叶绿体的分离与荧光观察

实验三叶绿体的分离与荧光观察一、实验目的1．了解差速离心法分离细胞成分的一般原理和方法。

2．掌握从植物叶组织中分离叶绿体的方法。

3．熟悉荧光显微镜的使用方法，并观察叶绿体的自发荧光和次生荧光。

4．熟悉利用叶绿体得率来测量叶绿素含量。

二、实验原理叶绿体是是植物细胞中由双层膜围成，含有叶绿素能进行光合作用的能量转换细胞器。

由于具有这一重要功能，所以它一直是植物学、细胞生物学和遗传学等的重要研究对象。

植物细胞被细胞壁所包围，因此实验中必须破碎细胞壁的同时保持叶绿体的完整。

叶绿体是植物细胞中较大的一种细胞器。

将组织匀浆后悬浮在等渗介质中进行差速离心，是分离叶绿体等细胞器的常用方法。

差速离心就是根据一个颗粒在离心场中的沉降速率取决于颗粒的大小、形状和密度，及离心力以及悬浮介质的粘度等因素进行的。

在一给定的离心场中，同一时间内，密度和大小不同的颗粒其沉降速率不同。

依次增加离心力和离心时间，就能够使非均一悬浮液中的颗粒按其大小、密度先后分批沉降在离心管底部，分批收集即可获得各种亚细胞组分。

叶绿体的分离应在等渗溶液（0.35 mol/L氯化钠或0.4 mol/L蔗糖溶液）中进行，以免渗透压的改变使叶绿体受到损坏。

先将匀浆液在1 000 rpm的条件下离心2 min（以去除其中的组织残渣和一些未被破碎的完整细胞），然后在 3 000 rpm的条件下离心5 min，即可获得沉淀的叶绿体（混有部分细胞核）。

分离过程最好在0～4℃的条件下进行；如果在室温下，要迅速分离和观察。

有些生物体内的物质受激光照射后可直接发出荧光，称为自发荧光（或直接荧光），有的生物材料本身不发荧光，但它吸收荧光染料后同样也能发出荧光，这种荧光为次生荧光（或间接荧光）。

叶绿体含有的叶绿素发出火红色荧光属于自发荧光，叶绿体吸附吖啶橙后可发桔红色荧光属于次生荧光。

三、实验仪器、材料和试剂1．设备与器材。

实验十一叶绿体的分离和荧光观察一．实验目的了解细胞匀浆和差速离心分级分离细胞组分的原理。

了解提取叶绿体的基本原理及其过程，通过光学显微镜的观察了解体外分离的叶绿体的一般形态，增加对叶绿体的感性认识。

掌握吖啶橙染色叶绿体的方法。

掌握显微数码拍照的方法。

二．实验内容提取叶绿体，吖啶橙染色，观察染色结果。

显微数码拍照。

三．实验原理将组织匀浆后悬浮在等渗介质中进行差速离心，是分离细胞器的常用方法。

在一定的离心场中，同一时间内，密度和大小不同的颗粒其沉降速度不同。

依次增加离心力和离心时间，就能够使非均一悬浮液中的颗粒按其大小、密度先后分批沉降在离心管底部。

叶绿体的分离应在等渗溶液（0.35mol/LNacl或0.4mol/L 蔗糖溶液）中进行。

离心后可得沉淀的叶绿体。

四．实验方法与步骤1．取嫩叶3g，洗净去柄去叶脉，剪碎放入研钵中。

2．加4ml0.35mol/LNacl，研磨匀浆，尼龙布过滤于离心管中1ml。

3．1000rpm离心2分钟弃去沉淀。

4．3000rpm离心15分钟，弃去上清液，将沉淀用少量0.35mNacl悬浮。

5．提取叶绿体观察：①普通光镜②荧光光镜③加吖啶橙。

6．撕取叶表皮观察：①普通光镜②荧光光镜③加吖啶橙。

a．在普通光镜下，可看到叶绿体为绿色椒榄形，在高倍镜下看到叶绿体内部含有较深的绿色的绿色小颗粒即基粒。

b．在荧光显微镜下，叶绿体发出火红色荧光。

c．加入吖啶橙染后，叶绿体可发也桔红色荧光。

而其中混有的细胞核发出绿色荧光菠菜叶手切片观察。

d．在普通光镜下可以看到三种细胞：表皮细胞：为边缘吐锯齿表的鳞片状细胞。

保卫细胞：为构成气孔的成对存在的肾形细胞。

叶肉细胞：为排成栅状的长形和椭圆形细胞。

5．显微数码拍照。

五．实验结果。

中国海洋大学实验报告2019年 3 月30 日姓名杨慧慧学号17050031803 系年级海洋生命学院2017 专业生物技术科目细胞生物学实验上课时间周六12节题目实验一叶绿体的分离和荧光观察一、实验目的1.通过植物细胞叶绿体的分离, 了解细胞器分离的一般原理和方法。

2.观察叶绿体的自发荧光和次生荧光, 并熟悉荧光显微镜的使用方法。

二、实验原理1.将组织匀浆后悬浮在等渗介质中进行差速离心，是分离细胞器的常用方法。

2.叶绿体的分离应在等渗溶液中进行, 以免渗透压的改变使叶绿体受到损伤。

3.因为叶绿体有自发荧光，因此用荧光显微镜进行观察。

三、实验用品1.材料：新鲜菠菜。

2.试剂：0.35mol/L氯化钠溶液，0.01%吖啶橙(acridine orange)。

3.器材：(1)主要设备: 普通离心机、组织捣碎机、粗天平、荧光显微镜。

(2)小型器材: 烧杯, 量筒, 滴管, 刻度离心管, 纱布，无荧光载片和盖片。

四、实验步骤与方法一、叶绿体的分离与观察1.选取新鲜的嫩菠菜叶，洗净擦干后去除叶梗脉，称30g于150ml 0.35mol/L NaCl溶液中，装入组织捣碎机。

2.低速匀浆3~5min。

3.将匀浆用6层纱布过滤于500ml烧杯中。

4.每组取滤液4ml，1000r/min下离心2min，弃去沉淀。

5.将上清液在3000r/min下离心5min，弃去上清液，沉淀即含叶绿体(混有部分细胞核)。

6.将沉淀用0.35mol/L NaCl溶液悬浮。

7.取叶绿体悬液一滴滴于载玻片上，加盖玻片后即可在普通光镜和荧光显微镜下观察。

(1)在普通光镜下观察。

(2)在荧光显微镜下观察叶绿体的直接荧光。

(3)在荧光显微镜下观察叶绿体的间接荧光：取叶绿体悬液一滴滴在无荧光载片上，再滴加一滴0.01%吖啶橙荧光染料, 加盖片后即可在荧光显微镜下观察。

二、菠菜叶手撕片观察轻轻撕取新鲜嫩菠菜叶的表皮，展平置于载玻片上，滴加1~2滴0.35mol/L NaCl溶液，加盖片后置显微镜下观察。