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免疫组化操作方法、原理、步骤以及常见问题处理大总结免疫组化操作方法、原理、步骤以及常见问题处理大总结1、方法操作不难，最大的难处是出现异常结果时如何解决？这就需要掌握免疫组化实验原理，每一步知道为什么这样做，这样你才敢大胆地改革先前的不对的方法步骤。
如抗体孵育条件主要是抗体浓度、温度、时间，这三者一般是相互成反比的（相对），其中浓度是最重要的先决条件，温度决定反应的速度、时间决定反应的量。
就拿温度来说，可以有4 度、室温、37度，我推荐4度最佳，反应最温和，背景较浅；而37度反应速度较快，时间较短；室温我不太提倡，除非你每次都把环境温度控制在一定的范围，否则，尽量选择前两者。
2、免疫组化最大的优势是定位和定性。
相比于其他蛋白检测方法，免疫组化具有定性灵敏度高、定位较直接准确，是定位检测分析首选方法。
尤其对于有些因子的转位研究十分有用。
3、免疫组化结果定量分析的前提是高质量的染色切片。
免疫组化结果也能定量分析，但必须是背景染色浅而特异性染色较深的情况下，分析最为准确，这种原则可能也是我们日常审稿时判定研究结果的必备条件。
4、免疫组化实验一定要设置阳性对照和阴性对照。
阳性对照一般是用肯定表达这种抗原的切片来做；阴性对照一般是用PBS或非一抗替代一抗来进行反应，其余步骤均一致。
前者是排除方法和实验系统有无问题；后者是排除有无一抗外的非特异性染色。
5、免疫组化的应用广泛，是当前实验研究的最重要方法之一。
如今发SCI论文时，明显感觉仅靠量化的数据来发文章很难，加一些形态学数据或图片，老外十分欢迎，可能是怕你学术造假吧。
当然也不能做假阳性或假阴性结果。
6、免疫组化技术掌握与否的鉴定标准是同一切片或不同切片中不同抗原均从摸索浓度或条件而做出优良的染色切片。
我在平时带教中就发现许多研究生把我已经摸索很成熟的反应条件、浓度、方法步骤，重复运用于同一性质的切片和同一种抗体，做出来后就觉得自己已经掌握了免疫组化方法，更换一种抗体后，居然连二抗的种属来源都拿错了。
在同一组织细胞标本上需要同时检测两种抗原时，需进行双重荧光染色。
双重免疫荧光标记法(double immunofluorescence labeling method)也分为直接法和间接法。
(1)直接法双重免疫荧光标记：将标记有两种不同荧光素的抗体(如抗A 和抗B)以适当比例混合，滴加在标本上孵育，然后洗去未结合的荧光抗体，在荧光显微镜下分别选择两种相应的激发滤片观察，即可对两种抗原进行定位和定量。
直接法简便可靠，但灵敏度较低。
(2)间接法双重免疫荧光标记：用未标记的两种特异性第一抗体孵育组织或细胞，洗去多余的第一抗体后，再用两种不同的荧光素分别标记的第二抗体孵育组织或细胞，洗去多余的第二抗体，后在荧光显微镜下分别选择两种相应的激发滤片观察，从而对两种抗原进行定位和定量。
使用此法应注意两种特异性第一抗体必须来源于不同种属，且荧光标记第二抗体的种属必须与第一抗体的种属相匹配。
免疫荧光双标技术中操作要点和注意事项一、免疫荧光技术中标本制作的基本程序近似于酶免疫组化，不同点如下：1、免疫荧光不需要使用双氧水处理，封闭和一抗孵育与其相同。
2、免疫荧光的二抗使用不同荧光标记的二抗孵育，孵育时间根据抗体的工作浓度确定。
3、二抗孵育之后充分洗片后即可贴片、封片和观察。
4、免疫荧光在封片时常使用专用封片剂或甘油：0.01M PBS (1：1)。
条件许可，建议购买抗淬灭的封片液，使标本可以保存更久。
5、荧光抗体的孵育以及后续处理需要避光。
6、荧光抗体染色假阳性可能会多，需要分别设定阳性和阴性对照。
二、注意事项1、荧光染色后一般在1h内完成观察，或于4℃保存4h，时间过长，可能会使荧光提前衰退。
2、每次试验均需设置以下三种对照：(1) 阳性对照：阳性血清+荧光标记物;(2) 阴性对照：阴性血清+荧光标记物;(3) 荧光标记物对照：PBS+荧光标记物。
三、免疫荧光双标的经验之谈1、选取一抗时，要求来源于两种不同的动物，我用的是来源于家兔和大鼠的抗体，二抗则是不同荧光信号标记的，我用的是donkey anti-rabbit-FITC(绿)和donkey anti-rat-Tex-Red(红)。
1941年co ons首先用荧光素标记抗体,检测肺组织内的肺炎双球菌获得成功,从而创建了免疫组织化学技术。
经过60余年的不断发展,由最初的直接免疫荧光标记法,逐渐发展出现了间接法,免疫酶法,免疫胶体金法,酶标记复合法等等。
该方法的敏感性和特异性不断得到提高,使其成为医学和生命科学领域中研究组织形态、功能和代谢的一项有力工具[1—3]。
随着该技术应用的普及和深入,免疫组织化学(免疫组化)染色技术作为病理诊断的主要辅助手段,各种新技术的引入以及新抗体相继问世,使免疫组织化学技术得到了更广泛的推广和应用,为临床病理诊断、肿瘤性质的判定、预后的估测等提供了重要依据。
但是,由于影响其操作的因素较多,免疫组化质量不稳定常常困扰着免疫组化工作人员。
本文举出了一些染色过程中出现的问题,并分析其中可能原因。
1.阴性反应染色结束后,切片中见不到任何阳性信号。
排除掉组织或细胞中确实不表达与抗体相关的抗原的原因外,还可能是染色过程中的某一或某些环节出了问题,出现了假阴性结果。
可能原因如下:1.1操作失误有的组织必须经过抗原修复才能检测抗原表达,却未进行抗原修复[1,2];或选用了只能用于冰冻组织而不能用于石蜡包埋组织的抗体;或一抗失效,也可见于染色过程中漏掉了某一环节;还可能是所选用的检测系统与一抗不匹配,如选用的一抗是兔源性抗体,二抗错选了抗鼠源性抗体。
解决办法:在三抗孵育结束时,将切片上的三抗滴在一张白纸上,再将配制好的DAB滴在白纸的三抗上,观察是否出现棕色。
如果出现了,证明三抗和DAB的配制过程正确。
如果不出现棕色反应,则三抗或DAB的配制过程有误。
1.2假阴性造成假阴性结果的因素一般来自三方面:1.组织处理不当,抗原损失过多或被遮蔽;2.抗体(包括特异性一抗和标记抗体)失活,效价过低或稀释度不合适;3.染色步骤的差错或其他试剂的问题,如显色剂、缓冲液的离子强度及ph值[3]。
解决阴性染色的问题,需要设立“阳性对照”和“阴性对照”。
免疫荧光法(免疫细胞化学)免疫荧光法（免疫细胞化学）免疫荧光法，也称为免疫细胞化学，是一种用于检测和定位特定分子在细胞或组织中的分布的技术。
该方法利用荧光标记的抗体与目标分子结合，通过显微镜观察荧光信号的发射来确定其位置。
本文将介绍免疫荧光法的基本原理，实验步骤和应用领域。
一、基本原理免疫荧光法依赖于抗原与抗体的特异性结合。
在免疫细胞化学中，荧光标记的抗体与靶分子结合后，可以通过激发荧光，从而使得靶分子在细胞或组织中可见。
这种荧光标记可以通过直接结合或间接结合实现。
直接结合法是将荧光染料直接与抗体结合，制备成荧光标记的抗体。
这种方法操作简单，适合用于单一标记物的检测，但可能导致染色反应无法控制甚至给靶分子造成损伤。
间接结合法则是利用第二抗体与一抗体结合，然后再将第二抗体与荧光标记结合。
这种方法可以使用多个不同的抗体，并能将多个目标同时检测，具有高度特异性和灵敏度。
但是，操作过程相对繁琐，需要较长时间。
二、实验步骤1. 样本制备：取得所需检测的细胞或组织样本，处理好固定和预处理的步骤。
例如，细胞需经过固定、渗透、洗涤等操作，组织则需进行切片和脱水等步骤。
预处理的目的是为了提高抗体的结合效率和信号强度。
2. 抗体染色：将标记了荧光的一抗体或一抗体与标记物结合的复合物加到预处理好的样本上，充分孵育，以实现抗原和抗体结合。
3. 清洗：将标本进行适当的冲洗，使未结合的抗体、标记物等被去除。
4. 结果观察：将标本放置在荧光显微镜下观察，通过不同波长的光源激发和发射荧光信号。
5. 形态学观察：根据样本的特点、形态学特征及标记染色的荧光信号，判断目标分子的定位和表达情况。
三、应用领域免疫荧光法在生物医学和生命科学领域中得到了广泛应用。
以下是其主要应用领域的一些例子：1. 免疫细胞凝集试验：用于检测抗原与抗体间的反应，如血型鉴定等。
2. 免疫组织化学：通过检测和定位特定分子在组织中的分布，来研究疾病的发生和发展机制，如肿瘤标记物的检测等。
免疫荧光（单标和双标）注意事项及具体方法一、技术简介免疫荧光细胞化学是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光素制成荧光标记物，再用这种荧光抗体（或抗原）作为分子探针检查细胞或组织内的相应抗原（或抗体）。
在细胞或组织中形成的抗原抗体复合物上含有荧光素，利用荧光显微镜观察标本，荧光素受激发光的照射而发出明亮的荧光（黄绿色或桔红色），可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质、定位，以及利用定量技术测定含量。
将不影响抗原抗体活性的荧光色素标记在抗体（或抗原）上，与其相应的抗原（或抗体）结合后，在荧光显微镜下呈现一种特异性荧光反应。
二、实验流程免疫荧光单标记方法免疫荧光单标记是指只标记一种蛋白质分子，方法比较简单，只要按照染色步骤去做，通常不存在太多的问题。
但要注意固定液的选择，固定液选择的合适与否，可能会直接影响染色结果。
具体染色方法如下。
1. 所需材料与试剂：a. 培养在盖玻片或玻璃培养皿中融合程度达到60%-70%的细胞。
b. 一抗、FITC或TRITC标记的二抗。
c. 4%多聚甲醛固定液或冷丙酮固定液 (-20℃预冷20 min)。
d. 封闭液。
e. 0.01mol／LPBS缓冲液。
2. 染色方法：a. 取出培养有细胞的盖玻片或glass-bottom培养皿，用0.01MPBS洗2-3遍。
b. 加入0.3%的Tritonx-100，37℃，30 rain。
c. 加入4%多聚甲醛试问固定30 min或冷丙酮4℃固定10 min。
d. 正常阻断血清1:20封闭试问20-30 min，抑制IgG的非特异性结合。
阻断血清必须选择与二抗同一种属的正常血清。
e. 去掉正常血清，直接加入一抗，37℃孵育1 h或4℃过夜。
抗体以0.01mo/LPBS稀释（理想的抗体浓度需经试验而定）。
f. 用0.3% TritonX-100洗5 min，0.01 mol/IPBS洗5 min，0.3% TritonX 5min，0.01 M PBS洗5 rain。
荧光免疫组织化学技术一、概述荧光免疫组织化学技术（Fluorescent Immunohistochemistry，简称IHC）是一种用来检测组织中特定蛋白质表达及其定位的重要工具。
通过使用荧光标记的抗体与组织标本中的特定抗原相结合，荧光免疫组织化学技术能够提供可视化的结果，有助于研究人员深入了解细胞和组织中蛋白质的表达模式与定位。
本文将从多个方面介绍荧光免疫组织化学技术的原理、应用、优缺点以及对研究领域的意义。
二、原理荧光免疫组织化学技术的原理基于免疫印记反应和荧光探针的特性。
待检组织标本经过特定处理，包括固定、脱水和脱脂等步骤，以保持其形态和结构。
采用特异性的抗体与目标抗原结合，形成免疫复合物。
接下来，引入荧光标记的二抗与免疫复合物发生特异性结合，形成荧光信号。
在荧光显微镜下观察和分析荧光信号，以获得有关目标抗原在组织中表达和定位的信息。
三、应用领域荧光免疫组织化学技术广泛应用于生物医学研究和临床诊断领域。
在基础研究中，荧光免疫组织化学技术被用于研究组织生物学过程、发育学、疾病发生机制等。
通过定量和定位分析蛋白质的表达和定位，可以帮助科研人员深入了解蛋白质与常见疾病之间的关系。
在临床诊断中，荧光免疫组织化学技术可以用于医学实验室中针对疾病相关标志物的检测，如癌症标记物、免疫学指标等。
荧光免疫组织化学技术的高灵敏度和高特异性使其成为现代医学诊断技术中不可或缺的工具。
四、优点与挑战1. 优点：（1）高灵敏度：荧光免疫组织化学技术具有较高的灵敏度，能够检测到很低浓度下的目标抗原。
（2）高特异性：通过选择性地使用荧光标记的抗体与目标抗原结合，可以提供高度特异的检测结果。
（3）可视化结果：荧光免疫组织化学技术能够提供清晰的可视化结果，有助于研究人员直观地观察和分析目标抗原的定位和表达情况。
2. 挑战：（1）非特异性背景信号：在使用荧光免疫组织化学技术时，可能会出现非特异性背景信号，干扰对目标抗原信号的准确分析。
免疫组织化学（Immunohistochemistry，简称IHC）和免疫荧光染色（Immunofluorescence，简称IF）是两种常用的免疫细胞化学技术，用于在组织切片或细胞涂片上检测特定蛋白质或抗原的存在和分布。
这两种技术都依赖于抗体与抗原之间的特异性结合反应。
免疫组织化学是一种使用酶标记抗体来检测抗原的方法。
在这个过程中，首先将组织切片与特定的初级抗体（针对目标抗原的抗体）孵育，然后洗涤以去除未结合的抗体。
接下来，将切片与带有酶标记的次级抗体（针对初级抗体的抗体）孵育。
再次洗涤后，加入酶的底物，它会在酶的作用下产生颜色沉淀，使得抗原的位置在显微镜下可见。
常用的酶包括过氧化物酶和碱性磷酸酶。
这种方法的优点是可以产生永久性的记录，因为颜色沉淀是稳定的。
免疫荧光染色则涉及使用荧光染料标记的抗体来检测抗原。
在这个过程中，初级抗体和次级抗体都带有荧光标记。
当这些抗体与抗原结合时，它们发出的荧光可以在荧光显微镜下观察到。
这种方法的优点是可以同时使用多种颜色的荧光染料来检测多个不同的抗原，而且荧光信号通常比免疫组织化学的颜色反应更强。
两种技术都有其应用范围。
免疫组织化学常用于病理学诊断，因为它可以用于存档的组织样本，并且结果可以用常规显微镜观察。
而免疫荧光染色则更适合于研究目的，特别是在活细胞成像和多标记实验中，因为它可以提供更丰富的信息和更高的灵敏度。
总之，免疫组织化学和免疫荧光染色都是强大的工具，它们使得科学家能够在细胞和组织水平上可视化蛋白质的表达和定位。
选择哪种技术取决于实验的具体需求和可用的设备。
免疫荧光组织化学法
免疫荧光组织化学法是一种通过荧光素非同位素或荧光染料来标记物质结构的方法。
它的主要原理是利用抗体与特定抗原相互作用的特性，将标记信号输出到需要检测的组织中，从而实现对组织的检测。
1.取得试样组织，切成合适的大小并固定。
2. 在抗原取向的芯片上选择合适的抗体，将其加入到试样组织中，等待抗体与试样
组织中的抗原相互作用。
3. 将芯片经过多次洗涤，去除非特异性结合物质，保留与试样特异性结合的抗体。
4. 加入荧光素标记的二抗素，等待其与特异性抗体发生结合。
5. 经过多次洗涤，去除未结合的二抗素。
6.将芯片置于显微镜下，利用荧光显微镜观察，通过检测荧光信号，确定目标物质的
位置、含量和分布情况。
1. 荧光素非同位素或荧光染料具有较强的荧光发射度，对于极小量的试样也能形成
较强的荧光信号，提高了检测灵敏度和分辨率。
2. 免疫荧光组织化学法无需切片和染色处理，可以保留试样的原始形态和构成信息，避免了染色造成的信息丧失和误判。
3. 抗原抗体的结合方式为特异性结合，可对单一的分子或组分进行检测。
4. 可以同时对多种抗体或标记物进行检测，方便多因素检测。
5. 操作简便，检测速度快，适用于大样本、高通量的试验。
尽管在某些情况下，免疫荧光组织化学法也具有其局限性，例如存在背景荧光、抗体
的交叉反应、荧光素的褪色等问题，但其实验过程清晰简单，数据处理方便易行，目前在
医学、生物学领域得到了广泛应用。
目录：1.常用于免疫荧光组织化学染色的荧光素 (1)2.免疫荧光组织化学基本原理及荧光抗体再染色 (2)3.免疫荧光组织化学技术的荧光…………………………………….3,44.免疫组织化学染色结果评价 (4)5.免疫组织化学对照实验 (5)6.免疫组织化学技术应用的基本原则……………………………….5,67.SABC法与其他免疫组织化学染色方法比较…………………….6,78.免疫组织化学技术疑难问题剖析………………………………….7,89.免疫荧光组织化学基本原理及荧光抗体再染色…………………8,910.非特异性荧光染色的消除 (9)11.荧光显微镜的基本操作及注意事项……………………………..9,1012.补体法免疫荧光组织化学染色步骤……………………………11,1213.双重染色法免疫荧光组织化学染色步骤 (11)14.间接法免疫荧光组织化学染色步骤 (12)15.双重免疫荧光标记法 (13)16.免疫荧光组织化学直接法 (13)17.免疫荧光组织化学间接法 (14)1.常用于免疫荧光组织化学染色的荧光素常用于免疫荧光组织化学染色的荧光素有：异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)、四甲基异硫氰酸罗丹明(tetramethyl rhodamine isothioeyanate，TRITC)、四乙基罗丹明(tetraethyl rhodamine B200，RB200)、得克萨斯红(Texas red)、藻红蛋白(phycoerythrin，PE)、花青类(cyanine，如Cy3、Cy5)等。
此外还有一些新型荧光染料，如量子点。
(1)异硫氰酸荧光素(FITC)：FITC性质稳定，易溶于水和乙醇，能与蛋白质结合，是检测组织细胞内蛋白质最常用的荧光探针。
它还能标记抗体，可用于免疫组织化学单染或多重染色。
缺点是在光照下易淬灭，易受自发荧光影响。
最大激发光波长为490nm；最大发射光波长为525nm，呈现黄绿色荧光。
(2)四甲基异硫氰酸罗丹明(TRITC)：该荧光素能与细胞内蛋白质结合，比FITC稳定性好，在生理条件下对pH值变化不敏感，荧光强度受自发荧光干扰小。
最大激发光波长为550nm；最大发射光波长为620nm，呈橙红色荧光，与FITC发出的黄绿色荧光对比鲜明，常用于免疫荧光组织化学双重染色。
(3)四乙基罗丹明(RB200)：能与细胞内蛋白质结合，不溶于水，易溶于乙醇和丙酮，性质稳定，可长期保存，广泛应用于双标记示踪染色。
最大激发光波长为570nm，最大发射光波长为595-600nm，呈橙红色荧光。
(4)花青类染料：常用的有Cy3、Cy5等，能与细胞内蛋白质结合。
这类染料的荧光特性与传统荧光素类似，但水溶性和对光稳定性较强，荧光量子产率较高，对pH等环境不敏感。
常用于多重染色。
Cy3最大激发光波长为570nm，最大发射光波长为650nm，呈绿色荧光。
但是，在绿光光谱波长激发下，Cy3也可出现红色荧光。
Cy5的最大激发光波长为649nm，最大发射光波长为680nm，呈红色荧光。
由于Cy5的最大发射波长为680nm，很难用裸眼观察，而且不能使用高压汞灯作为理想的激发光源，因此，使用普通荧光显微镜时，不推荐使用Cy5。
通常观察Cy5时需使用激光扫描共聚焦显微镜。
(5)乙酸甲酯：其本身不发荧光，但透膜进入细胞质后，在酯酶的作用下转变为具有荧光特性的乙酸甲酯。
其激发光谱有pH依赖性，是使用最多的细胞内pH荧光指示剂。
最大激发光波长为505nm，最大发射光波长为530nm，呈绿色荧光。
(6)Indo-1：是典型的双发射荧光探针。
无钙时在485nm左右有发射峰，结合钙后，则在405nm处有发射峰，两者的比值与细胞内游离钙离子浓度成线性关系，将此比值与标准曲线相比即可得出细胞内游离钙浓度，因此，可利用此探针定量检测细胞内游离钙离子浓度。
最大激发光波长为330/346nm，最大发射光波长为405/485nm，呈紫色(405nm)或青色(485nm)荧光。
(7)量子点(quantum dot)：是近年来研制的一种新型荧光染料，又称半导体纳米晶体(semiconductor nanocrystal)，是由几百或几千个纳米级颗粒构成的半导体材料，性质稳定，溶于水，细胞本身不能合成和组装。
量子点具有荧光时间长、产生多种颜色、检测方便和应用范围广等优点。
当某一波长的激发光对多种大小不同的量子点进行照射时，可以同时观察到多种颜色，因而可同时进行多个目标的观察和检测。
量子点可与抗体、链霉亲和素等多种分子进行耦联，检测靶分子的分布和功能。
2.免疫荧光组织化学基本原理及荧光抗体再染色免疫荧光组织化学(immunofluorescence histochemistry)或免疫荧光细胞化学(immunofluorescence cytochemistry)是将荧光作为标记物的免疫组织化学技术。
1942年，Coons等首次报道用异硫氰酸荧光素(FITC)标记抗体，检查小鼠组织切片中的可溶性肺炎球菌多糖抗原，从此开创了免疫荧光组织化学技术的先河。
随着荧光标记技术和单克隆抗体技术的不断发展和激光扫描共聚焦显微镜的应用，使免疫荧光组织化学的特异性、快速性和在细胞、分子水平定位的敏感性与准确性大大提高。
它能将生物样品形态、功能和代谢密切结合，在细胞、亚细胞水平原位检测抗原分子，这是其他任何生物技术难以取而代之的。
故目前免疫荧光组织化学技术已成为生物学、基础医学和临床医学各学科领域常用研究方法之一。
免疫荧光组织化学技术是用免疫荧光技术检测细胞或组织内抗原或半抗原物质的方法。
根据抗原抗体反应原理，先将已知抗体(或抗原)标记荧光素制成荧光标记物，再用这种荧光标记物作为分子探针与组织细胞内的相应抗原(或抗体)反应，在细胞或组织中形成含有荧光素的特异性抗原抗体复合物，这种复合物上的荧光素受激发光照射而发出各种颜色荧光，利用荧光显微镜观察，即可对组织细胞中的抗原或抗体进行定性、定位乃至定量研究。
蛋白质、多肽、核酸、酶、激素、磷脂、多糖、受体及病原体等，凡能作为抗原或半抗原的物质均可用免疫荧光组织化学技术检出。
若切片或其他标本经某种荧光抗体染色后，未获得阳性结果，而又疑有另外的病原体存在时，可用相应的荧光抗体再染色。
有时存档蜡块不能再用以切片，可用存档的HE染色标本，褪去盖片和颜色，再进行免疫荧光或其他免疫细胞化学染色。
3.免疫荧光组织化学技术的荧光荧光(fluorescence)是某些物质被一定波长的光(如紫外光)照射后能发射出一种比激发光更长的光。
光的吸收具有高度选择性，即一定能量的光量子辐射，只能被一定结构的物贡分子或原子所吸收，如石英玻璃几乎不吸收可见光，但有较强的吸收红外光作用。
利用物质对光吸收的高度选择性，可制成各种滤片(如荧光显微镜中的激发滤片和阻断滤片)，吸收一定波长范围的光或允许特定波长的光通过，用来激发不同的荧光素，产生不同颈色的荧光。
茧光产生示意圈荧先显微镜中常用光的波长与颜色的关系4.免疫组织化学染色结果评价对免疫组织化学染色所得结果的判断要持科学态度，根据对照实验准确判断阳性和阴性结果，排除假阳性和假阴性结果。
为使实验结果准确无误，应多次重复进行实验。
最后得出科学的结论。
为达此目的，首先应学会区别特异性和非特异性染色结果。
非特异性染色的特点是：细胞和间质染色无区别或间质染色更强；染色无特定部位，无结构性；染色五分布规律，某一部位均匀着色；染色出现在切片的干燥部位、边缘、刀痕或组织折叠处。
排除非特异性染色之后，应确定特异性染色在组织细胞中的部位和程度，并且考虑是否有必要进行半定量测定。
《一》以抗原表达模式定位1．细胞质内弥散性分布，多数免疫组织化学染色为胞质型阳性反应，如细胞角蛋白(Cytokeratin，CK)和波形蛋白(Vimentin)等。
免疫组织化学染色(SP法。
AEC显色)胚胎12天人员端脑背侧脑室区司见波形蛋L(Vimentin)免疫反应阳性细胞：其胞体位于脑室区。
一端伸出长突起到达软脑膜2．细胞核周边胞质内分布，其判别要点是细胞核轮廓被勾画得很清楚，如CD3多克隆抗体的染色。
3．胞浆内局限性点状阳性反应，如CDI$抗体的染色。
4．细胞膜线性阳性反应，大多数淋巴细胞标志物的染色均如此，如CD20。
5．细胞核阳性反应，如BrdU、Ki-67及雌、孕激素受体蛋白等。
有些抗原的阳性表达可同时出现在细胞的不同部位，如细胞质和细胞膜等。
《二》阳性染色结果定量1．计算免疫反应阳性细胞数方法是选择每个样品中10个非重叠视野，计算每个视野中的阳性细胞与总细胞数的百分比，取平均数，连续观察和计算至少二个条件相同的样品。
得出数据经统计学处理后可在计算机Microsoft Excel中作出柱形图。
2．另一种方法以染色阳性强度和阳性检出率相结合而定，一般阳性细胞数在0～25为阴性，25～50为+，50～75为++，75以上为+++。
此种判定方法容易出现人为误差，现已很少在论文中出现。
3．图像分析系统检测阳性结果。
5.免疫组织化学对照实验由于影响免疫组织化学染色结果的因素甚多，染色中必须有对照实验，否则不可能正确评价染色结果。
对照实验包括阴性对照、阳性对照和自身对照。
在实践中可用染色组织切片中不含抗原的组织作为阴性对照．而用含抗原的正常组织作阳性对照，这种自身对照具有节约的意义。
观察染色结果时，先观察对照组织的结果，如阳性对照组织中阳性细胞呈强阳性，阴性对照细胞呈阴性，内源酶阴性，背景无非特异性染色时，表明本次实验的全部试剂和全过程技术操作准确无误，待检组织中的阳性细胞具有可信性。
免疫组织化学染色中对照片的设置非常重要．它是判断染色是否成功的关键依据，而且也是检测每一个抗体的质量标准。
常设的对照实验如下。
对照实验方法和结果分析6.免疫组织化学技术应用的基本原则免疫组织化学染色在生物医学研究中具有十分广泛的作用。
并且涉及许多研究领域。
但是，免疫组织化学技术也有其局限性，例如，组织细胞内的待测物质要有抗原性，而且需要有一定浓度方可检出；检出的免疫反应阳性蛋白不能被确定是细胞新合成的蛋白还是通过细胞间运输而来的蛋白，因此，在实验设计中应充分考虑这些特点。
如果实验需要证明已知蛋白为何种细胞合成，需采用分子原位杂交技术解决。
为引导初学者在实验设计中合理巧妙地运用免疫组织化学技术，将其应用的基本原则简述如下：1．确定细胞类型和形态组织细胞内有些蛋白具有组织特异性，如胶质原纤维酸性蛋白(gial fibrillary acidic protein，GFAP)只存在于星形胶质细胞内．神经丝蛋白(Neurofilament，NF)只存在于神经细胞内。
通常把这些具有组织特异性的蛋白称为标记性蛋白(Proteiniliaker)。
