免疫组织化学SABC法

免疫组化原理、步骤及要注意的事项免疫组化一，免疫组织化学简介免疫组织化学又称免疫细胞化学，是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应炕原进行定性、定位、定量测定的一项新技术。

它把免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙地结合起来，借助显微镜(包括荧光显微镜、电子显微镜)的显像和放大作用，在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质(如蛋白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等)。

二，免疫组化技术的基本原理免疫组化技术是一种综合定性、定位和定量；形态、机能和代谢密切结合为一体的研究和检测技术。

在原位检测出病原的同时，还能观察到组织病变与该病原的关系，确认受染细胞类型，从而有助于了解疾病的发病机理和病理过程。

免疫酶组化技术是通过共价键将酶连接在抗体上，制成酶标抗体，再借酶对底物的特异催化作用，生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，于普通显微镜或电镜下进行细胞表面及细胞内各种抗原成分的定位，根据酶标记的部位可将其分为直接法（一步法）、间接法（二步法）、桥联法（多步法）等，用于标记的抗体可以是用免疫动物制备的多克隆抗体或特异性单克隆抗体，最好是特异性强的高效价的单克隆抗体。

直接法是将酶直接标记在第一抗体上，间接法是将酶标记在第二抗体上，检测组织细胞内的特定抗原物质。

目前通常选用免疫酶组化间接染色法。

三，免疫组化步骤1，切片，烤片60℃，1h；2，脱蜡及复水二甲苯10min，100％乙醇5min，95％乙醇5min，90％乙醇5min，85％乙醇5min，80％乙醇5min，75％乙醇5min，60％乙醇5min，50％乙醇5min，30％乙醇5min，自来水1min，双氧水1min；3，1份30％H2O2加10份蒸馏水，室温10min，蒸馏水洗3次，每次3min；4，微波修复将切片浸入0.01M枸橼酸缓冲液，微波中最大火力（98℃-100℃）加热至沸腾，冷却（约5-10min），反复两次；5，将切片自然冷却至室温，PBS洗涤3次，每次5min；6，封闭，5％BSA，室温20min，甩去多余液体；7，滴加一抗，37℃，1h，或者4℃过夜；8，PBS洗涤3次，每次3min；9，滴加二抗，37℃，15-30min；10，PBS洗涤3次，每次3min；11，滴加SABC，37℃， 30min；12，PBS洗涤3次，每次5min；13，1ml蒸馏水中分别滴加显色剂，混匀；14，DAB显色剂配置好后，滴加于切片，室温，镜下检测反应时间（约5min）；15，自来水冲洗干净，过蒸馏水；16，苏木素复染2min，自来水冲洗；17，脱水30％乙醇3min，50％乙醇3min，70％乙醇3min，80％乙醇3min，90％乙醇3min，95％乙醇3min，100％乙醇3min，二甲苯20min；18，树胶封片，镜检。

免疫组化sabc法原理免疫组化SABC法原理免疫组化（Immunohistochemistry，IHC）是一种利用抗体和免疫反应来检测组织样本中特定蛋白质的方法。

免疫组化技术的发展为研究细胞和组织中蛋白质的表达和定位提供了一种有效的手段。

在免疫组化技术中，SABC法（Streptavidin-Biotin Complex）是一种常用的放大方法，用于增强目标抗原的检测信号。

SABC法的原理是通过将抗原特异性的一抗与生物素化的二抗结合，再利用亲和力很强的鸡蛋白素-链霉亲和素（Streptavidin-biotin）结合系统，将生物素与酶或荧光染料等标记物连接起来，从而使目标抗原能够被可视化。

具体而言，SABC法分为四个步骤：抗原修复、阻断、一抗孵育和二抗孵育。

首先是抗原修复，组织样本通常需要进行抗原修复处理，以恢复抗原的免疫活性。

抗原修复的方法包括热处理、酶解和酸性处理等。

接下来是阻断步骤，目的是阻止非特异性结合。

通常使用的阻断剂包括牛血清蛋白（BSA）、小鼠血清、马血清和羊血清等。

然后是一抗孵育，将具有特异性的一抗与待检测的抗原结合。

一抗可以是单克隆抗体或多克隆抗体，具体选择取决于实验的需求。

最后是二抗孵育，将生物素化的二抗与一抗结合。

二抗通常是兔源抗小鼠IgG的抗体，也可以是其他动物源的抗体。

生物素化的二抗通过亲和力结合到一抗上，形成免疫复合物。

在SABC法中，生物素与酶或荧光染料等标记物结合，常用的酶标记有辣根过氧化物酶（HRP），荧光标记有荧光素酶（FITC）和罗丹明（Rhodamine）等。

这些标记物能够使抗原产生可见的颜色或荧光信号。

在目标抗原上添加底物，使酶催化底物产生可见的颜色反应，或者直接观察荧光信号。

通过显微镜观察或图像分析系统，可以定量分析目标抗原的表达和定位。

免疫组化SABC法具有高度特异性和敏感性，能够定量检测目标抗原在组织中的表达水平和定位。

它在研究细胞生物学、病理学和分子生物学等领域发挥了重要作用。

应用SABC法进行免疫组化染色的体会SABC（Strept Actividin-Biotin Complex）法是一种显示组织和细胞中抗原分布的简便而敏感的免疫组化染色方法。

由于该方法中的链霉亲和素的等电点接近中性（pH=6.0-6.5），对组织和细胞的吸附性特别低，因而具有较低的背景。

它的步骤与其他免疫组化染色基本相似，有良好的可操作性。

尽管SABC法操作简便，敏感性强，但是，在操作中仍然要遵循一定的原则，才能得到可信度高的结果。

我所做的是《……》（题目略去，是2003年获国家自然科学基金专项基金项目，批准号：302400**）的动物实验部分。

其中，需要利用抗β1-integrin观察深Ⅱ度烫伤大鼠局部在微电流治疗后β1-integrin的分布情况。

应用的方法就是SABC法，试剂盒（即用型）来自博士德公司（不是为该公司做广告）。

下面就按照实验步骤，谈一下我的一些体会。

1、载玻片防脱片剂处理：应用多聚赖氨酸涂片时，应使用塑料容器稀释多聚赖氨酸，防止多聚赖氨酸过多吸附于容器上，在染色时出现脱片现象。

2、切片常规脱蜡至水：二甲苯虽然可以反复使用，但次数不宜多。

乙醇的浓度是从高到低，与脱水时相反。

3、灭活内源性酶：博士德推荐应用3%的双氧水，但实际操作中，使用30%双氧水和纯甲醇按1:9的溶剂比混合较为理想。

4、抗原修复：由于β1-integrin在细胞膜上表达，因此没有必要进行热修复抗原或者微波修复抗原，只用到了抗原修复液。

5、正常山羊血清封闭：封闭时应该注意室温与时间的相对关系。

室温低，时间就要长一些，反之亦然。

另外，保持反应池湿润是重要的一环，否则，前功尽弃。

后面的步骤也是如此。

6、一抗（抗β1-integrin）反应：一抗的稀释度、孵育时间和温度与染色强度与背景有直接关系。

一般说来，阳性染色强度不够时，可提高一抗浓度和延长孵育时间；背景过高时则相反。

一抗的浓度：这需要自行探索，虽然试剂公司给出了参考浓度，但仍然要探索出恰当的浓度，任何取巧的念头都是在自讨苦吃。

sabc免疫组化法SABC免疫组织化学法（Streptavidin-Biotin Complex Immunohistochemistry）是一种常用的免疫组织化学技术，于1980年由Hsu等人首次提出，其基本原理是利用亲合素-生物素结合系统来增强免疫反应的信号和灵敏性。

该技术广泛应用于组织病理学和细胞生物学领域，用于检测和定位各种细胞和组织中的抗原或分子标记物，具有高灵敏度和高特异性的特点。

SABC免疫组织化学法的基本步骤如下：1. 样本固定：将待检测的细胞或组织固定在载玻片上。

常用的固定方法包括冰乙酸法、乙醇法和甲醛法等。

2. 抗原修复：由于组织样本在固定过程中可能导致抗原受损或掩盖，所以需要进行抗原修复。

抗原修复的方法有热处理、酶消化和酸碱处理等。

3. 阻断非特异性结合：添加合适的蛋白质阻断液，防止非特异性结合。

4. 一抗孵育：将第一抗体孵育在样本上，第一抗体可以是多种来源，如小鼠单克隆抗体、兔多克隆抗体等，与目标抗原结合。

5. 二抗孵育：将牛、羊或马等动物来源的生物素化的二抗孵育在样本上，二抗的特异性是由于其与人样本中免疫球蛋白的Fc区域结合而实现。

6. ABC复合物孵育：加入经过某种方式标记的ABC复合物，ABC复合物是指由Streptavidin（链霉亲和素A）和生物素化的过氧化物酶（HRP）构成的复合物，通过亲合素与生物素之间的高亲和力实现复合。

7. 标色显色：通过添加染色剂(如DAB)和过氧化氢等试剂，使得过氧化物酶催化反应产生沉积的有色产物。

8. 反应停止：用蒸馏水冲洗玻片，停止显色反应。

9. 后处理及封片：将玻片脱水，用透明剂固定标本，然后盖上封片剂，最后用显微镜观察和分析结果。

SABC免疫组织化学法的优点是具有高灵敏度和高特异性，对于目标抗原的检测和定位有较好的效果。

通过使用链霉亲和素A和生物素结合系统，可以增强免疫反应的信号，提高检测和定位的灵敏性。

此外，该方法简单易行，结果易于解释和分析，广泛应用于组织病理学和细胞生物学领域。

实验5 小鼠脑片免疫组织化学（SABC法）实验一、实验目的了解免疫组织化学实验原理，熟练掌握实验操作步骤。

二、实验原理免疫组织化学技术（Immunohistochemistry）是指用免疫学原理（从组织细胞水平进行抗原和抗体结合），通过特异的抗原抗体反应标记上可见的显示物系统来检查细胞及组织上原位抗原或抗体成分的方法。

一般认为凡具有抗原性或半抗原性物质都可以用免疫细胞化学方法检测并显示出来。

在光学显微镜、荧光显微镜或电子显微镜下观察其性质定位，还可以利用细胞分光光度计、图像分析仪、共聚焦显微镜等进行细胞原位半定量测定。

免疫组织化学的显著特点是特异性强，因为免疫学的基本原理是抗原与抗体“一对一”的特异结合，所以免疫组织化学从理论上讲也是“一对一”的组织细胞中抗原的特定显示。

如角蛋白(keratin)显示上皮成分、LCA显示淋巴细胞成分。

只是当组织细胞中存在交叉抗原时才会出现交叉反应。

敏感性高：在应用免疫组化的起始阶段，由于技术上的限制，只有直接法、间接法等敏感性不高的技术，那时的抗体只能稀释几倍、几十倍，现在由ABC法或SP法的出现，使抗体稀释上千倍、上万倍甚至上亿倍乃至可在组织细胞中与抗原结合，这样高敏感性的抗体抗原反应，使免疫组化的方法越来越方便地应用于常规诊断工作中。

定位准确、形态与功能相结合：虽然聚合酶链反应(PCR)方法已经广泛地应用于疾病的诊断，但由于不能在组织和细胞内进行明确的定位而限制了PCR在病理组织学上的应用。

免疫组化则可在组织和细胞中进行抗原的准确定位，因而可以同时对不同抗原在同一组织或细胞中进行定位观察，这样就可以进行形态与功能相结合的研究，对于病理学研究的深入是十分有意义。

三、实验器材略四、实验步骤1. 载玻片准备将新载玻片置于洗涤剂中煮沸30min，先后用清水和蒸馏水冲洗干净，晾干，放入浓硫酸-重铬酸钾洗液中浸泡12小时，流水冲洗后再用蒸馏水清洗，干燥，在95%的酒精中浸泡24h，擦干。

免疫组化（Immunohistochemistry，IHC）是一种常用的组织学技术，用于检测组织切片中特定蛋白质的表达和定位。

SABC法（Streptavidin-Biotin Complex）是免疫组化中常用的一种放大方法，用于增强目标物抗原与抗体之间的相互作用信号。

SABC法的原理如下：
1. 标本处理：组织切片首先经过脱脂、脱水和抗原修复等预处理步骤，以恢复抗原的免疫表位和提高抗体的渗透性。

2. 抗体结合：将特异性一抗体（primary antibody）加入组织样本中，一抗体会与目标蛋白质的表位结合。

3. 生物素化二抗：加入经过生物素化的二抗体（biotinylated secondary antibody）。

这种二抗体能够识别并结合在一抗体上，产生一抗体-二抗体复合物。

4. 孵育期间的缓冲洗涤：经过一定周期的孵育，使一抗体-二抗体复合物与目标物结合，并去除未结合的二抗体。

5. 锚定生物素化二抗体：加入链霉亲和素（streptavidin）与复合物中的生物素化二抗体结合，形成一抗体-二抗体-链霉亲和素复合物。

6. 辐射性表记物：加入辐射性或发光性标记的链霉亲和素。

这些标记物能够与链霉亲和素结合。

7. 显色/可视化：使用辐射性或发光性探针，对标记的链霉亲和素进行可视化分析，通过显色或成像技术观察标记物的分布。

通过SABC法，可以增强目标蛋白质与抗体之间的相互作用信号，提高免疫组化的敏感性。

链霉亲和素和生物素的高度特异性结合是SABC法的关键步骤，这一复合体结合使得目标蛋白质能够更好地被可视化和检测。

免疫荧光组织化学实验步骤（石蜡切片，SABC法，博士德）第一天：1. 二甲苯Ⅰ脱蜡 20min2. 二甲苯Ⅱ脱蜡 15min3. 二甲苯Ⅲ脱蜡 10min（二甲苯脱蜡时间视温度而定，温度高时间就短，温度低则时间就长）4. 无水乙醇Ⅰ 5min5. 无水乙醇Ⅱ 4min6. 95％酒精 2min7. 90％酒精 1min8. 80％酒精 1min9. 70％酒精 1min10. 石蜡切片过完酒精后，将其浸入蒸馏水中2min。

11.我们采用微波进行抗原修复，将脱蜡水化后的组织切片置于烧杯（或修复盒）中的不锈钢（或耐高温塑料）切片架上，加适量的修复液（0.01M枸橼酸缓冲液，pH6.0）于烧杯中，要浸过切片组织一定高度，微波炉可先用中高档加热使液体沸腾，当加热至沸腾时调到中档，此时开始开始计时，修复时间为10-15min，此过程中勿使组织干片（修复液要足量）。

到时间后将烧杯从微波炉中拿出，放入冷水中冷却降温，当修复液降至室温后取出玻片，用PBS（PH7.4）冲洗3遍，每次3min。

（冲洗过程中切勿对着组织冲洗，以免弄破组织）12. 甩干玻片，用免疫组画笔在组织周围画圈，然后滴加稀释的正常血清封闭，室温30min，以减少非特异性染色。

13. 甩去封闭液，不洗。

每张切片滴加足够量的一抗并放入湿盒，4℃过夜；第二天：14. 37℃复温30min（根据具体情况确定），PBS冲洗3次，每次3min；15. 在玻片上滴加稀释的生物素化二抗，湿盒中20-37℃孵化30min，PBS洗去二抗，3min×3次；16. 在玻片上滴加稀释的SABC-FITC(或SABC-CY3)，湿盒中20-37℃孵化30min，PBS洗5min×4次；17. 滴加 Hoechst 33342（或DAPI）避光孵育5min，可对标本进行染核，PBS 3min×4次洗去多余的Hoechst 33342（或DAPI），用滤纸擦去标本外的PBS；（选做）18. 用含抗荧光淬灭剂的封片液封片，在荧光显微镜下观察。

免疫组织化学实验SABC-HRPPOD法的标准操作规程（SOP）SOP编号：SOP-YK-QT-013-1 页数：3制定人：审核人：批准人：（签名、日期）（签名、日期）（签名、日期）生效日期：颁发日期：修订登记：审查登记：一、目的对细胞中的某种蛋白质或多肽进行定位、定量。

二、准备：1.材料：新鲜组织细胞2.试剂：2.1蒸馏水；PBS（PH7.2-7.6）；30%H2O2；树脂；丙酮；TritonX-1002.2一抗2.3 SABC-HRP试剂盒（SABC-HRPkit）正常血清：与二抗同种的动物血清。

生物素化二抗：亲和纯化抗体，标记长臂生物素SABC液：Strept Avidin-Bioton-Horseradish Peroxidase Complex2.4 3，3-二氨基苯联胺（DAB）2.5苏木精2.6二甲苯，透明Ⅰ、Ⅱ2.7乙醇，上行梯度（100%Ⅰ、Ⅱ，95%，90%，80%，70%）3.器材：盖玻片、微量移液器、移液器吸头、湿盒、染色缸、温箱、免疫组化笔、冰箱、EP管、搅拌器三、操作方法：1.将新鲜组织切片或细胞涂片在4℃丙酮中固定20-30min，晾干。

2.加1% TritonX-100，室温下5-15 min，PBS冲洗2min×3次。

3.0.3% H2O2-甲醛室温下处理标本15-30 min，灭活内源性过氧化物酶，PBS冲洗2min×3次。

4.滴加二抗同种动物来源正常血清封闭液20цl , ( 1:10蒸馏水, 封闭组织上带电荷基团,去除其与一抗的非特异性结合)，室温20 min.甩去多余液体,不洗。

5.滴加一抗( 1:100PBS) 20цl , 4℃过夜。

0.01MPBS洗2min ×3次。

6.滴加二抗(1:100PBS) 20цl , 37℃，20 min。

0.01MPBS洗2min×3 次。

7.SABC液20цl与0.01MPBS 1ml混匀，30 min后取20цl，37℃孵育20 min。

免疫组化的流程多聚赖氨酸溶液（Poly-L-Lysine Solution）Cat.No.: SGP8920 Size: 10mlConc.: 0.1% w/v, in water Storage: 18-26℃Thimerosal, 0.01%, added as preservative多聚赖氨酸溶液是广泛应用的组织切片与玻片黏合剂，该多聚阳离子分子与组织切片上的阴离子相互作用会产生较强的黏合力。

适用组织学，免疫组织化学，冰冻切片，细胞涂片，原位杂交等使用的玻片的防脱片处理，以防实验操作过程中组织掉片。

也可用于细胞培养，增加细胞贴壁能力。

[使用说明]免疫学操作步骤（可直接在玻片上涂布）1．灭菌的ddH2O 1:10稀释该多聚赖氨酸溶液。

2．用之前将稀释的多聚赖氨酸溶液放在室内，使其温度到室温18-26℃3．将玻片浸在稀释的多聚赖氨酸溶液5分钟。

注意增加时间不会提高包被效果。

4．在60℃烘箱1小时干燥，或室温18-26℃过夜干燥待用。

[注意]1．每100mL已稀释的多聚赖氨酸溶液要包被的玻片40-90张，超过90张片子将影响其黏合力。

2．用之前的玻片必须保持清洁。

必要时用含1% HCl的70%乙醇溶液来清洗。

4．释过的多聚赖氨酸溶液要放在2-8℃，至少在3个月内是稳定的。

5．用过的稀释液要过滤，若出现浑浊或长菌要丢弃。

[订货信息]￥100 / 10ml免疫组化操作规程（一）、仪器设备1）18cm不锈钢高压锅或电炉或医用微波炉；2）水浴锅（二）、试剂1）PBS缓冲液（pH7.2～7.4）：NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na2HPO4 4.3mmol/L，KH2PO4 1.4mmol/L。

2）0.01mol/L柠檬酸盐缓冲液（CB，pH6.0，1000ml）：柠檬酸三钠 3g，柠檬酸 0.4g。

3）0.5mol/L EDTA缓冲液（pH8.0）：700ml水中溶解186.1gEDTA·2H2O，用10 mmol/L NaOH调至pH8.0,加水至1000ml。