实验三 叶绿体的分离与荧光观察

叶绿体色素提取分离与理化性质及含量测定▪（一）实验目的及意义▪（二）实验原理▪（三）实验步骤▪（四）实验报告实验目的和意义▪绿色植物的光合作用是在叶绿体中的叶绿体色素中进行的，了解叶绿体色素的组成、性质及测定对于理解光合作用的本质很有帮助。

▪因此，测定叶绿素含量便成为研究光合作用与氮代谢必不可少的手段，在作物育种、科学施肥、看叶诊断中有着广泛的应用叶绿体在细胞中运动视频叶绿体在细胞中的分布与结构类囊体膜的结构及功能实验原理植物叶绿体色素是吸收太阳光能，进行光合作用的重要物质。

它一般由叶绿素a、叶绿素b、胡萝卜素和叶黄素组成。

这些色素都不溶于水，而溶于有机溶剂，故可用乙醇、丙酮等有机溶剂提取。

实验原理▪色素分离的方法有多种，纸层析是最简便的一种。

当溶剂（有机推动剂）不断从纸上流过时，由于混合物（叶绿素提取液）中各种成分在固定相（滤纸纤维素所吸附的水分）和流动相（有机推动剂）间具有不同的分配系数，所以移动速度不同，经过一定时间后，可将各种色素分开。

▪叶绿素是一种二羧酸——叶绿酸与甲醇和叶绿醇形成的复杂酯，故可与碱起皂化反应而生成醇（甲醇和叶绿醇）和叶绿酸的盐，产生的盐能溶于水中，可用此法将叶绿素与类胡萝卜素分开。

实验原理▪叶绿素与类胡萝卜素都具有光学活性，表现出一定的吸收光谱，可用分光光度计精确测定。

叶绿素吸收光量子而转变成激发态，激发态的叶绿素分子很不稳定，当它变回到基态时可发射出红光量子，因而产生荧光。

叶绿素的化学性质很不稳定，容易受强光的破坏，特别是当叶绿素与蛋白质分离以后，破坏更快，而类胡萝卜素则较稳定。

▪叶绿素中的镁可以被氢离子所取代而成褐色的去镁叶绿素。

去镁叶绿素遇铜则成为铜代叶绿素，铜代叶绿素很稳定，在光下不易破坏，故常用此法制作绿色多汁植物的浸渍标本。

实验步骤(1)▪根据朗伯一比尔定律，某有色溶液的吸光度D与其中溶液浓度C和液层厚度L成正比，即：▪D＝KCL▪D：吸光度，即吸收光的量，C：溶液浓度, K：为比吸收系数（吸光系数），L：液层厚度，通常为1cm.▪如果溶液中有数种吸光物质，则此混合液在某一波长下的总吸光度等于各组分在相应波长下吸光度的总和，这就是吸光度的加和性。

实验二叶绿体的分离与荧光观察一、实验目的了解叶绿体分离的一般原理和方法，并熟悉应用荧光显微镜方法观察叶绿体荧光现象。

二、实验原理1、叶绿体的分离应在等渗溶液（0.35mol/L氯化钠或0.4mol/L蔗糖溶液）中进行,?以免渗透压的改变使叶绿体受到损伤。

利用差速离心法将匀浆液离心，从而使叶绿体得到分离。

分离过程最好在0〜5C的条件下进行；如果在室温下，要迅速分离和观察。

2、有些生物体内的物质受激发光照射后直接发出荧光，称为自发荧光（或直接荧光），如叶绿素的火红色荧光和木质素的黄色荧光等。

有的生物材料本身不发荧光，但它吸收荧光染料后同样也能发出荧光，这种荧光称为次生荧光（或间接荧光），如叶绿体吸附吖啶橙后可发桔红色荧光。

本实验利用荧光显微镜对叶绿体的荧光进行观察。

三、实验步骤1. 选取新鲜的嫩白菜叶片，洗净擦干后去除叶梗和粗脉，撕成小碎块，称3g放于玻璃研钵中，加入10ml0.35mol/LNaCI溶液，匀浆3〜5min。

2. 匀浆液用2层尼龙布过滤于50ml烧杯中。

3•将滤液平分到2个离心管中，天平配平，1000r/min下离心2min。

弃去沉淀。

4•将上清液在3000r/min下离心5min。

弃去上清，沉淀即为叶绿体。

5. 将沉淀用0.35mol/LNaCl溶液悬浮，做两张临时装片：①取一滴叶绿体悬液滴于载片上，加盖片观察；②取一滴叶绿体悬液滴于载片上，再滴加1-2滴0.01%吖啶橙荧光染料，加盖片观察：①在普通光镜下观察；②在荧光显微镜下观察：先用明视野（白炽光灯下）和用低倍镜头观察，找到适当的标本后，再转高倍镜头，并将白炽光灯转换成以汞灯激发光作光源，用暗视野观察。

6. 撕取白菜叶片下表皮一小片置于滴有清水的载片上，盖上盖玻片，在普通光镜下观察气孔的形状，保卫细胞里面的叶绿体；随后转置荧光显微镜下观察。

四、结果与分析参考文献《细胞生物学实验》李玲李雪峰着湖南科学技术出版社百度文库《叶绿体的分离与荧光观察》。

叶绿体的分离及荧光染色观察泮力菁 2011级生物基地 201100140091 同组者:商倩倩【实验目的】1、通过植物细胞叶绿体的分离，了解细胞器分离与纯化的原理和方法；2、熟悉荧光显微镜的使用方法，观察叶绿体的自发荧光和间接荧光;3、复习巩固制片及染色的基本技术。

【实验原理】1、真核细胞由细胞膜、细胞核和细胞质组成。

细胞质中含有若干细胞器和细胞骨架,这些结构被称为亚细胞组分。

分离亚细胞组分的方法主要有差速离心和密度梯度离心两种。

2、差速离心和密度梯度离心：差速离心法是在密度均一的介质中由低速到高速的逐级离心用于分离不同大小的物体。

离心速度逐渐提高，样品会按先大后小的顺序沉淀.在差速离心中细胞器沉降的顺序为：细胞核、线粒体、溶酶体和过氧化物酶体、内质网和高尔基体。

最后为核糖核蛋白复合体。

由于各种细胞器在大小和密度上可能相互重叠。

一般差速离心2—3次，分离效果会好一些。

差速离心只用于分离密度和大小悬殊的细胞或细胞器，并且得到的产物纯度较低。

若对产物纯度的要求较高,则需要密度梯度离心来分离纯化。

密度梯度离心法是利用一定的介质在离心管内形成连续的密度梯度，将细胞悬浮液或匀浆置于介质的顶部，通过离心力的作用使细胞或细胞器分层、分离，最后不同密度的细胞或细胞器位于与自身密度相同的沉降区带中。

这种离心技术又可分为速度沉降和等密度沉降两种.速度沉降主要用于分离密度相近而大小不同的物体，而等密度沉降用于分离密度不同的物体.叶绿体是植物细胞所特有的能量转换细胞器。

它是一种比较大的细胞器，利用差速离心即可分离收集,然后用密度梯度离心纯化,便可用于各种研究.3、荧光：光致发光：某些物质在照射下，吸收光能进入激发态，当从激发态进入基态时，可以以电磁辐射的形式释放出吸收的光能，这种现象称之为“光致发光”。

紫外辐射,可见光及红外辐射均可引起光致发光，如磷光与荧光.荧光：在光致发光中，如果一定波长的短波光（如紫外光）照射某种物质，这种物质吸收光能后进入激发态，并立即激发在极短的时间内能发射出比照射光波长更长的光（如可见光），这种光就称为荧光.一旦停止入射光，发光现象也随之立即消失.荧光的性质：A、吸收光，必须有激发光源；B、荧光波长大于激发波长（损失热能）；C、荧光强度小于激发光的强度；D、有不同程度的衰减（影响因素：如温度、光。

实验三叶绿体的分离、提取、观察2011.03.23班级：姓名：一．试验目的1．学习使用差速离心方法分离获取叶绿体。

2．理解叶绿体的分离与保存环境。

3．叶绿体的形态观察、测量、叶绿体悬液的荧光现象观察。

二．实验原理1．叶绿体是植物叶肉细胞内重要的细胞器，是植物光合作用的场所。

分离提取得到的活体叶绿体，既能进行光合作用速率测定，也能进行叶绿体色素的分离提取。

2．差速离心法常用于获取细胞中的某一物质，其原理是在一定转速条件下，不同密度大小的物质沉降速度不一样，最终使有密度差异的物质得以分离。

三．实验用具1．材料与试剂：菠菜叶、0.35mol/L NaCL、95%乙醇、石英砂。

2．器具：离心机、天平、量筒、研钵、玻棒、纱布等四．实验步骤1．选用生长健壮的菠菜叶片洗净后去除中脉，然后放入0—4 ℃冰箱或冰瓶中预冷。

2．取叶片经滤纸吸干水后，称取5g剪成碎片，于10—15 mL0.35mol/L氯化钠溶液中，置于研钵中，加少量石英砂，手工快速研磨，(注意不要用力过猛，也不必研磨过细)。

3．研磨后将匀浆用2层新纱布过滤，滤液盛于烧杯中。

4．将滤液装入预冷过的离心管，经天平平衡后，以1200r/min离心2min，弃去沉淀。

5．上清液再经3000 r/min离心5 min ，倾去上清液，沉淀即为叶绿体。

6．沉淀用2 mL 0.35mol/L氯化钠溶液悬浮，备用。

7．用滴管取少量悬浮液于载玻片上，加盖玻片后，吸水纸吸去多余的溶液，置显微镜下镜检观察。

可看到叶绿体为绿色橄榄形，在高倍镜下可看到叶绿体内部含有较深的绿色小颗粒，即基粒。

测量叶绿体的长轴和短轴，分别测量5~10个叶绿体，求其平均值。

8．称取叶片5g剪成碎片，加10—15 mL95%乙醇及少量石英砂，于研钵中快速研磨，然后2层纱布过滤，取滤液，将其装入离心管，以2500r/min离心3min，收集上清液于试管中。

9．叶绿体荧光现象的观察：用强的柱状光源照射盛装叶绿素提取液的试管，然后顺着光源方向观察提取液颜色，并和对着光管观察是的情况进行比较。

实验一叶绿体的分离与荧光观察1．实验目的了解叶绿体分离的一般原理和方法，并熟悉应用荧光显微镜方法观察叶绿体荧光现象。

2．实验原理叶绿体是植物细胞中较大的一种细胞器，能发生特有的能量转换。

利用低速离心机可以分离叶绿体，其分离在等渗溶液（0.35mol/L氯化钠或0.4mol/L蔗糖溶液）中进行，目的是为了防止渗透压的改变引起叶绿体的损伤。

将匀浆液在1000r/min离心，去除其中的组织残渣和一些未被破碎的完整细胞，然后，3000r/min 离心，可获得沉淀的叶绿体（混有部分细胞核）。

在室温下进行分离要迅速。

某些物质在一定短波长的光（如紫外光）的照射下吸收光能进入激发态，从激发态回到基态时，就能在极短的时间内放射出比照射光波长更长的光（如可见光），这种光就称为荧光。

若停止供能，荧光现象立即停止。

有些生物体内的物质受激发光照射后，可直接发出荧光（称为自发荧光），如叶绿素的火红色荧光。

有的生物材料本身不发荧光，但它吸收荧光染料后同样也能发出荧光（称为间接荧光），如叶绿体吸附吖啶橙后可发橘红色荧光本实验利用荧光显微镜对发荧光的叶绿体进行观察。

3．实验材料、用品⑴实验材料：菠菜叶片⑵实验药品：蒸馏水，0.35mol/L氯化钠溶液，0.01%吖啶橙。

⑶实验仪器：普通离心机，组织捣碎机，天平，荧光显微镜，显微镜，载玻片，盖玻片，镊子，接种针，目镜测微尺，物镜测微尺，恒温箱，培养皿，滤纸，试管，试管架，移液管，滴管，烧杯，无荧光载片，盖玻片，离心管。

4．实验步骤⑴选取新鲜的菠菜嫩叶，洗擦干后去除叶梗及粗脉，称3g于0.35mol/L氯化钠溶液15ml中置组织捣碎机或研钵中。

⑵利用组织捣碎机低速（5000r/min）匀浆，3~5min，或研磨成匀浆。

⑶用6层纱布过滤，滤液盛于烧杯中。

⑷取滤液4ml在1000r/min下离心2min，弃去沉淀。

⑸将上清液在3000r/min下离心5min，弃去上清液，沉淀即为叶绿体（混有部分细胞核）。

叶绿体的分离纯化及荧光观察叶绿体是植物细胞中的一种细胞器，它是进行光合作用的主要场所。

叶绿体具有一定的自复制能力，可以独立分离出来，纯化叶绿体样品可以方便地进行进一步的实验研究。

本文将详细介绍叶绿体的分离、纯化以及荧光观察的方法。

一、叶绿体的分离1.实验材料准备为了分离叶绿体，我们需要充足的植物组织样品。

可以选择新鲜的叶片或者细胞培养物作为实验材料。

同时，需要准备好一系列试剂，例如缓冲液、葡萄糖、EDTA、PEG等。

2.组织破碎和提取液的准备首先，将植物组织样品冷冻在液态氮中，然后用超声波处理器将样品破碎。

接下来，将破碎的样品用缓冲液溶解，加入适量的葡萄糖和EDTA。

将溶解后的样品在低温条件下离心，然后取出上清液。

3.叶绿体的沉淀将提取液中的上清液用PEG逐渐沉淀叶绿体。

首先加入PEG溶液，并轻轻搅拌。

然后，将样品在低温条件下离心，离心后会出现一个绿色的沉淀。

这个沉淀就是叶绿体。

4.叶绿体的洗涤和纯化将叶绿体的沉淀用缓冲液洗涤数次，然后用离心将叶绿体沉淀下来。

最后，将沉淀的叶绿体用缓冲液悬浮，即可得到纯化的叶绿体样品。

二、叶绿体的荧光观察1.荧光探针的准备为了观察叶绿体的荧光，我们需要准备好合适的荧光探针。

通常使用的探针有二苯基苯酚（DPBF）和二聚(4-乙基-5-（4-甲基吡啶氧基）-2-溴脱氧葡萄糖（DAB）等。

2.荧光探针的添加将纯化的叶绿体置于含有荧光探针的溶液中，静置一段时间。

荧光探针会与叶绿体中的一些分子发生作用，从而产生荧光。

3.荧光观察使用荧光显微镜观察叶绿体的荧光。

将样品放置于荧光显微镜下，设置合适的激发波长和观察波长。

然后观察荧光显微镜中的图像，即可看到叶绿体的荧光。

4.结果分析通过观察叶绿体的荧光，可以得到关于叶绿体活性和光合作用效率的信息。

例如，如果观察到荧光强度较高，可以推测叶绿体的光合作用效率较低。

总结：叶绿体的分离、纯化及荧光观察是研究植物生物学和光合作用的重要方法之一、通过正确的操作流程和合适的实验材料，可以得到纯化的叶绿体样品，并通过荧光观察了解叶绿体的活性和光合作用效率。

姓名班级 13级生命基地班学号同组者：科目细胞生物学实验实验题目叶绿体的分离与荧光观察【实验题目】叶绿体的分离与荧光观察【实验目的】1、通过对植物细胞叶绿体的分离，了解细胞器分离的一般原理和方法。

2、观察叶绿体的自发荧光和次生荧光3、熟悉荧光显微镜的使用方法。

【实验材料与用品】1. 器材：离心机、组织捣碎机、天平、荧光显微镜、烧杯、量筒、胶头滴管、刻度离心管六层纱布，载玻片、盖玻片等2. 材料：新鲜菠菜3. 试剂：0.35 mol/L氯化钠溶液，0.01％吖啶橙(acridine orange)【实验原理】I.叶绿体分离的原理匀浆破碎细胞：利用差速离心方法分离等渗介质中的悬浮颗粒，收集类叶绿体大小的颗粒，得到叶绿体。

差速离心:颗粒在离心场中的沉降速率取决于颗粒的大小、形状和密度，也同离心力以及悬浮介质的黏度有关。

在一给定的离心场中，同一时间内，密度和颗粒大小不同的颗粒其沉降速度也不同。

依次增加离心力和离心时间，就能使非均一悬浮液中的颗粒按其大小、密度先后分批沉降在离心管底部，分批收集即可获得各种亚细胞组分。

叶绿体的分离应在等渗溶液中进行（0.35mol/L氯化钠溶液或0.4mol/L蔗糖溶液），以免渗透压的改变使叶绿体受到损伤。

分离过程最好在0-5℃条件下进行：如果在室温下，要姓名班级 13级生命基地班学号同组者：科目细胞生物学实验实验题目叶绿体的分离与荧光观察迅速分离和观察。

II.差速离心特点：介质密度均一，速度由高到低，逐级离心；用途：分离大小相差悬殊的细胞和细胞器；沉降顺序：核---线粒体---溶酶体和过氧化物酶体---内质网与高尔基体---核蛋白体，可将细胞器初步分离，常需要进一步通过密度梯度离心再进行分离纯化。

III.①荧光的概念光致发光：某些物质在照射下，吸收光能进入激发态，当从激发态回到基态时，可以以电磁辐射的形式释放出吸收的光能，这种现象称为“光致发光”。

紫外辐射、可见光以及红外辐射均可引起光致发光，如磷光和荧光。