试验碱性磷酸酶的分离提取及比活力的测定

碱性磷酸酶的分离纯化及⽐活性与⽶⽒常数测定碱性磷酸酶的分离纯化及⽐活性与⽶⽒常数测定⼀、实验原理(1).碱性磷酸酶的分离纯化1.机械破碎法制备肝匀浆低浓度⼄酸钠：低渗破膜低浓度⼄酸镁：保护和稳定AKP2.有机溶剂沉淀法分离纯化AKP加⼊不同有机溶剂重复离⼼正丁醇：沉淀部分除AKP的蛋⽩质33%丙酮、30%⼄醇：溶解AKP50%丙酮、60%⼄醇：沉淀AKP(2).⽐活性测定1.⽐活性的定义*单位重量的蛋⽩质样品中所含的酶活性单位。

*通常⽤每毫克蛋⽩质具有的酶活性单位来表⽰。

*⽤以鉴定酶的纯化程度，是酶分离提纯完成的评价指标之⼀。

2.测定样品的⽐活性必须测定：*每毫升样品中的酶活性单位数。

*每毫升样品中的蛋⽩质毫克数。

3.磷酸苯⼆钠法测定碱性磷酸酶活性反应原理(3).⽶⽒常数测定K m即为⽶⽒常数，V max为最⼤反应速度＊如上式表⽰,⽶⽒常数是反应速度为最⼤值的⼀半时的底物浓度,因此,⽶⽒常数的单位为mol/L。

当反应速度等于最⼤速度⼀半时,即V = 1/2 V max, K m = [S]＊吸光度表⽰不同底物浓度时的酶反应速度。

以吸光度的倒数作纵坐标，以底物浓度的倒数作横坐标，按Lineweaver-Burk作图法可求出Km值。

⼆. 器材721分光光度计台式离⼼机恒温⽔浴锅微量移液器托盘天平匀浆器试管三.试剂1. 0.5mol/L醋酸镁溶液称取醋酸镁5.3625g溶于蒸馏⽔中,稀释⾄50ml.2. 0.1mol/L醋酸钠溶液称取醋酸钠0.0820g溶于蒸馏⽔中,稀释⾄10ml.3. 0.01mol/L醋酸镁---醋酸钠溶液取0.5mol/L醋酸镁溶液2ml及0.1mol/L醋酸钠溶溶液10ml,混合均匀后加蒸馏⽔稀释⾄100ml.4. 丙酮(分析纯).5. 95%⼄醇(分析纯).6. Tris缓冲液(Ph8.8) 称取Tris 6.05g,⽤蒸馏⽔溶解成50ml,为0.1mol/L Tris 液,取0.1mol/L Tris液10ml,加0.5mol/L醋酸镁2ml,加蒸馏⽔80ml,再⽤1%醋酸调pH⾄8.8,然后⽤蒸馏⽔稀释⾄100ml.7. 0.01mol/L基质液称取磷酸苯⼆钠(C6H5PO4Na2.2H2o)0.3g,4-氨基安替⽐林0.15g,分别溶于煮沸冷却后的蒸馏⽔中;两液混合并蒸馏⽔稀释⾄50ml,加0.2ml氯仿防腐,盛于棕⾊瓶中,冰箱内保存,可⽤⼀星期;临⽤时与等量0.1mol/L pH10的碳酸盐缓冲液混合即可.8. 0.1mol/L pH10的碳酸盐缓冲液称取⽆⽔碳酸钠0.318g及碳酸氢钠0.168g溶于蒸馏⽔,稀释⾄50ml.9. 碱性溶液量取0.5mol/L氢氧化钠溶液与0.5mol/L碳酸氢钠溶液各20ml,混合后加蒸馏⽔⾄100ml.10. 0.5%铁氰化钾溶液称取铁氰化钾0.25g和硼酸0.75g,各溶于20ml蒸馏⽔中,溶解后两液混合均匀,再加蒸馏⽔⾄50ml,置棕⾊瓶中暗处保存.11. 0.1mol/L醋酸镁溶液称取醋酸镁0.2145g溶于蒸馏⽔中,稀释⾄10ml.12. 酚标准液(0.1mg/ml).四.实验步骤(1). “碱性磷酸酶分离纯化”实验操作(2).“碱性磷酸酶⽐活性测定”实验操作1.样品中碱性磷酸酶活性测定:(1).取5⽀试管,编号,按表1操作:表1A’B’C’D’标准空⽩各阶段稀释液(ml) 0.1 0.1 0.1 0.1 - -0.1mg/ml酚标准液(ml) - -- - 0.1 -pH8.8Tris缓冲液(ml) - - - - - 0.1置37℃⽔浴中保温5分钟复合基质液(ml) 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0混匀,37℃⽔浴中准确保温15分钟.保温结束后,各管⽴即加⼊1.0ml碱性溶液终⽌反应,再加⼊0.5%铁氰化物钾2.0ml,⽴即混匀,静置10min,在510nm波长下⽐⾊测定.2.酶活性单位计算每毫升酶液中酶活性单位=测定OD/标准OD X标准管中酚含量X1/0.1X稀释倍数3.样品中蛋⽩质含量的测定(1)测定蛋⽩质时,保留的A’管还需稀释5倍为A’’管,否则蛋⽩质浓度太⾼,其余各管不需再稀释,各⽤1.0ml进⾏测定.表2A’’B’C’D’空⽩各阶段稀释液(ml) 1.01.01.01.0 -0.1mg/ml酚标准液(ml) - -- -1.0pH8.8Tris缓冲液(ml) 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0混匀,置20~25℃⽔浴中保温10分钟复合基质液(ml) 0.50.50.50.50.5(2)⽴即振摇均匀,在20~25℃保温30min后,于650nm波长处⽐⾊.(3)蛋⽩质浓度计算:从Lowry法标准曲线查得的蛋⽩质毫克数,乘以稀释倍数,即为每毫升样品中蛋⽩质毫克数.4.⽐活性及得率计算碱性磷酸酶⽐活性=每毫升样品中碱性磷酸酶活性单位数/每毫升样品中蛋⽩质毫克数纯化倍数=各阶段⽐活性数/匀浆(A液)⽐活性数得率=各阶段酶的总活性单位/匀浆(A液)中的酶的总活性单位X100%5.实验结果将上述各实验计算结果填⼊表3内.表3分离总体积蛋⽩质总蛋⽩每毫升酶总活性⽐活性纯化得率阶段(ml) 浓度(mg) 活性单位单位(U/mg ) 倍数(%)(mg/ml) (U/ml) (U)匀浆(A液)第⼀次丙酮沉淀(B液)第⼆次丙酮沉淀(C液)第三次丙酮沉淀(D液)3．⽶⽒常数测定1. 取15只试管，按照下表操作，1～7号重复两组，0 号为空⽩对照。

实验十一碱性磷酸酶的提取、比活性及Km测定(综合性实验)碱性磷酸酶的分离提取和比活性测定一、目的要求1. 熟悉从生物样品中提取与纯化酶的一般方法。

2.掌握碱性磷酸酶(AKP) 比活性的测定原理和方法。

3.了解测定酶比活性的意义。

二、实验原理本实验采取有机溶剂沉淀法从兔肝匀浆液中提取分离碱性磷酸酶(AKP)。

正丁醇能使部分杂蛋白变性，过滤除去杂蛋白，即得到含有AKP的滤液，AKP能溶于终浓度为33％的丙酮或30％的乙醇中，而不溶于终浓度为50％的丙酮或60％的乙醇中，通过离心即可得到初步纯化的AKP。

根据国际酶学委员会规定，酶的比活性(specific activity)用每mg蛋白质具有的酶活性单位(u/mg·pr)来表示。

因此，测定样品的比活性必须测定：(1)每ml 样品中的蛋白质mg数(mg/m1)；(2)每ml样品中的酶活性单位数(U/ml)。

酶的纯度越高酶的比活性也就越高。

本实验以磷酸苯二钠为底物，由碱性磷酸酶催化水解，生成游离酚和磷酸盐。

酚在碱性条件下与4-氨基安替比林作用，经铁氰化钾氧化，生成红色的醌衍生物，颜色深浅和酚的含量成正比。

于510nm处比色，即可求出反应过程中产生的酚含量，而碱性磷酸酶的活性单位(King-Armstrong法)可定义为：在37℃保温15min 每产生lmg的酚为一个酶活性单位。

样品中蛋白质含量测定用Folin-酚法测定。

三、实验器材（一）实验材料1.兔肝（二）实验仪器1.研钵 2．刻度离心管 3．移液管 4．电动离心机 5．玻璃漏斗和玻棒6.托盘天平 7．恒温水浴 8．分光光度计 9.剪刀 10.滤纸（三）实验试剂1. 0.5mol/L乙酸镁溶液：称取乙酸镁107.25g溶于蒸馏水中，稀释至1000ml。

2．0.1mol/L乙酸钠溶液：称取乙酸钠8.2g溶于蒸馏水中，稀释至1000ml。

3．0.01mol/L乙酸镁-0.01mol/L乙酸钠溶液：取0.5mol/L乙酸镁溶液20ml及0.1mol/L乙酸钠溶液100ml，混合后加蒸馏水稀释到1000ml。

生物化学实验报告小牛肠碱性磷酸酶的提纯及酶活的测定、SDS-PAGE电泳法测定蛋白质相对分子质量摘要：碱性磷酸酶是在碱性条件下水解多种磷酸酯并具有转磷酸基作用的一组酶，并且在较高温度下扔具有活性，本实验中通过一系列分离纯化获得碱性磷酸酶，催化底物对硝基苯磷酸二钠生成对硝基苯酚，对硝基苯酚在405nm光波长下有最大吸收，通过测定吸光值的变化率，可以检测测定酶活性（在特定条件下，1min内催化1μmol底物转化成产物所需要的酶量被称为一个酶活力单位）；蛋白质-考马斯亮蓝结合物在595nm波长下的光吸收与蛋白质含量成正比，所以可以利用考马斯亮蓝法测定蛋白质含量。

SDS-PAGE电泳法测定蛋白质的相对分子质量，是因为SDS可以与蛋白质形成蛋白质-SDS复合物，电泳迁移率主要取决于蛋白质的分子量大小，以推断出被测蛋白样品分子量的近似值。

关键词：碱性磷酸酶；提取；小牛肠；酶活性测定；马斯亮蓝法；蛋白质含量测定；SDS-PAGE电泳法；实验部分1.1试剂与仪器试剂：正丁醇，丙酮（置于-20摄氏度冰箱保存），硫酸铵，30% 丙烯酰胺，10% 过硫酸铵，1 mol/L HAc，1 mol/L NaOH，TEMED（四甲基乙二胺），电泳缓冲液，平衡缓冲液（0.01 mol/L Tris-HCl，pH 8.0，含1.0×10-3 mol/L MgCl2和1.0×10-5 mol/L ZnCl2）；底物缓冲液（1 mol/L 二乙醇胺-盐酸缓冲液，pH 9.8，含0.5×10-3 mol/L MgCl2）；酶的底物溶液（用底物缓冲液配制15×10-3 mol/L 对硝基苯磷酸二钠溶液）；分离胶缓冲液（1.5 mol/L Tris-HCl缓冲液，pH 8.8，已加入10% SDS）浓缩胶缓冲液（0.5 mol/L Tris-HCl缓冲液，pH 6.8，已加入10% SDS）；上样缓冲液（100 mg SDS、2 mg溴酚蓝、2 g甘油，加0.1 mL巯基乙醇、2 mL 0.05mol/L pH 8.0 Tris-HCl，加超纯水定容至10 mL）；染色液（含0.1% 考马斯亮蓝R250，40%甲醇和10%冰酸的染色液500 mL）；脱色液（500 mL 10%甲醇和10%冰醋酸的脱色液1000 mL）；电泳缓冲液（0.1% SDS，0.05mol/L Tris，0.384 mol/L甘氨酸pH 8.3）仪器：匀浆机（常州国华电气有限公司JJ-2)；高速冷冻离心机(eppendorf centrifuge 5804R)；恒温水浴（上海一恒科技有限公司HWS-12）；紫外可见分光光度计（上海精密科学仪器有限公司UV720）；双垂直电泳槽（DYCZ-24D）；电泳仪（北京市六一仪器厂DYY-8C)；脱色摇床：WD-9405A 1.2.1小牛肠碱性磷酸酶的提取1、刮取新鲜小牛肠内粘膜。

2014年生物化学实验B实验报告姓名：姓名学号：201247044实验时间：2014.11.15实验分组：第七组组内成员：组员201247002组员201247020组员201247060 任课教师：李晓晖小牛肠碱性磷酸酶的提取及酶活测定考马斯亮蓝法测定蛋白质含量SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质相对分子质量组员1，组员2，组员3，组员4化工与环境生命学部 化工学院 化学工程与工艺（国际）1201班摘要 本文以从小牛肠中提取碱性磷酸酶为例，介绍了生物体中分离、提取酶的方法，以及如何使用考马斯亮蓝法测定所提取酶的蛋白含量并以此得出酶活。

同时通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳来测定给定蛋白质样品的相对分子质量。

关键词 小牛肠碱性磷酸酶 酶活 对硝基苯酚 吸光值 考马斯亮蓝R-250 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 蛋白质相对分子质量碱性磷酸酶（AKP,EC 3.1.3.1）是一种非特异性水解酶，广泛存在于动物各脏器、微生物和植物中。

它在体外能催化多种磷酸单脂类化合物的水解，得到相应的醇。

不同来源的AKP ，其分子量和亚基结构各不相同。

小牛肠碱性磷酸酶相对分子质量为145000，等电点为7.5。

在体外可催化底物对硝基苯磷酸二钠生成对硝基苯酚，后者在405nm 光波长下有最大吸收，通过测定吸光值的变化率，即可测定碱性磷酸酶的活力。

酶活定义：在最适条件下，以每分钟催化水解1µmol 底物的酶量为一个酶活力单位。

本实验温度取37℃。

酶活力的计算：酶活力（u/mg ）=L C V DV A E R ⨯⨯⨯⨯⨯∆405E min /式中，∆A/min 为405nm 波长下的吸光值的变化率；V R 为反应液的体积，D 为稀释倍数；E 405为405nm 波长下对硝基苯酚的摩尔消光系数，18.3；V E 为所加酶液体积；C 为蛋白浓度；L 为比色皿光程。

考马斯亮蓝R-250测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。

考马斯亮蓝R-250在酸性溶液中的游离状态呈红褐色，当它与蛋白质结合后变为蓝色，前者最大吸收波长为465nm ，后者为595nm 。

碱性磷酸酶的分离纯化实验报告实验报告：碱性磷酸酶的分离纯化引言：碱性磷酸酶是一种常见的酶类，在生物化学和生物工程领域有着重要的应用价值。

分离纯化碱性磷酸酶可以有效地提高其催化活性，从而更好地满足利用需求。

本实验旨在通过分离纯化的方法获得高纯度的碱性磷酸酶。

材料与方法：材料：1. 含有碱性磷酸酶的混合酶液；2. DEAE-纤维素离子交换柱；3. 带有荧光物质的酶学百科试剂盒；4. 透析膜。

方法：1. 将50 mL含有碱性磷酸酶的混合酶液，通过DEAE-纤维素离子交换柱进行分离纯化；2. 用PBS缓冲液洗涤纤维素柱，收集洗脱液以及洗脱后的洗脱液，测定酶活力；3. 分别将洗脱后的洗脱液和洗脱液透析入PBS缓冲液中；4. 用带有荧光物质的酶学百科试剂盒测定样品的酶活力。

结果：样品中碱性磷酸酶的活性经过分离纯化后得到了提高，相对活性提高了3倍以上。

同时，样品纯度也有了显著的提高。

分析和讨论：本实验通过离子交换柱和透析膜的方法，成功地分离和纯化了碱性磷酸酶。

实验中使用的DEAE-纤维素离子交换柱是一种较为成熟且常见的方法，具有操作简单、精度高等特点。

透析膜则可以更为彻底地去除不需要的杂质，进一步提高受体的纯度。

在实验结果中，我们发现酶的相对活性得以提高，这说明经过纯化后酶的质量得到了提高，可以进行更好地应用。

但同时，这样的分离纯化也存在一定的局限性，如纯度并没有达到100%，仍存在需进一步提高的空间。

结论：本实验成功地纯化和分离了碱性磷酸酶，提高了其相对活性，获得了具有实际应用需求的高纯度酶样品。

同时，在实际应用过程中，需要根据需求进行更为严格的纯化和分离，以满足更加精细化的需求。

8碱性磷酸酶比活力测定概述碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）是一种广泛存在于动植物组织和微生物中的酶，其主要功能是催化磷酸盐基团的水解反应。

ALP的活性主要由酸碱度、温度、金属离子浓度等因素所影响。

ALP比活力测定可以用于快速筛选和检测酶的活性及其活性变化等。

本实验采用8碱性磷酸酶作为模型酶，采用间接比色法测定其比活力。

材料和试剂试剂：1. 空白对照：含有ALP缓冲液的管2. 标准对照：10μg/mL碱性磷酸酶溶液3. 涂板洗涤缓冲液：PBS液，pH 7.44. 反应底物：pNPP溶液5. 停止液：2mol/L NaOH溶液6. ALP缓冲液：0.1mol/L甘氨酸缓冲液，pH 9.6，含有1mmol/L MgCl2仪器：1. 组合式洗板机2. 酶标仪3. 加热器4. 温度计方法注意事项：1. 所有的样品和标准溶液都应在同一天制备，并测量前混匀。

2. 所有的试剂和材料都要神经否则可能影响实验结果。

实验操作：1. 取100μL标准对照和100μL空白对照，分别加入洗涤缓冲液中，洗涤3次。

2. 加入100μL标准对照和待测样品至96孔板中。

每个样品平行加入两个孔。

3. 加入50μL反应底物至每个孔中，将板密封，加热反应30min。

4. 加入50μL停止液，将板洗涤5次。

5. 测定吸光度值，波长为405nm。

数据处理1. 记录96孔板中每个孔的吸光度值。

2. 以标准对照为基准，计算每个孔的相对吸光度值。

3. 以样品组的平均相对吸光度值为y，以标准对照相对吸光度值为x，绘制标准曲线，计算标准曲线的斜率。

4. 计算样品的ALP比活力。

样品ALP比活力= (样品相对吸光度值/y) x 斜率。

结果与分析以标准曲线计算每个样品的ALP比活力，根据结果可以判断样品中ALP酶的比活力。

若ALP比活力高，说明该样品中ALP酶活性较强；若低，则说明其活性相对较弱。

总结。