免疫组织化学常见问题和解决方法

组化常见问题及解决办法当免疫组化染色没有出现预期结果时，应系统地查找原因，而每一次只能排除一种可能的原因。

对照/标本无染色① 确认是否忽略了应该加的某种试剂，包括一抗、二抗、三抗及底物等。

② 确认所有的试剂是否按正确的顺序加入，是否孵育了足够的时间。

③对照抗体的标签确认是否使用了正确的抗体，以及所用的检测系统是否和一抗匹配，这一点是非常重要的。

比如，如果一抗是兔来源的抗体，二抗一定要用抗兔的二抗来匹配；或一抗是小鼠的IgM一抗，二抗必须是山羊/兔抗小鼠的IgM（不是IgG）二抗。

④ 检查抗体所使用的稀释度及稀释溶液。

⑤ 检查抗体的有效期和保存条件，尤其是标记了酶或荧光素的抗体，现在大多数试剂公司的抗体均要求在4~8℃条件下保存，应避免反复冻融，试剂保存时一定要避免与挥发性有机溶剂同放一室，以免降低抗体的效价。

⑥ 检查标本的储存条件，最好用已知阳性的标本来同时做阳性对照。

弱阳性如果阴性对照没有染色而阳性对照标本弱阳性，除了考虑上述因素外，还应考虑：①不适当的抗原修复方式，由于石蜡切片在制作的过程中固定剂对抗原的封闭作用，必须用抗原热修复或酶消化或两种同时使用的抗原双暴露法，至于使用哪一种方法，应参照生产厂家的说明，同时结合标本的具体情况而定。

②切片上遗留了过多的冲洗液，当抗体加至切片上时，等于人为地对抗体进行了进一步的稀释。

③ 抗体的稀释度是否过高或者孵育的温度/时间是否正确。

一般试剂生产厂家都会对试剂给出一定的使用范围，但是由于使用者的标本来自各种组织，处理过程也不尽相同，所以应参照使用范围，对所使用的一抗进行梯度测试，找出最佳的使用浓度。

④孵育时切片是否放置水平，否则会导致抗体流失。

非特异性染色① 是否有效地去除了内源性酶和生物素。

应注意的是，并不是每一种组织均需要进行此步骤，但对于内源性酶或生物素丰富的组织，如肝脏、肾脏等，需考虑此原因。

②一抗的使用浓度是否过高。

③清洗是否充分。

应严格操作规程。

免疫组化关键步骤常见问题和解决方案范文精品论文参考文献1.3脱蜡至水洗中应注意的问题脱蜡液应经常更换，必须保证脱蜡干净，彻底，水洗充分，水洗之后切片应放在蒸馏水中清洗1～2遍，脱蜡不干净，不彻底时，就会出现非特异性着色，影响染色效果，即阳性强度也会减低。

1.4抗原修复中应注意的问题目前常用的抗原修复液有两种：即0.01M柠檬酸缓冲液（PH6.0）和1mM的EDTA缓冲液（PH9.0或PH8.0）.对于一些胞浆阳性或胞膜阳性的抗体，选择柠檬酸缓冲液比较好，而对于一些胞核阳性的抗体，选择EDTA缓冲液比较好。

配置修复液时必须用蒸馏水，否则染色会失败，大部分抗体都会出现假阴性。

抗原修复方法目前比较常用的是高压锅喷气2～3分钟，中火（120℃～140℃）。

自然冷却，如果要节省时间，可用自来水冲洗高压锅外面，等到压力降下，再把高压锅锅盖打开，放在冷水中冷却，中途可换一次水，这样既节省用水，又可节约时间，等到高压锅中水温接近常温，就可直接用自来水冲洗切片[1]。

1.5滴加抗体前和滴加抗体时应注意的问题切片冲洗好后，应放在蒸馏水中，拿出画圈，画圈时应注意圆圈与组织必须保持一点距离，否则会产生边缘效应，即圆圈旁组织会产生非特异性染色。

画好圈后，用PBS冲洗切片，注意画完圈后尽量不要让切片干燥，画完圈后也不能立时冲洗，要等油干燥后再冲洗，否则油就冲掉了，就不能起到防止抗体外溢的效果。

用蒸馏水配置PBS时，需加一些吐温或去垢剂，有利于冲洗的更干净，也有利于滴加完抗体后抗体的弥散速度，抗体弥散速度快，操作简便，节约时间。

一抗孵育可选择37℃温箱1小时或4℃冰箱过夜，而二抗的孵育一般都是室温，添加二抗前和显色前，PBS都必须彻底冲洗干净，否则会产生非特异性着色。

1.6显色时应注意的问题在保证显色液配制浓度准确的情况下，显色时间应严格把握。

当制作大批切片时，可以批量滴加显色液，先用肉眼观察组织是否变黄，若变黄时，可在镜下控制，每种抗体的显色时间，背景着色能都不太一样，具体可在镜下控制，积累经验。

免疫组织化学技术常见问题分析及对策阳性对照标本和待测标本均无着色1. 可能原因分析1.1 抗体选择不当，不适合做IHC。

抗体保存不当，超过有效期或反复冻融导致抗体效价过低或失活。

1.2 抗体工作浓度过低，特别是一抗的浓度过低。

同时也有可能是抗体孵育时间过短、温度偏低。

1.3 二抗与一抗种属不匹配，如一抗为鼠源性抗体，二抗没有使用抗鼠的抗体。

1.4 贴片法IHC染色有可能是抗体流失导致切片干燥。

1.5 石蜡切片未进行抗原修复或酶消化等前处理时间过长破坏了待检测抗原决定簇。

1.6 缓冲液PH值不当或含有酶活性抑制剂，如叠氮钠是过氧化物酶活性抑制剂。

1.7 DAB显色时间过短；显色底物不应该含有叠氮钠；在DAB显色时，显色液应该新鲜配制。

1.8 复染、脱水和封片剂的选择与显色系统不匹配。

1.9 阳性对照标本选择不合适，该标本不含有待检测抗原或与所用一抗试剂不匹配。

2. 处理方法2.1 确认使用抗体的各类抗体试剂的正确保存方法，保证其效价。

如果确认抗体已经失效，及时更换。

2.2 检查二抗是否与一抗种属匹配。

2.3 适当提高抗体浓度，优化孵育条件。

保证抗体孵育箱温度为37℃，或增加孵育时间，如4℃孵育48小时。

2.4 标本孵育盒平稳放置，防止孵育液流失。

2.5 参考文献选择标本类型适合的蛋白酶消化方法和抗原修复处理方式与条件。

2.6 调节缓冲液至对应正常的PH值，保证不含酶活性抑制剂。

2.7 重新配制DAB显色液，并保证配制方法、浓度、正确、有效，适当延长显色时间。

2.8 选择正确的阳性对照切片。

阴性对照标本未着色，而阳性对照标本和待测标本呈弱阳性1. 可能原因1.1 标本固定方式不正确，如固定不及时、固定液量太少、固定液失效或组织处理方式不当。

1.2 抗体保存不当，超过有效期或反复冻融导致抗体效价过低或失活。

1.3 抗体浓度太低，特别是一抗的浓度过低，或者抗体孵育时间过短、温度偏低。

1.4 贴片法染色时标本上含有缓冲液，导致抗体浓度稀释。

免疫组化实验遇到的问题分析及改进方法1石蜡切片在染色过程中出现脱片现象1）烤片时间不够，或温度不够，可以延长烤片时间和提高烤片温度；2）用含有多聚赖氨酸的玻片，可以购买到或这自己做；3）有些组织本身就容易掉片，如骨组织等，操作时冲PBS不要直接冲到组织上，冲到组织上方，让它流下冲洗组织；4）用高温修复时，温度骤冷也可能引起。

2边缘效应1）组织边缘与玻片粘贴不牢，边缘组织松脱漂浮在液体中，每次清洗不易将组织下面试剂洗尽所致。

解决办法：制备优质的胶片（APES或多聚赖氨酸），切出尽量薄的组织切片，不厚于4微米，组织的前期处理应规范，尽量避免选用坏死较多的组织。

2）切片上滴加的试剂未充分覆盖组织，边缘的试剂容易首先变干，浓度较中心组织高而致染色深。

解决办法：试剂要充分覆盖组织，应超出组织边缘2mm。

用组化笔画圈时，为了避免油剂的影响，画圈应距组织边缘3-4mm。

3产生组织切片非特异性染色1）抗体孵育时间过长、抗体浓度高易增加背景着色。

这可通过缩短一抗/二抗孵育时间、稀释抗体来控制。

这是最重要的一条；2）一抗用多克隆抗体易出现非特异性着色，建议试用单克隆抗体看看；3）内源性过氧化物酶和生物素在肝脏、肾脏等组织含量很高（含血细胞多的组织），需要通过延长灭活时间和增加灭活剂浓度来降低背景染色；4）非特异性组分与抗体结合，这需要通过延长二抗来源的动物免疫血清封闭时间和适当增加浓度来加强封闭效果；5）DAB孵育时间过长或浓度过高；6）PBS冲洗不充分，残留抗体结果增强着色，在一抗、二抗或SP孵育之后的浸洗尤为重要；7）标本染色过程中经常出现干片，这容易增强非特异性着色。

4免疫组化染色呈阴性结果1）抗体浓度和质量问题以及抗体来源选择错误；2）抗原修复不全，对于甲醛固定的组织必须用充分抗原修复来打开抗原表位，以利于与抗体结合；建议微波修复用高火4次*6min试试。

有人做过实验，这是最佳的时间和次数。

若不行，还可高压修复；3）组织切片本身这种抗原含量低；4）血清封闭时间过长；5）DAB孵育时间过短；6）细胞通透不全，抗体未能充分进入胞内参与反应；7）开始做免疫组化，我建议你一定要首先做个阳性对照片，排除抗体等外的方法问题。

（完整word版）免疫组化常见问题免疫组化常见问题与回答集锦一、石蜡切片和冰冻切片的比较？1. 要求做冰冻切片的不一定能做石蜡切片，这是我向一老师请教得出的结论。

因为作石蜡切片时要高温烤片，可能会破坏组织的抗原性，如果组织的抗原性较稳定，则可作石蜡切片；但是要求做石蜡切片的，可作冰冻切片。

2. 冰冻切片的优点是能够较好的保存组织的抗原免疫活性，做免疫组化时不需抗原修复这一步。

缺点是细胞内易形成冰晶而破坏细胞结构，可能会使抗原弥散；切片厚度较石蜡的厚，做的片子没石蜡的漂亮。

当你买一抗时，目录上都写着做什么样的切片，如果它写着只能做冰冻，就不能做石蜡，如写着两者都可，那就都能做。

3. 石蜡切片的优点是可以保持组织细胞的形态结构，且容易存放在室温，而冰冻切片比较麻烦，一定要存在-80oC 的低温冰箱中，尤其是用来做原位杂交的切片，为了防止RNA降解，保存一贯很重要。

由于石蜡切片可以切到4 口左右，所以原位杂交探针容易渗透到组织中去，容易成功，而且得到的颜色/形态都较冰冻切片好。

二、一抗的选择要点和技巧是什么？1. 单克隆和多克隆抗体的选择。

由一种克隆产生的特异性抗体叫做单克隆抗体。

单克隆抗体能目标明确地与单一的特异抗原决定簇结合，就像导弹精确地命中目标一样。

另一方面，即使是同一个抗原决定簇，在机体内也可以由好几种克隆来产生抗体，形成好几种单克隆抗体混杂物，称为多克隆抗体。

在抗原抗体反应中，一般单克隆抗体特异性强，但亲和力相对小，检测抗原灵敏度相对就低；而多克隆抗体特异性稍弱，但抗体的亲和力强，灵敏度高，但易出现非特异性染色(可以通过封闭等避免)。

2. 应用范围的选择。

有的一抗只能用于WB ( Western blotting )或免疫组化、免疫荧光、免疫沉淀等；甚至表明石蜡切片或冰冻切片。

3. 种属反应性的选择。

这一点很重要，表明这种抗体可能存在种属差异，且这种抗体适合检测哪种种属动物体内的抗原。

4. 种属来源，一般兔来源的多是多克隆；而小鼠来源的多是单克隆，但也有另外。

免疫组织化学技术常见问题分析及改进措施目的：分析免疫组织化学技术中常见问题，并提出相应改进措施。

方法：以2010年1月-2012年12月笔者所在科收治的80例患者病史资料为依据，根据切片方法不同分为A、B两组，比较两组切片质量及常见问题。

结果：本次研究的患者中A组有15例切片出现质量问题。

改进操作后的患者切片即B组均清晰地观察到阳性细胞。

结论：免疫组织化学技术环节多、问题多，应提出有针对性地改进措施，不断完善。

标签：免疫组织；化学技术；改进措施要进行免疫组织化学检测，必须首先有良好的免疫组化学切片。

这一制作过程相对复杂，有许多环节，故而容易出现问题，而每一个环节出错都将影响最终结果。

所以相关医务技术人员应具备扎实的技术功底，把好每一关，最终得出准确的检测结果。

笔者结合自身工作经验，对常见问题的改进做出分析，现报告如下。

1 资料与方法1.1 一般资料分析笔者所在科2010年1月-2012年12月对80例患者进行病理分析的诊断结果数据，患者中有15例需要鉴别低分化癌与肉瘤，20例需要鉴别转移癌的性质，13例需要分析肿瘤细胞来源以及其分化程度，10例要检测患者组织耐药基因，12例为检测肿瘤组织分化活性，10例是肿瘤患者治疗后的回访检测。

根据切片方法不同分为A、B两组。

经过对患者组织切片的临床观察，A组鉴别低分化癌与肉瘤的患者中有4例确诊为低分化癌，之后接受化疗，2例为肉瘤的患者则采取手术切除治疗；11例患者已经发生淋巴及血液转移；肿瘤细胞来源及分化程度分析的患者中有6例是由癌细胞转移发病，2例为原发癌，均为高分化癌；5例经过治疗后的患者MDR1耐药基因表达明显升高；检测肿瘤组织分化活性的6例患者中有4例为G1，分化活性较低，2例G2，即中分化；回访检测的患者中3例复发，2例目前无变异。

B组6例确诊为低分化癌，3例为肉瘤；9例患者已经发生淋巴及血液转移；3例是由癌细胞转移发病，2例为原发癌；5例治疗后的患者耐药基因表达升高；3例分化活性较低，3例中分化；回访检测中3例复发，2例无变异。