 的红外图谱，其中1725cm -1处的吸收峰为C ＝O 的伸缩振动吸收峰，1389cm -1对应于C —O —H 的变形振动峰，1063cm -1处归属于C —O —C 伸缩振动吸收峰.GO 被水合肼还原后的红外图谱如图2中（b ）所示，含氧官能团的吸收峰大大降低，说明GO 还原为GR 后，含氧基团基本上已被脱去.图2中（c ）为GR-ZnO 复合物的红外图谱，与图2中（b ）相比较，新增加的432cm -1吸收峰为Zn-O 振动吸收峰[10].2.1.3GR 及GR-ZnO 的粉末衍射图谱GR ，ZnO and GR-ZnO 的粉末衍射图谱如图3所示.GR 在25°和44°出现衍射峰，与文献报道一致[11].GR-ZnO 复合物的主要衍射峰与纯ZnO 的衍射峰相同（JCPDS ，65-3411），说明GR 的存在并没有改变ZnO 的晶型.2.2修饰电极的电化学表征2.2.1不同电极的循环伏安图不同电极在5.0mmol/L K 3Fe （CN ）6（含有0.1mol/L KCl ）溶液中的循环伏安曲线如图4所示.与裸玻碳电极（曲线a ）相比，CHI 修饰后的电极峰电流（曲线b ）稍增大，主要因为壳聚糖的导电性较差，使用GR-CHI 修饰电极后，峰电流增大（曲线c ），这归因于石墨烯较大的比表面积和良好的导电性.使用ZnO-GR/CHI 复合物修饰电极后，峰电流继续增大（曲线d ），这主要是由于石墨烯和氧化锌的协同效应引起的.由于石墨烯非凡的电子传递性，改善了电极的导电性，加快了电极上电子的图1石墨烯的透射电镜图图2GO （a ）、GR （b ）和GR-ZnO （c ）复合物的红外图谱图3GR ，ZnO and GR-ZnO的粉末衍射图谱景雁凤，等：基于石墨烯-氧化锌复合物的乙酰胆碱酯酶生物传感器用于辛硫磷的测定73第３４卷河南工业大学学报（自然科学版）（a:GCE ；b:CHI/GCE ；c:GR-CHI/GCE ；d:ZnO-GR/CHI/GCE ）图4不同电极在5.0mmol/L K 3Fe （CN ）6（含有0.1mol/L KCl ）溶液中的循环伏安图交换速度，而且高导电率的氧化锌的存在又能使石墨烯的分散性得到极大提高.2.2.2AChE/ZnO-GR/CHI/GCE 的电化学行为图5为不同修饰电极在含有1.0mmol/L ATCl 的PBS （pH 7.5）中的循环伏安图，可以看出，裸GCE 电极没有峰（曲线a ）；而修饰电极AChE-CHI/GCE 有微弱的峰出现（曲线b ），这个峰是AChE 催化底物ATCl 的水解产物巯基胆碱产生的氧化峰；电极经过GR 修饰后，峰电流增加（曲线c ），而经过复合材料（ZnO-GR ）修饰后的电极，其峰电流显著增加，说明纳米级氧化锌和GR 具有较高的比表面积和电催化作用使基底和电极表面的电子转移速度加快.同时也说明GR 和纳米氧化锌复合物具有很好的协同作用.2.3试验条件的优化2.3.1pH 的优化溶液的pH 值决定固定AChE 的生物活性，图6显示了pH 值对1.0mmol/L ATCl 在AChE/ZnO-GR/CHI/GCE 上响应电流的影响.可以看出，在pH 7.5时峰电流值最大.考虑到检测农药的灵敏度，本试验选择pH 值为7.5.2.3.3AChE 用量的优化酶的固定量影响生物传感器的响应信号.试验在含有1.0mmol/L ATCl （pH 7.5PBS ）中考察了固定不同量的酶对响应信号的影响.如图7所示，当酶固定量达到50U 时，响应电流值达到最大，进一步增加酶用量峰电流却减小.因此，试验选择酶的固定量为50U.2.3.5抑制时间的选择在农药分析中抑制时间是最有影响力的参数之一，图8显示了抑制时间对生物传感器响应的影响.很显然，随着在辛硫磷溶液中抑制时间的增加，ATCl 在传感器上的响应电流逐渐减小.当抑制时间大于11min ，响应电流值趋向一个稳定值，表明辛硫磷和AChE 之间的结合位点达到平衡.因此抑制时间为11min ，从而使抑制率最大.（a:GCE ；b:CHI/GCE ；c:GR-CHI/GCE ；d:AChE/ZnO-GR/CHI/GCE ）图5不同电极在pH 7.5PBS 中含1.0mmol/L 的ATCl的循环伏安图图6缓冲溶液的pH对峰电流的影响图7酶浓度对传感器响应的影响74第２期2.4辛硫磷的检测在优化的试验条件下，AChE/ZnO -GR/CHI/GCE 在不同浓度的辛硫磷溶液中的差分脉冲伏安图如图9所示.由图9可看出，随着辛硫磷浓度的增加，电流逐渐减小，响应电流的减少值与辛硫磷的浓度成正比关系，这样就得到了用于分析的工作曲线.如图10所示，抑制率与辛硫磷浓度的对数值在1.0×10-11mol/L~1.0×10-6mol/L 范围内呈良好的线性关系，线性方程为：A （%）=109.56+8.66lg c ，相关系数为0.9880，检出限为3.4×10-12mol/L （S /N =3）.2.5实际样品检测称取10g 新鲜白菜菜叶，用研钵研碎，然后置于表面皿中，用微量注射器吸取100μL 10-5mol/L 辛硫磷农药标准溶液，将其喷撒于菜叶上，加盖放置10h ，然后用丙酮萃取样品中的辛硫磷，过滤并转移至50mL 的容量瓶中，定容摇匀，得到样品溶液.样品溶液进行加标回收率试验，回收率的范围在91.0%~110.0%之间.结果表明本试验所用的检测方法具有很高的准确性，可以用于实际样品的直接分析.3结论本文中提出了一种基于石墨烯-氧化锌复合物固定乙酰胆碱酯酶的新型生物传感器（AChE/ZnO-GR/CHI/GCE ），并将其用于农药辛硫磷的测定.采用循环伏安法对不同修饰电极的电化学行为进行了表征，结果表明ZnO-GR/CHI 复合膜修饰于碳玻电极表面，能有效地提高玻碳电极的电化学响应能力及保持乙酰胆碱酯酶的生物活性.由于乙酰胆碱酯酶能催化底物氯化乙酰胆碱的水解，水解产物巯基胆碱在电极上发生氧化产生电流，农药的加入会使该电流减小，产生抑制作用，抑制率与加入农药浓度的对数在一定范围内有良好的线性关系，据此建立了测定辛硫磷的新方法.参考文献：［1］Li C Y ，Wang C F ，Ma Y ，et al.A novel am -perometric sensor and chromatographic detector for determination of parathion ［J ］.Analytical Bio -analytical Chemistry ，2005，381（2）:1049-1055.［2］Kandimalla V B ，Ju H 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carbon electrode modified by graphene-ZnO （GR-ZnO ）nanocomposite film.The nanocomposite not only provided a biocompatible microenvironment to keep the bioactivity of AChE ，but also exhibited a strong synergetic effect on improving the sensing properties of phoxim.The inhibition rate of phoxim was proportional to the logarithmic value of phoxim concentrations in the range of 1.0×10-11to 1.0×10-6mol/L ，and the detection limit was 3.4×10-12mol/L （S /N =3）.Key words:graphene-ZnO composite ；AChE ；phoximgraphene and application to glucose detection ［J ］.Electrochimica Acta ，2010，55（28）:8606-8614.［4］Wei Q ，Mao K X ，Wu D ，et al.A novel label -free electrochemical immunosensor based on graphene and thionine nanocomposite ［J ］.Sen -sors and Actuators B ，2010，149（1）:314-318.［5］Wu J F ，Xu M Q ，Zhao G C.Graphene -basedmodified electrode for the direct electron trans -fer of Cytochrome c and biosensing ［J ］.Elec -trochemistry Communication ，2010，12（1）:175-177.［6］Paek S M ，Yoo E J ，Honma I.Enhanced 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