紫甘薯多酚氧化酶性质研究

18 2006 V ol . 32 N o . 8 (To t a l 224)
mmol/ L 含有 30 mmol/ L Vc 的磷酸盐缓冲液 125 mL (p H 710) 提取 ,在高速打浆机中打浆 2 min ,过 4 层粗 滤布 ,取上清液在冷冻离心机 (4 ℃,11 000 ×g) 离心 30 min ,上清液即为粗酶液 。对粗酶液使用分子质量 为 12 000～14 000 u 的透析袋透析 30 h ,袋中酶液供 实验使用[4 ] 。
UV - 757 紫外可见分光光度计 ;酸度计 ;高速组 织捣碎机 ; GL - 20 G - II 冷冻离心机 。 113 实验方法 11311 PPO 的提取
将紫甘薯洗净后去皮 , 取新鲜样品 50 g , 用 10
第一作者 :硕士研究生 (高彦祥教授为通讯作者) 。 收稿日期 :2006 - 03 - 24 ,改回日期 :2006 - 06 - 01
11312 PPO 与底物反应生成物的光谱吸收图 将 PPO 与邻苯二酚的反应产物在 400～700 nm
波长下进行吸收波长的扫描 ,确定其最大吸收波长 。 11313 PPO 活力的测定
取 0101 mol/ L 磷酸盐缓冲液 (p H 616) 2 mL 于 1 cm 比色皿中 ,加入 0107 mol/ L 邻苯二酚溶液 1 mL , PPO 粗酶液 5 mL ,混匀后在 412 nm 处比色 ,酶液加 入后开始计时 ,每 30 s 记录 1 次 OD 值随时间的变化 值 ,以最初直线段的斜率 ( △OD/ t) 计算酶活力 。酶 活力单位定义为 :在测定条件下 ,每分钟引起吸光度 改变 01001 单位所需的酶量为 1 个酶活力单位[1 ] 。 11314 蛋白质含量的测定
配制不同浓度的 NaHSO3 ( 015 、110 、215 、510 mmol/ L) 、抗坏血酸 (1 、215 、5 、10 mmol/ L) 、NaCl (10 、 20 、30 、40 mmol/ L ) 、ED TA ( 0101 、0102 、0130 、0140 、 0105 mol/ L ) 溶液 ,对酶液诱导 10 min ,在反应体系 p H 710 ,室温下测定 PPO 的抑制率 ,抑制率的计算公 式为 : [ ( A 0 - A I) / A 0 ] ×100[1 ] 。 1131517 铜试剂对 PPO 活力的影响
数 ,是比例于分子碰撞次数的常数 。
活化能 (Δ E # ) 由 ln (k) - 1/ T 直线 (图 6) 的斜
多酚氧化酶 ( PPO) 是指能氧化多元酚类物质的 一类酶 ,广泛存在于苹果 、马铃薯 、香蕉 、荔枝等植物 中 。这些农产品在加工过程中 ,与空气接触会逐渐变 为褐色至黑色 ,严重地损害了产品的感官品质 。其主 要原因是多酚氧化酶催化邻苯二酚类物质 ,使其与空 气中的氧气发生反应生成邻醌类物质 ,再发生聚合反 应生成黑色物质[1 ,3 ] 。
采用 Bradford 法 ,以牛血清白蛋白作为标准 ,在 波长 595 nm 比色测定[4 ] 。 11315 粗酶液性质的研究 1131511 PPO p H 稳定性的测定
首先配制 0101 mol/ L 的柠檬酸2磷酸盐缓冲溶 液 ( p H 316 ～ 614 ) 及 0101 mol/ L 的 磷 酸 盐 (NaH2 PO42Na2 HPO4) 缓冲溶液 (p H 616 ～ 816) 。使 用上述不同 p H 缓冲液稀释酶液 , 放置 0 ℃诱导 30 min 。在 1 cm 比色皿中 ,加入诱导后的 PPO 粗酶液 5 mL 、0107 mol/ L 邻苯二酚溶液 1 mL 及 p H 710 缓冲 溶液 2 mL ,在室温下测定 PPO 的剩余活力 。 1131512 p H 对 PPO 活力的影响
图 2 p H 对 PPO 的稳定性的影响
从图 2 可以看出 ,p H 410～710 PPO 活力逐渐增 加 ;p H 710～910 时 ,其活力不断下降 。由此可见 ,紫 甘薯中 PPO 活力在偏酸和偏碱的条件下都得到有效 抑制 ,在 p H 为 710 时其活力最高 。这与文献中报道 的胡椒 、薄荷[6 ] 、苹果[7 ] 和马铃薯中 PPO[1 ] 的 p H 稳 定性相似 ,即在 p H 6～7 范围内很稳定 ,在 p H 710 时 其活力最大 。但与芋头的 PPO 有所不同 ,其多酚氧 化酶在 p H 510 时活力最高[1 ] 。 213 p H 对 PPO 活力的影响
在 1 cm 比色皿中 ,加入 5 mL PPO 粗酶液 、115 mL 0101 mol/ L 的磷酸盐缓冲液溶液 (p H 710) 及 1 mL 0107 mol/ L 的邻苯二酚溶液 ,在 10～50 ℃范围内 不同温度梯度下反应 10 min ,然后迅速在 412 nm 处 比色测定 PPO 的活力 。 1131514 PPO 热稳定性的测定
2 结果与讨论
211 PPO 与底物反应生成物的光谱吸收图 体系反应产物在可见光波 350～600 nm 下的吸
光度曲线如图 1 所示 。
图 1 PPO 与底物反应物的光谱吸收
图 3 p H 对 PPO 活力的影响
PPO 活力受反应体系的 p H 影响很大 ,其影响如 图 3 所示 。紫甘薯 PPO 最适 p H 为 710 ,在 p H < 710 时 ,随着 p H 的降低 ,酶活力也逐渐降低 ,表现为体系 反应速度逐渐变慢 ; 当 710 < p H < 816 时 ,随着 p H 的增大 ,酶活力受到了一定的抑制 。其原因是 PPO 为碱性蛋白质 ,在较强的酸性条件下 ,辅基铜将以铜 离子的形式解离出来 ,从而使酶失活 ;而在碱性条件 下 ,辅 基 铜 会 解 离 成 Cu ( OH) 2 , 使 酶 活 力 显 著 降 低[8 ] 。因此调节 p H 能有效地抑制酶活力 。在进行
紫甘 薯 是 甘 薯 的 1 个 特 殊 品 种 , 紫 甘 薯 色 素 ( PSPC , purple sweet potato color) 是从紫甘薯的块根 和茎叶中萃取的一种天然色素 ,色泽鲜亮自然 ,无毒 , 无特殊气味 ,具有营养 、药理和保健功能 ,是一种重要 的天然食用色素资源[2 ] 。但新鲜的紫甘薯在加工过 程中 ,易发生褐变使其色素氧化成黑色素 ,导致萃取 的色素失去原有的商品价值 。
将 PPO 粗酶液分别在 25 、30 、40 、50 、60 、70 、80 ℃ 水浴中保温 15 min ,立即冷却至室温 ,在 1 cm 比色皿 中迅速加邻苯二酚测定 PPO 的剩余活力 。 1131515 底物对 PPO 活力的影响
选择 基邻苯二酚 、邻苯二酚 、绿原酸 、咖啡酸 作为底物 ,在不同浓度下测定米氏常数 Km 。 1131516 抑制剂对 PPO 活力的影响
配好铜试剂标准溶液 ,加入酶溶液使之在体系中 的 浓 度 分 别 为 0105 、0110 、0115 、0120 、0125 和 0130mmol/ L 。同时做空白对照 ,在 25 ℃下反应 ,412 nm 波长下测定 PPO 的活力 。
由图 1 可知 ,反应体系在可见波长 412 nm 处有 最 大 吸 收 峰 ( A 412) , 可 用 于 检 测 PPO 的 反 应 进 程[5 ] 。在 350～412 nm 范围内随着波长的增加 ,吸光 度逐渐增大 ;在 412～600 nm 范围内 ,随着波长的增 加 ,吸光度逐渐降低 ,因此以下实验均在 412 nm 波长 下比色测定 PPO 的活力 。 212 PPO p H 稳定性的测定
多酚氧化酶是一种蛋白质 ,不适宜的温度会破坏 活力部位三维结构的完整性 ,而它又是保持酶活力的 关键[12 ] 。如图 4 所示 , 紫甘薯 中 PPO 最 适 温 度 为 25 ℃,这 与 文 献 中 报 道 的 马 铃 薯 PPO 最 适 温 度 22 ℃[13 ] ,朝鲜蓟 (artichoke) PPO 最适温度 25 ℃[14 ] 比 较相近 ,但与其他植物中 PPO 最适温度亦有不同 ,例 如 ,欧渣果 (medlar) 中 PPO 最适温度为 35 ℃[15 ] ,李子 (plum) 中 PPO 最适温度为 37 ℃[16 ] ,桑椹中 PPO 最 适温 度 为 45 ℃[17 ] 。从 图 4 可 以 看 出 , 当 温 度 降 至 10 ℃,酶活力为最高活力的 8012 % ;当温度升至 50 ℃ 时 ,酶活力为最高活力的 6417 %。因此 ,调节温度在 一定程度上可以抑制酶的活力 。
因此从紫甘薯中提取天然色素的关键在于抑制 酶促褐变反应 。文中研究了紫甘薯中多酚氧化酶的 反应条件 ,并选择不同抑制剂抑制酶活力 ,达到防止 紫甘薯酶促褐变的目的 ,以此为工业化萃取紫甘薯色 素提供理论依据 。
1 材料与方法
111 实验材料 新鲜紫甘薯 :洗净后挑选组织完整 、无损伤的紫
甘薯供实验使用 。 112 实验仪器
食品与发酵工业 FOOD AND FERMEN TATION INDUSTRIES
紫甘薯多酚氧化酶性质研究
许正虹 刘 璇 高彦祥
(中国农业大学食品科学与营养工程学院 ,北京 ,100083)
摘 要 采用含有 30 mmol/ L Vc 的 0101 mol/ L 磷酸盐缓冲液从紫甘薯中提取多酚氧化酶 ( PPO) ,用分光光度 法对紫甘薯中多酚氧化酶的酶学特性进行了系统的研究 ,其中包括 PPO 的活力测定 、热稳定性 、p H 稳定性以及 p H 、温度 、抑制剂对 PPO 活力的影响 。实验结果表明 ,多酚氧化酶催化反应的最佳条件为 :温度 25 ℃,p H 710 , Na HSO3 和 Vc 对酶活力有很强的抑制作用 。 关键词 紫甘薯 ,多酚氧化酶 ,酶反应特性
2006 年第 32 卷第 8 期 (总第 224 期) 19
食品与发酵工业 FOOD AND FERMEN TATION INDUSTRIES
工艺设计时 ,应尽可能地避免在此 p H 范围内操作 , 选择在其活力较低的 p H 范围内 (p H < 5 或 p H > 8) 进 行 。不同植物中多酚氧化酶活力受 p H 影响不同 ,香 蕉 PPO 最 适 p H 为 510 ～ 615[9 ] , 香 水 梨 PPO 为 510[10 ] ,而蕃石榴 PPO 最适 p H 为 810[11 ] 。 214 温度对 PPO 活力的影响