免疫组织化学技术(ABC法)

常用免疫组织化学染色方法( 一)、ABC法：(注，下面各种方法，均为手工操作，如没特别说明，均在室温下进行)1.切片经二甲苯Ⅰ5分钟。

2.切片经二甲苯Ⅱ5分钟。

3.无水酒精Ⅰ30秒。

4.无水酒精Ⅱ30秒。

5.95%酒精Ⅰ30秒。

6.95%酒精Ⅱ30秒。

7.90%酒精30秒。

8.80%酒精30秒。

9.70%酒精30秒。

10.自来水洗。

(后面的切片脱蜡至水一般都是1-10)11.0.3%H2O2甲醇处理切片10-20分钟。

12.水洗。

13.抗原修复。

14.PBS洗3次，1分钟/次。

15.加入血清孵育20分钟。

16.摔干血清，加入一抗60分钟。

17.PBS洗3次，2分钟/次。

18加入二抗孵育30分钟。

19.PBS洗3次，2分钟/次。

20.加入ABC复合物，孵育30分钟。

21.PBS洗3次，2分钟/次。

22.DAB-H2O2孵育切片5-10分钟。

23.PBS洗，水洗。

24.Harris苏木素染核5-10分钟。

25.水洗，分化，蓝化，脱水，透明并封固。

(二)、LSAB法。

(SP法)(Labelled streptavidim biotln)1.切片脱蜡至水。

2.0.3%H2O2甲醇处理切片10-20分钟。

3.水洗。

4.抗原修复。

5.PBS洗3次，1分钟/次。

6.加入血清孵育10分钟。

7.摔去血清，加入一抗孵育30-60分钟。

8.PBS洗3次，每次2分钟。

加入二抗，孵育20分钟。

9.PBS洗3次，每次2分钟。

10.加入SP复合物孵育20-30分钟。

11.PBS洗3次，每次2分钟。

12.DAB-H2O2孵育5-10分钟。

13.PBS洗，水洗。

14.Harris苏木素染核5-10分钟。

15.水洗，分化，蓝化，脱水，透明并封固。

(三)真空负压LSAB法1.切片脱蜡至水。

2.0.3%H2O2甲醇真空负压处理5min.3.水洗。

4.如果需要，可进行抗原修复。

5.PBS洗3次，每次1分钟。

6.加入正常血清真空负压处理5min。

免疫组化试题参考答案免疫组织化学试题参考答案一、名词解释：1.PAS反应：即过碘酸--雪夫反应显示糖原，简称PAS反应。

其原理是通过利用过碘酸的氧化作用，使糖分子中的二醇基氧化为二醛基，释放出醛基，与碱性品红反应，生成紫红色化合物沉淀。

2.Feulgen法：即福尔根反应显示DNA法。

其原理是组织用1NHCl 60℃水解，将DNA分子中脱氧核糖核酸与嘌呤间的连链打开，使之释放出醛基与碱性品红发生反应，生成紫红色化合物沉淀。

3.PAP法：即过氧化物酶一抗过氧化物酶法，该技术原理与其他免疫定位技术相同，即通过抗体使标记分子（抗辣根过氧化物酶）定位于抗原附件。

其不同点为三步法，且有放大作用，反应彻低依靠于免疫学结合，不需要标记任何抗体，反应敏捷度高，背景低。

注重一抗与复合物中的抗体必需来源于同一种动物，且二抗必需过剩。

4.核酸探针：指能与特定核酸序列发生特异性互补的已知标记的核酸片段，可检测待测样品中特定的基因序列。

无标记的探针称裸探针。

5.核酸分子杂交：指具有互补序列的两条核酸单链在一定条件下按碱基配对原则形成双链的过程。

杂交的双方分离为待测的核酸序列和已知核酸序列，后者通常用核素或非核素示踪标记，称为探针（probe），杂交后形成的异源双链分子称为杂交分子。

6.质量控制：指组织化学反应各环节中获得最佳效果的技术掌握，是组织化学的关键环节，是取得惬意效果的须要条件，是提高结果可信度的根本保证。

7.诱发荧光：组织细胞中的某些物质本身不发荧光，但在经过一定的化学反应后可以改变成荧光分子。

此技术目前主要应用在生物胺的显示中。

其中最重要的是甲醛和乙醛酸诱发多巴胺、去甲肾上腺素、肾上腺素和5—羟色胺荧光，以及邻苯二醛诱发组织胺荧光的反应。

8.定量分析：定量推断是结果推断中最重要也是具故意义的推断，其推断结果有助于统计学的分析处理。

组织细胞化学结果的定量分析又称定量组织细胞化学，指在组织细胞化学阳性结果的基础上，对阳性结果（终于阳性产物）举行测量，以数值反应被检测物质的含量。

免疫组化abc法名词解释
免疫组化ABC法是一种用于检测蛋白质在组织切片中表达的方法。

这种方法通常用于病理学研究和临床诊断中。

ABC法的全称是Avidin-Biotin Complex法，它利用了生物素和亲和素之间的特异性结合来实现对蛋白质的检测。

在ABC法中，首先需要利用一种特异性的抗体来与待检测的蛋白质结合。

这个抗体通常被称为一抗，它可以识别并结合到特定的蛋白质上。

接下来，将生物素标记的二抗加入样本中，这些二抗能够与一抗结合。

然后，将含有酶的生物素-链霉素复合物（ABC）加入样本中，这个复合物可以结合到二抗上。

最后，加入染色底物，这样就可以通过显色反应来观察蛋白质的表达情况。

ABC法的优点包括灵敏度高、特异性好、操作简便等，因此被广泛应用于免疫组化实验中。

然而，也需要注意到ABC法在操作过程中可能存在的非特异性结合和背景信号的问题，需要进行严格的实验控制和数据分析。

总的来说，免疫组化ABC法是一种重要的实验技术，它通过利
用生物素和亲和素的结合特性，能够有效地检测组织切片中蛋白质的表达情况，对于研究和诊断具有重要意义。

免疫组化染色步骤(ABC法)第一天：【准备：试剂、37℃恒温水箱打开】1．切片脱蜡：第一排试剂瓶从左至右（二甲苯→Alcohol），二甲苯内浸泡10min，Alcohol 内浸泡5min。

【二甲苯→二甲苯→100% Alcohol→100% Alcohol→95% Alcohol→90% Alcohol→80% Alcohol→70% Alcohol】2．TBS洗10 min×3，置摇床上。

3．【注意避光】用0.3% H2O2和0.3%Triton 混合液处理切片30min，置于摇床上。

增加切片渗透性。

【注：H2O2原液是30%，先把Triton溶解在TBS中后，再加入H2O2】4．TBS洗10 min×3，置摇床上。

5．抗原修复：塑料染缸中加入250mL 0.05M Citrate buffer（或0.05M Tris-HCl缓冲液）液，然后放入片子，调至“解冻”档，先微波加热5min（温度升至95o C左右），继续加热10min,中间冷却5min，再加热10min，然后室温冷却20min6．TBS洗10 min×3，置摇床上。

【如果掉片严重，5、6和3、4调换一下】7．将切片取出，组织周围的水分用滤纸吸干，用特制的记号笔（冰箱中，可防止液体流出）在组织周围划上圈后放入湿盒中，并在圈内滴入5%羊血清，做到完全覆盖住组织，然后将湿盒放入恒温水箱（37℃）中20 -30 min。

8．将湿盒取出，把切片上的羊血清轻轻倒掉，用滤纸擦干留下的水道，否则再加入的液体将会沿着水道流出。

加入Ι抗，做到完全覆盖住组织，放入湿盒中，置恒温水箱（37℃）1h。

9．从水箱中取出湿盒，放入4℃冰箱中过夜。

第二天：【准备：37℃恒温水箱打开】10. 取出湿盒（室温30 min，恢复到室温），将抗体倒掉，TBS洗10 min×3，置摇床上。

11.滤纸将圆圈周围的水分吸去，加入相应Π抗，做到完全覆盖住组织，放入恒温水箱（37℃）中1h12. 取出湿盒，将Π抗倒掉，TBS 洗10 min×3，置摇床上。

常用免疫组织化学染色方法( 一)、ABC法：(注，下面各种方法，均为手工操作，如没特别说明，均在室温下进行)1.切片经二甲苯Ⅰ5分钟。

2.切片经二甲苯Ⅱ5分钟。

3.无水酒精Ⅰ30秒。

4.无水酒精Ⅱ30秒。

5.95%酒精Ⅰ30秒。

6.95%酒精Ⅱ30秒。

7.90%酒精30秒。

8.80%酒精30秒。

9.70%酒精30秒。

10.自来水洗。

(后面的切片脱蜡至水一般都是1-10)11.0.3%H2O2甲醇处理切片10-20分钟。

12.水洗。

13.抗原修复。

14.PBS洗3次，1分钟/次。

15.加入血清孵育20分钟。

16.摔干血清，加入一抗60分钟。

17.PBS洗3次，2分钟/次。

18加入二抗孵育30分钟。

19.PBS洗3次，2分钟/次。

20.加入ABC复合物，孵育30分钟。

21.PBS洗3次，2分钟/次。

22.DAB-H2O2孵育切片5-10分钟。

23.PBS洗，水洗。

24.Harris苏木素染核5-10分钟。

25.水洗，分化，蓝化，脱水，透明并封固。

(二)、LSAB法。

(SP法)(Labelled streptavidim biotln)1.切片脱蜡至水。

2.0.3%H2O2甲醇处理切片10-20分钟。

3.水洗。

4.抗原修复。

5.PBS洗3次，1分钟/次。

6.加入血清孵育10分钟。

7.摔去血清，加入一抗孵育30-60分钟。

8.PBS洗3次，每次2分钟。

加入二抗，孵育20分钟。

9.PBS洗3次，每次2分钟。

10.加入SP复合物孵育20-30分钟。

11.PBS洗3次，每次2分钟。

12.DAB-H2O2孵育5-10分钟。

13.PBS洗，水洗。

14.Harris苏木素染核5-10分钟。

15.水洗，分化，蓝化，脱水，透明并封固。

(三)真空负压LSAB法1.切片脱蜡至水。

2.0.3%H2O2甲醇真空负压处理5min.3.水洗。

4.如果需要，可进行抗原修复。

5.PBS洗3次，每次1分钟。

6.加入正常血清真空负压处理5min。

免疫组织化学方法在肺癌病理诊断中的应用
免疫组织化学方法在肺癌病理诊断中起着重要的作用。

通过免疫组织化学方法，可以检测肺癌组织中的特定分子标志物，从而帮助确定肺癌的诊断和分型。

常用的免疫组织化学标记物包括细胞角蛋白、肿瘤标志物、细胞增殖指标等。

例如，通过检测细胞角蛋白的表达，可以确定肺癌的细胞来源和类型。

肿瘤标志物如细胞表面抗原（如
CK7、CK20）和肿瘤相关抗原（如CEA、NSE）的表达可以
帮助区分肺癌的类型和分级。

此外，细胞增殖指标如Ki-67的
表达可以反映肿瘤的增殖活性，有助于判断肺癌的恶性程度。

免疫组织化学方法可以通过染色反应来显示标记物的表达情况。

在肺癌病理诊断中，常用的免疫组织化学染色方法包括免疫组化ABC法和免疫组化热敏法。

这些方法可以通过染色反应的
强度和位置来确定标记物的表达情况，进而判断肺癌的类型和分级。

总的来说，免疫组织化学方法在肺癌病理诊断中具有高灵敏度和高特异性的优势，可以提供更精确的肺癌诊断和分型结果，对于制定个体化治疗方案和预后评估具有重要意义。

免疫组织化学的概念：免疫组化是利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学。

免疫组化实验中常用的抗体为单克隆抗体和多克隆抗体。

免疫组化实验所用的组织和细胞标本有哪些？实验所用主要为组织标本和细胞标本两大类，前者包括石蜡切片（病理大片和组织芯片）和冰冻切片，后者包括组织印片、细胞爬片和细胞涂片。

其中石蜡切片是制作组织标本最常用、最基本的方法，对于组织形态保存好，且能作连续切片，有利于各种染色对照观察；还能长期存档，供回顾性研究；石蜡切片制作过程对组织内抗原暴露有一定的影响，但可进行抗原修复，是免疫组化中首选的组织标本制作方法。

石蜡切片为什么要做抗原修复？有哪些方法？石蜡切片标本均用甲醛固定，使得细胞内抗原形成醛键、羧甲键而被封闭了部分抗原决定簇，同时蛋白之间发生交联而使抗原决定簇隐蔽。

所以要求在进行IHC染色时，需要先进行抗原修复或暴露，即将固定时分子之间所形成的交联破坏，而恢复抗原的原有空间形态。

常用的抗原修复方法有微波修复法，高压加热法，酶消化法，水煮加热法等，常用的修复液是pH6.0的0.01mol/L的柠檬酸盐缓冲液。

免疫组化常用的染色方法有哪些？根据标记物的不同分为免疫荧光法，免疫酶标法，亲和组织化学法，后者是以一种物质对某种组织成分具有高度亲合力为基础的检测方法。

这种方法敏感性更高，有利于微量抗原（抗体）在细胞或亚细胞水平的定位，其中生物素——抗生物素染色法最常用。

抗体的保存：抗体储存容器应由不吸附蛋白质的材料制成，常用的有聚丙烯，聚碳酸酯和硼硅酸玻璃。

如储存的抗体中蛋白浓度很低（10-100mg/L）,就应另加隔离蛋白以减少容器对抗体蛋白的吸附，隔离蛋白常用0.1%-1.0%的牛血清白蛋白。

绝大多数已稀释的抗体应存在4℃-8℃条件下，以免冻融对抗体蛋白产生有害效应。

免疫组化ABC法
1、石蜡切片脱蜡入水
2、蒸馏水洗一下
3、枸橼酸缓冲液微波90℃二遍（间隔3分钟）
4、自然冷却（也可速冷）
5、3%过氧化氢10分钟
（此步骤主要是阻断内原酶，减少背景着色。

用过氧化氢加水1：10稀释，例如：双氧水0.6ml加蒸馏水5.4ml）
6、PBS冲洗三次，每次2-3分钟
7、正常血清封闭10分钟（此步骤主要是阻断非特异性反应，简少背景的着色）
8、不冲洗，擦干周围，加一抗（乳头瘤病毒一抗效价：1：10000）
9、一抗4℃过夜（此步骤主要是显示反应物质）1：100室温40-60分钟
10、PBS冲洗三次，每次2-3分钟
11、加二抗，37℃，30分钟（羊抗兔IgG室温20分钟。

生物素B标记，效价：1：40000）
12、PBS冲洗三次，每次2-3分钟
13、加三抗（SABC）30分钟（室温20分钟）
14、PBS冲洗三次，每次2-3分钟
15、DAB显色（显色时间在镜下控制）
配方：
一、抗原修复液
A液9ml
B液41ml
双蒸水450ml
（A液：枸橼酸2.1g加蒸馏水100ml，B液：枸橼酸钠14.71g加蒸馏水500ml）二、一抗
一张标本 40ul
1：200=X：1500 1：抗体
X= ————=7.5ul 200：稀释倍数
抗体：7.5ul，PBS1450ul 1500：所配试剂毫升数
三、DAB
蒸馏水1ml B+C+A 各一滴。