最新6碱性磷酸酶的分离提取

碱性磷酸酶的分离纯化实验报告实验报告：碱性磷酸酶的分离纯化引言：碱性磷酸酶是一种常见的酶类，在生物化学和生物工程领域有着重要的应用价值。

分离纯化碱性磷酸酶可以有效地提高其催化活性，从而更好地满足利用需求。

本实验旨在通过分离纯化的方法获得高纯度的碱性磷酸酶。

材料与方法：材料：1. 含有碱性磷酸酶的混合酶液；2. DEAE-纤维素离子交换柱；3. 带有荧光物质的酶学百科试剂盒；4. 透析膜。

方法：1. 将50 mL含有碱性磷酸酶的混合酶液，通过DEAE-纤维素离子交换柱进行分离纯化；2. 用PBS缓冲液洗涤纤维素柱，收集洗脱液以及洗脱后的洗脱液，测定酶活力；3. 分别将洗脱后的洗脱液和洗脱液透析入PBS缓冲液中；4. 用带有荧光物质的酶学百科试剂盒测定样品的酶活力。

结果：样品中碱性磷酸酶的活性经过分离纯化后得到了提高，相对活性提高了3倍以上。

同时，样品纯度也有了显著的提高。

分析和讨论：本实验通过离子交换柱和透析膜的方法，成功地分离和纯化了碱性磷酸酶。

实验中使用的DEAE-纤维素离子交换柱是一种较为成熟且常见的方法，具有操作简单、精度高等特点。

透析膜则可以更为彻底地去除不需要的杂质，进一步提高受体的纯度。

在实验结果中，我们发现酶的相对活性得以提高，这说明经过纯化后酶的质量得到了提高，可以进行更好地应用。

但同时，这样的分离纯化也存在一定的局限性，如纯度并没有达到100%，仍存在需进一步提高的空间。

结论：本实验成功地纯化和分离了碱性磷酸酶，提高了其相对活性，获得了具有实际应用需求的高纯度酶样品。

同时，在实际应用过程中，需要根据需求进行更为严格的纯化和分离，以满足更加精细化的需求。

#### 一、实验背景碱性磷酸酶（Alkaline Phosphatase，AKP）是一种广泛存在于生物体内的酶，具有在碱性条件下水解多种磷酸酯底物的能力。

AKP在生物体内参与多种生理和代谢过程，如钙磷代谢、细胞信号转导等。

本研究旨在通过实验手段对AKP进行分离纯化，并对其性质进行初步探讨。

#### 二、实验材料与仪器1. 材料：- 兔肝匀浆液- 丙酮、乙醇、正丁醇、硫酸铵等有机溶剂- DEAE-Sepharose FF、Sephacryl S-200等层析介质- SDS-PAGE电泳试剂- 蛋白质分子量标准品- 碱性磷酸酶底物及检测试剂2. 仪器：- 高速离心机- 紫外可见光分光光度计- 凝胶成像系统- 层析柱- 电泳槽- 移液器#### 三、实验方法1. 碱性磷酸酶的提取：- 将兔肝匀浆液用4℃预冷的丙酮沉淀，于4℃条件下静置2小时。

- 12,000 r/min离心30分钟，收集沉淀。

- 将沉淀用少量水溶解，加入硫酸铵至饱和，于4℃条件下静置2小时。

- 12,000 r/min离心30分钟，收集沉淀。

- 将沉淀用少量水溶解，加入正丁醇，于4℃条件下静置2小时。

- 12,000 r/min离心30分钟，收集含有碱性磷酸酶的上清液。

2. 碱性磷酸酶的纯化：- 将上清液用DEAE-Sepharose FF层析柱进行阴离子交换层析。

- 以磷酸盐缓冲液为洗脱液，收集碱性磷酸酶活性峰。

- 将活性峰用Sephacryl S-200分子筛层析柱进行分子筛层析。

- 以磷酸盐缓冲液为洗脱液，收集碱性磷酸酶活性峰。

3. 碱性磷酸酶的鉴定：- 将纯化后的碱性磷酸酶进行SDS-PAGE电泳，与蛋白质分子量标准品进行对比，确定其分子量。

- 利用紫外可见光分光光度计测定碱性磷酸酶的吸光度，计算其浓度。

4. 碱性磷酸酶的性质研究：- 通过酶活性测定，探讨碱性磷酸酶的最适pH值、最适温度等性质。

#### 四、实验结果1. 分离纯化结果：- 经过上述实验步骤，从兔肝匀浆液中成功提取并纯化了碱性磷酸酶。

碱性磷酸酶的提取分离和比活力的测定碱性磷酸酶是一种广泛存在于生物体内的酶，能够催化酸性环境下的磷酸酯水解反应，在多种生理过程中发挥重要作用。

其提取分离和比活力的测定具有重要的科学研究价值和应用前景。

一、碱性磷酸酶的提取分离1、组织样品制备将待提取的组织放入离心管中，加入磷酸盐缓冲液（pH 7.4），用高速离心离心3-5分钟，去除上清液并加入1mL磷酸盐缓冲液，在实验台上加入玻璃珠或石英砂，放入冰箱冷冻器中。

2、细胞裂解将组织经过粉碎的样品加入磷酸盐缓冲液（pH 7.4），放入研钵中，加入冰冷甲醇，研磨5-10分钟。

将打磨液离心分离，上清液用分液漏斗收集，加入等量的0.1mol/L四乙基铵溶液，静置20分钟，收集上清液并加入2.5%聚乙烯醇。

3、沉淀和提取将沉淀后的样品中加入氯仿等有机溶剂，轻微摇动，分离出沉淀，将上清液倒入烧瓶中，并用氯仿洗涤，收集洗涤液后将其合并，加入甲醇进行沉淀，离心分离，去除上清液，加入2-3倍体积的丙酮，静置反复冲洗多次。

将沉淀中加入适量的溶解液，摇混均匀，转移至离心管中，并用离心机转速2800r/min/5 min。

二、碱性磷酸酶的比活力测定1、酶活性试验体系将提取分离后的活性酶样品用注射器加入已配制好的酶活性试验体系中，包括10mM Tris-HCl缓冲液（pH 8.0）、1 mM EDTA缓冲液、2 mM酚酞液、0.1M NaCl等，总体积为2ml。

2、样品处理制备所需要的各种试剂和标准品，并制备好标准品不同浓度的稀释液。

将稀释后的酶样品取1ml，加入酶活性试验体系中，并在无酶样品控制下，以相同的温度下逐渐加入不同的底物溶液，如α-萘酚磷酸钠。

注意不要影响反应溶液 pH 值和终点的颜色产生，以免误诊。

3、反应终止在反应末期，可以加入固定量的0.1N NaOH终止反应，并使用p-酚酸作为对照品和标准品进行比较或质控，并测定比活力。

综上所述，选择合适的方法提取分离和测定碱性磷酸酶的比活力对于进一步探究其在生理过程中的作用机制以及相关疾病的诊断和治疗等方面具有重要的意义。

碱性磷酸酶的分离纯化碱性磷酸酶的分离纯化、⽐活性测定与定⼒学分析⼀、实验原理(⼀)碱性磷酸酶的分离纯化、⽐活性测定1.机械破碎法制备肝匀浆低浓度⼄酸钠：低渗破膜低浓度⼄酸镁：保护和稳定AKP2.有机溶剂沉淀法分离纯化AKP加⼊不同有机溶剂重复离⼼正丁醇：沉淀部分除AKP的蛋⽩质33%丙酮、30%⼄醇：溶解AKP50%丙酮、60%⼄醇：沉淀AKP3.⽐活性的定义＊单位重量的蛋⽩质样品中所含的酶活性单位。

＊通常⽤每毫克蛋⽩质具有的酶活性单位来表⽰。

＊⽤以鉴定酶的纯化程度，是酶提取与纯化成功与否的评价指标之⼀。

4.测定样品的⽐活性必须测定：＊每毫升样品中的酶活性单位数。

＊每毫升样品中的蛋⽩质毫克数。

5.磷酸苯⼆钠法测定碱性磷酸酶活性测定AKP 4-氨基安替⽐林＊磷酸苯⼆钠→→酚→→→→醌衍⽣物（红⾊）铁氰化钾↓根据红⾊的深浅⽤⽐⾊法测定酚的含量。

＊37℃保温15分钟产⽣1mg酚者为1个酶活性单位。

(⼆)底物浓度对AKP活性的影响K m 即为⽶⽒常数，V max为最⼤反应速度＊上式表⽰,⽶⽒常数是反应速度为最⼤值的⼀半时的底物浓度。

因此,⽶⽒常数的单位为mol/L。

当反应速度等于最⼤速度⼀半时,即V= 1/2 V max, K m = [S] ＊吸光度表⽰不同底物浓度时的酶反应速度。

以吸光度的倒数作纵坐标，以底物浓度的倒数作横坐标，按Lineweaver-Burk作图法求出Km 值。

双倒数作图法（三）PH对AKP活性的影响酶的催化活性与环境pH有密切关系，通常各种酶只在⼀定pH范围内才具有活性，酶活性最⾼时的pH，称为酶的最适pH，⾼于或低于此pH时酶的活性都逐渐降低。

不同酶的最适pH不同。

酶的最适pH不是⼀个特征性的物理常数，对于⼀个酶，其最适pH因缓冲液和底物的性质不同⽽有差异。

（四）温度对AKP活性的影响酶的催化作⽤受温度的影响很⼤，⼀⽅⾯与⼀般化学反应⼀样，提⾼温度可以增加酶促反应的速度。

通常温度每升⾼10℃，反应速度加快⼀倍左右，最后反应速度达到最⼤值。

1、详细介绍碱性磷酸酶（SOD、木瓜凝乳蛋白酶、精氨酸激酶）的提取、分离纯化方案及采用每种技术（如：如果采用阴离子交换层析，那为什么不采用阳离子交换层析呢，要解释清楚）的原因，在分离纯化过程中怎样检测纯度？一、精氨酸激酶的介绍无脊椎动物的精氨酸激酶类似于脊椎动物中的肌酸激酶，是细胞代谢中的磷酸激酶，它将Mg2+和ATP上的磷酸基转移到精氨酸上，产生磷酸精氨酸、Mg2+和ADP，是无脊椎动物体内能量代谢的关键调控酶[1]。

它不仅在对墨鱼的能量代谢过程中具有重要作用，而且在墨鱼体内的表达量也很高。

因此，对精氨酸激酶深入研究十分必要。

本实验主要对墨鱼肌肉组织的精氨酸激酶进行分离、纯化及部分酶学性质的鉴定。

对该酶的性质进行分析结果表明,精氨酸激酶的最适作用温度为55℃,当温度高于65℃时,酶活力显著下降；pH8时酶活力较高,低浓度的精氨酸对酶活力有促进作用。

二、工艺路线三、研究内容与方案1.对虾精氨酸激酶的提取、分离取10g于-20℃贮存的新鲜对虾肌肉,高速组织捣碎机2000r·min-1匀浆5min,加入40mL预冷的缓冲液A(0.1mmol·L-1Tris-HCl,10mmo l·L-1巯基乙醇,5mmol·L-1叠氮化钠,20mmo l·L-1苯甲基磺酰氟(PMSF),pH8.0),搅拌均匀,把悬液放置于预冷的离心管中,4℃,5000×g离心20min后保存上清。

＊选择使用巯基乙醇和PMSF的原因：巯基乙醇可以防止蛋白酶在分离提取过程中的氧化、PMSF是蛋白酶抑制剂，可以防止蛋白酶水解＊注意事项该步骤完成后，要对粗酶液进行酶活力的测定2.对虾精氨酸激酶的纯化1）DEAE-纤维素柱层析装柱直接取商品DEAE cellulose DE-52装柱(2.5x40cm)装柱前，先在柱中加入一定量的层析柱平衡液（约10cm高），然后倒入凝胶，打开柱底部的出口，使其自然沉降，当柱中形成明显分界面时，放入两层大小合适的滤纸片与凝胶顶部，接上恒流泵，流速选用2.5ml/min，当柱不再进一步压缩时，保持柱顶部缓冲液1-2cm高[4]。

碱性磷酸酶的提取碱性磷酸酶的提取、分离纯化方案及采用的技术的原因，在分离纯化过程中怎样检测纯度一、碱性磷酸酶1、碱性磷酸酶的提取碱性磷酸酶（AKP或ALP）是一种底物特异性较低，在碱性条件下能水解多重磷酸单脂化合物的酶，需要镁和锰离子为激活剂。

AKP 具有磷酸基团转移活性，能将底物中的磷酸基团转移到另一个含有羟基的接受体上，如磷酸基团的接受体是水，则其作用就是水解。

·KP最适ＰＨ范围为８.６－１０，动物中AKP主要存在于小肠粘膜、肾、骨骼、肝脏和胎盘等组织的细胞膜上。

血清AKP主要来自肝，小部分来自骨骼。

AKP可从组织中分离纯化，也可以采用基因工程表达的方式获得：将碱性磷酸酶基因克隆到重组载体，转入宿主菌中进行重组表达，并从表达菌提取，并进行酶动力学分析。

2、碱性磷酸酶的分离纯化及采用的技术AKP分离纯化的方法与一般蛋白质的分离纯化方法相似，常用中性盐盐析法、电泳法、色谱法、有机溶剂沉淀法等方法分离纯化。

有时需要多种方法配合使用，才能得到高纯度的酶蛋白。

其中，用盐分级沉淀是一种应用非常广泛的方法。

由于硫酸铵在水中溶解度很大（20℃，每升可溶760克），并且对许多酶没有很大的影响，因此它是最常用的盐。

3、碱性磷酸酶的纯度检测酶的纯浓度越高酶的比活性也就越高。

根据国际酶学委员会规定，酶的比活性用每毫克蛋白质具有的酶活性来表示，单位（U/mg?pr）来表示。

因此，测定样品的比活性必须测定：a每毫升样品中的蛋白质毫克数；b每毫升样品中的酶活性单位数。

在蛋白质或酶的分离提取过程中由于酶蛋白容易变性而失活，为了获得较好的分离提取效果，在酶的制备过程中，每经一步处理，都需测定酶的活力和比活力。

唯有比活力提高较大，提纯步骤才有效。

二、设计实验本实验采用有机溶剂沉淀法从肝匀桨中分离纯化碱性磷酸酶(简称AKP)。

先用低浓度醋酸钠(低渗破模作用)制备肝匀浆。

醋酸镁则有保护和稳定AKP 的作用。

匀浆中加入正丁醇可使部分杂蛋白变性，释出膜中酶，过滤后，以去除杂蛋白。