gfp-lc3质粒转染细胞步骤

mcherry-gfp-lc3原理
Mcherry-GFP-LC3是一种荧光标记蛋白，用于研究细胞自噬。

原理如下：
1. Mcherry是一种红色荧光蛋白，GFP是一种绿色荧光蛋白，它们都可以通过荧光显微镜观察。

2. LC3是一种微管相关蛋白3（Microtubule-associated protein 1A/1B-light chain 3），参与调控和介导细胞自噬过程。

LC3有LC3-I和LC3-II两种形式，LC3-I是胞浆中的非结合形式，LC3-II是结合在自噬小体（autophagosome）膜上的形式。

3. Mcherry-GFP-LC3是将Mcherry和GFP两种荧光蛋白与
LC3一起融合而成。

在正常条件下，细胞中的自噬活性较低，Mcherry-GFP-LC3主要存在于胞浆中。

4. 当细胞启动自噬过程时，LC3-I会转化为LC3-II，并结合在自噬小体膜上。

由于GFP对酸性条件敏感，在自噬小体酸性环境中会逐渐失去荧光，而Mcherry对酸性环境不敏感，能够保持红色荧光。

5. 通过观察Mcherry-GFP-LC3的荧光表达，可以判断细胞是否在进行自噬。

当细胞开始自噬时，会出现红色和黄色（红色与绿色复合）荧光，而在胞浆中继续存在的Mcherry-GFP-LC3会呈现黄色荧光，表明自噬的早期过程。

当自噬小体与溶酶体融合后，酸性环境导致GFP的荧光丧失，只保留红色荧光，表明自噬已经发生。

综上所述，通过观察Mcherry-GFP-LC3的荧光表达变化，可以定量分析细胞中自噬的活性和过程。

质粒转染概述质粒转染是一种常用的实验技术，用于将外源基因导入至细胞内，以研究基因的功能、表达和调控等方面的问题。

质粒转染的方法多种多样，包括瞬时转染、病毒载体转染和电穿孔等。

本文将介绍质粒转染的原理、常用方法和注意事项。

原理质粒是一种环状的双链DNA分子，可在细胞内稳定复制和表达外源基因。

质粒转染的过程主要包括质粒进入细胞、转座和表达等步骤。

质粒进入细胞通常需要越过细胞膜，这可以通过瞬时破坏细胞膜以便质粒进入细胞，或者利用特定的转染试剂辅助质粒进入细胞。

质粒进入细胞后，它可以被随机插入到细胞染色体中，或者停留在高复制活性的细胞结构，如细胞核或线粒体。

一旦质粒转座完成，它可以通过自身的启动子和终止子进行转录和翻译，从而表达相应的外源基因。

外源基因的表达结果可以通过各种方法进行检测和分析。

常用方法1. 瞬时转染瞬时转染是一种将质粒暂时引入细胞内，使之表达外源基因的方法。

常用的瞬时转染方法包括钙磷共沉淀法、电穿孔法和脂质体转染法等。

其中，钙磷共沉淀法是一种经典的转染方法，通过将质粒与钙盐一起处理，形成质粒-钙磷复合物，然后将其加入到细胞培养基中，质粒可通过细胞膜破裂进入细胞内。

电穿孔法利用电场的作用破坏细胞膜，并使质粒进入细胞，脂质体转染法则是利用脂质体与质粒的亲和力，将质粒包裹在脂质体内，通过与细胞膜融合进入细胞。

2. 病毒载体转染病毒载体转染是利用病毒作为载体将质粒导入细胞内。

常用的病毒载体包括腺相关病毒（Adenovirus）、慢病毒（Retrovirus）和腺病毒（Adeno-associated virus）等。

这些病毒载体可以携带外源质粒进入细胞，将质粒插入宿主基因组中，并在细胞内稳定复制和表达。

病毒载体转染方法通常需要通过特定的包装和扩增步骤来制备，以确保足够的载体颗粒用于转染。

3. 电穿孔电穿孔是一种通过电场作用破坏细胞膜，使质粒进入细胞的转染方法。

电穿孔方法通常使用专门的电转染装置，利用高电压脉冲瞬时改变细胞膜的通透性，使质粒进入细胞。

细胞自噬检测引言细胞自噬（Autophagy）是一种维持细胞内稳态的重要细胞生理过程。

它通过将细胞内的有害垃圾物质、受损蛋白质和细胞器通过包裹成双层膜体而将其降解和回收。

细胞自噬不仅对于维持细胞内环境的平衡，也在细胞营养不足、应激等情况下发挥至关重要的作用。

为了研究细胞自噬的机制、功能以及其在疾病中的作用，科研人员常常需要进行细胞自噬的检测。

本文将介绍一些常用的细胞自噬检测方法，旨在帮助科研人员更好地开展相关研究。

方法一：免疫组化检测免疫组化检测是常用的细胞自噬检测方法之一，它利用特异性抗体识别和定位自噬相关的蛋白质标记。

以下是免疫组化检测的步骤：1.固定和透化：将细胞样品固定在载玻片上，并通过透化剂处理，以便抗体能够穿透细胞膜进入细胞内。

2.抗体反应：加入特异性的抗体，使其与目标自噬蛋白结合。

3.洗涤：进行多次洗涤，以除去未结合的抗体。

4.二抗结合：加入与第一抗体来源不同种类的第二抗体，它能连接到第一抗体上，使得目标蛋白能够被可见光或荧光染料标记。

5.洗涤：进行多次洗涤，以除去未结合的第二抗体。

6.显色或荧光检测：加入适当的显色剂或荧光标记物，观察细胞自噬标记的结果。

免疫组化检测方法适用于观察细胞内特定蛋白质的表达和定位情况，从而间接地了解细胞自噬的活性。

方法二：转染自噬标记基因为了直接观察细胞内自噬相关的蛋白质的表达情况，科研人员可以利用转染自噬标记基因的方法。

以下是一种常用的自噬标记基因：mRFP-GFP-LC3。

mRFP-GFP-LC3是一种融合蛋白，其中GFP（绿色荧光蛋白）和mRFP（红色荧光蛋白）与自噬相关的蛋白LC3融合在一起。

GFP能够在细胞自噬过程中被降解，而mRFP则能够在自噬过程中保持稳定。

转染mRFP-GFP-LC3基因后，科研人员可以通过观察细胞中的荧光信号来确定细胞的自噬活性。

当细胞自噬活性较低时，绿色和红色荧光都很强；而当细胞自噬活性增加时，绿色荧光减弱而红色荧光增强。

自噬双标腺病毒（mRFP-GFP-LC3）使用指南背景：自噬是细胞内的一种“自食（Self-eating）”的现象，凋亡是“自杀（Self-killing）”的现象，二者共用相同的刺激因素和调节蛋白，但是诱发阈值和门槛不同，如何转换和协调目前还不清楚. 自噬是指膜（目前来源还有争议，大部分表现为双层膜，有时多层或单层）包裹部分胞质和细胞内需降解的细胞器、蛋白质等形成自噬体，最后与溶酶体融合形成自噬溶酶体，降解其所包裹的内容物，以实现细胞稳态和细胞器的更新。

目前文献对自噬过程进行观察和检测常用的策略和手段有：通过western blot检测LC3的剪切；通过电镜观测自噬体的形成；在荧光显微镜下采用GFP（-RFP）-LC3等融合蛋白来示踪自噬体形成以及降解。

近几年对自噬流的研究日趋增多，针对于此我们汉恒生物科技（上海）有限公司自主研发了用于实时监测自噬(流)的mRFP-GFP-LC3腺病毒，mRFP 用于标记及追踪LC3，GFP的减弱可指示溶酶体与自噬小体的融合形成自噬溶酶体，即由于GFP荧光蛋白对酸性敏感，当自噬体与溶酶体融合后GFP 荧光发生淬灭,此时只能检测到红色荧光。

这种串联的荧光蛋白表达载体系统直观清晰的指示了细胞自噬流的水平，是我们自噬研究尤其是自噬流研究不可或缺的利器。

mRFP-GFP-LC3腺病毒的操作收到病毒后的处理（一）、腺病毒的储存1、腺病毒采用冰袋运输。

（1）、收到病毒液后如未融化请置于-80℃冰箱，下次使用时再进行分装；（2）、如客户收到时腺病毒已融化，请直接分装后置于-80℃冰箱保存；若短期内用于实验，可分装部分于4℃保存（尽量一周内用完）。

2、尽量避免反复冻融，否则会降低病毒滴度（每次冻融会降低病毒滴度10%）。

建议不要在-20℃下长期保存。

如果病毒储存时间超过6个月，应该重新测定病毒滴度。

3、建议收到病毒产品后根据实验需求自行分装或购买经过分装的小包装病毒产品（购买时请提出）。

质粒转染过程
质粒转染是一种基因工程技术，它是将外源质粒DNA传递到细胞内，使其能够被细胞所识别和表达。

转染质粒的方法主要包括化学法、电穿孔法、病毒载体法等。

下面将对这些方法进行详细介绍。

1. 化学法
化学法是一种常见的质粒转染方法，它的原理是利用化学物质破坏细
胞膜，使质粒DNA进入细胞内。

化学法的优点是易操作且适用于多种
细胞类型，但其缺点是转染效率较低。

2. 电穿孔法
电穿孔法是一种利用电场作用使细胞膜通透的转染方法，它的原理是
使用电极在细胞上产生高压脉冲电场，使细胞膜出现短暂的孔洞，从
而将质粒DNA传输到细胞内。

该方法的优点是转染效率高，但需要专
业仪器支持。

3. 病毒载体法
病毒载体法是一种利用病毒向靶细胞传递质粒DNA的转染方法。

在该
方法中，质粒DNA被包裹在病毒粒子中，病毒粒子通过靶细胞膜的结
合和透过性进入细胞内，释放质粒DNA。

病毒载体法的优点是转染效
率高，但其缺点是安全风险较高。

总的来说，不同的转染方法适用于不同的应用场景，需要根据具体情
况进行选择。

在进行质粒转染时，还需要注意合适的质粒浓度、转染时间和细胞密度等因素，以提高转染效率和细胞存活率。

7.2.2细胞自噬的诱导及荧光显微镜的检测同学们好，上节课我们进行了GFP-LC3外源DNA的转染，这节课我们将进行细胞自噬的诱导和检测（出镜）。

一、实验简介及原理细胞在正常生长条件下能进行低水平的自噬，属于基础自噬，以维持生理状态下机体内环境的稳态。

当细胞遭受缺氧，缺营养，或某些化学物质刺激时，细胞发生应激反应，激活自噬，发挥保护细胞存活的作用。

例如，在无血清培养的饥饿条件下，细胞会通过自噬降解过程获得氨基酸的供给以维持蛋白质合成，应对饥饿求生存。

本实验采用饥饿诱导的方式来激活细胞自噬的发生，通过GFP-LC3的荧光观察来检测细胞自噬的程度。

二、实验材料：哺乳动物细胞（携带GFP-LC3质粒）三、实验用品：荧光显微镜、超净工作台、CO2培养箱，移液器和枪头、EP管四、实验试剂：无血清培养液DMEM、五、实验操作实验步骤分为三个环节：观察细胞状态-诱导细胞自噬-检测自噬程度1、观察细胞状态：显微镜观察细胞及GFP-LC3转染效率2、诱导细胞自噬：1）细胞培养板放入超净工作台，吸弃原培养液，2）无血清DMEM清洗一次，吸弃3）重新加入2ml无血清DMEM进行饥饿诱导，设一个对照孔，加入完全培养基培养，作标记。

4）放入培养箱继续培养，无血清饥饿12h以上。

3、检测细胞自噬程度：1）取出培养板，进行荧光显微镜观察2）采集照片：荧光显微镜观察GFP-LC3的聚集状态，每个样品拍摄多个视野，以便统计分析。

实验结束7.2.3细胞自噬-实验结果与注意事项GFP标记是最常规使用的分子标记物，可用来追踪被标记分子的表达水平和细胞定位，目前广泛用于分子和细胞生物学各个领域，GFP融合表达作为标签是大多数外源基因转染的首选（出镜）。

采用脂质体转染24小时后，我们可以通过GFP绿色荧光的检测判断转染效率。

同一个观察界面下，采集白光下细胞图片，然后切换到激光下采集绿色荧光图片，借助软件将两张图片叠加重合，即可以看出相应的转染效率。

细胞自噬诱导实验报告细胞自噬的实验观察，主要有四种方法。

1、提取总RNA，通过Real-time PCR 分析相关基因A TG4、A TG5和AT7G的表达；2、提取总蛋白，通过Western blotting 分析LC3的脂化；3、构建GFP-LC3表达载体，通过细胞转染利用荧光显微镜观察LC3颗粒的聚集；4、制备电镜样品，直接观察自噬体的形成。

一、pEGFP-C2-LC3质粒的提取与鉴定实验原理一、实验原理质粒(Plasmid)是一种染色体外的稳定遗传因子，为双链、闭环的DNA分子,并以超螺旋状态存在于宿主细胞中。

质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中，它具有自主复制和转录能力,能在子代细胞中保持恒定的拷贝数,并表达所携带的遗传信息。

质粒的复制和转录要依赖于宿主细胞编码的某些酶和蛋白质，质粒的存在使宿主具有一些额外的特性,如对抗生素的抗性等。

质粒载体是在天然质粒的基础上为适应实验室操作而进行人工构建的。

与天然质粒相比,质粒载体通常带有一个或一个以上的选择性标记基因(如抗生素抗性基因)和一个人工合成的含有多个限制性内切酶识别位点的多克隆位点序列,并去掉了大部分非必需序列,使分子量尽可能减少,以便于基因工程操作。

大多质粒载体带有一些多用途的辅助序列,这些用途包括通过组织化学方法肉眼鉴定重组克隆、产生用于序列测定的单链DNA、体外转录外源DNA 序列、鉴定片段的插入方向、外源基因的大量表达等。

一个理想的克隆载体大致应有下列一些特性：（1）分子量小、多拷贝、松驰控制型；（2）具有多种常用的限制性内切酶的单切点；（3）能插入较大的外源DNA片段；（4）具有容易操作的检测表型。

1. 煮沸法提取质粒的原理一般分离质粒DNA的方法都包括3个步骤：①培养细菌，使质粒DNA大量扩增；②收集和裂解细菌；③分离和纯化质粒DNA。

分离制备质粒DNA的方法很多，其中常用的方法有碱裂解法、煮沸法、SDS法和羟基磷灰石层析法等。

质粒转染是哺乳动物细胞蛋白表达和昆虫细胞表达中至关重要的一步，转染的效率直接影响着整体实验的成败，本文阐述了昆虫细胞扩P1转染、293细胞小试转染、ExpiCHO细胞转染的具体操作步骤与实验体系，同时附有一些我们整理的提高质粒转染效率的注意事项，供大家参考。

1、昆虫细胞扩P1转染：（1）取细胞状态良好，活力98%以上，对数生长期细胞铺六孔板，90万/孔；（2） 27°静置培养30 min,待完全贴壁后进行转染；（3）转染体系注：转染过程中一个实验一个滤器一个离心管，完全独立，避免交叉污染；质粒室温预热，转染试剂和培养基37度预热3、ExpiCHO细胞转染：（1）前一天取细胞状态良好，活力98%以上，对数生长期细胞稀释至3-4 x10^6个/ml；（2）转染当天细胞计数7-9 x10^6个/ml细胞状态良好，活力98%以上,将细胞稀释至6 x10^6个/ml；（3）转染体系（3）.细胞种类不同细胞种类的细胞在做转染时所需要的转染体系是不同的，不能一种体系用在所有类型细胞的转染实验。

如上所示，针对昆虫细胞转染、293细胞小试转染、ExpiCHO细胞转染我们分别使用了三种不同的转染体系。

（4）DNA纯度在制备高纯度质粒时，还需要对DNA进行内毒素的去除，内毒素的存在会造成细胞毒性，严重影响转染效率，因此我们在做质粒转染时，对交付的质粒有如下要求：交付的质粒使用TE溶解（10 mM Tris-HCl,1 mMEDTA）, A260/A280比值在1.8-2.0之间，质粒浓度在1000 ng/ul左右①内毒素小于0.128 eu/ug②质粒大抽要求：无内毒素、无苯酚、无氯化钠③质粒需经过跑胶鉴定，超螺旋质粒含量大于50%，无明显蛋白污染（5）.转染试剂转染试剂的原则是高效、低毒、方便、廉价，每种转染试剂都会提供一些已经成功转染的细胞株列表和文献，通过这些资料可选择最适合实验设计的转染试剂。

质粒扩增、提取、转化和转染等操作程序质粒扩增、提取、转化和转染等操作程序一、感受态细菌制备（CaCl2法）1. 从LB平板上挑取新活化的大肠杆菌单菌落，接种于5ml不加Amp的LB培养基中，37℃振荡培养过夜（200r/min，至OD=1.5左右）。

2. 取0.5ml上述振荡过夜的菌液，转入含50ml的LB的三角烧瓶（1%）中，37℃条件下振荡培养2~2.5小时左右（200r/min），使OD600达到0.2~0.4左右（100μl 测600nm时OD值）。

3. 将培养液50ml分装到4个10ml的离心管中，每管10ml，冰上放置10min，4. 4℃条件下，4000r/min离心10分钟，弃上清。

将离心管倒扣在吸水纸上，尽量倒尽管中的培养基。

5. 每管加入预冷的0.1mol/l CaCl2溶液2ml，用枪轻轻吹打，重悬沉淀。

转移到一个离心管中，共8ml。

6. 冰上放置10min后，4℃条件下，4000r/min离心10min。

7. 沉淀用预冷的1.6ml 含有15%甘油的0.1mol/l的CaCl2溶液悬浮。

分装成200μl 的小份，共8管（40ml变为1.6ml浓缩25倍），-70℃保存备用。

二、溶液的配置1. LB培养基：1%蛋白胨（typtone）、0.5%酵母提取物（yeast extract）、1%NaCl，即10g蛋白胨，5g酵母提取物，10g氯化钠溶解在950ml水中，用1mol/LNaOH 调PH至7.0，在补足水至1L。

高压灭菌20分钟备用。

2. 0.1mol/l的CaCl2溶液：1.1g/100ml，称取1.1g CaCl2，加入双蒸水定容至100ml，滤膜过滤或高压灭菌，分装成10ml/小份，4℃保存。

另取8.5ml+1.5ml已灭菌甘油，甘油含量为15%甘油，分装成1ml/小份（10份）4℃保存。

3. 配置液体培养基时，高压灭菌20min备用；4. 配置固体培养基时+（1.5g/100ml）琼脂糖，然后高压灭菌20min。

自噬双标腺病毒( mRFP-GFP-LC3 )使用指南背景：自噬是细胞内的一种“自食(Self-eating )”的现象，凋亡是“自杀( Self-killing )”的现象，二者共用相同的刺激因素和调节蛋白，但是诱发阈值和门槛不同，如何转换和协调目前还不清楚. 自噬是指膜(目前来源还有争议，大部分表现为双层膜，有时多层或单层)包裹部分胞质和细胞内需降解的细胞器、蛋白质等形成自噬体，最后与溶酶体融合形成自噬溶酶体，降解其所包裹的内容物，以实现细胞稳态和细胞器的更新。

目前文献对自噬过程进行观察和检测常用的策略和手段有：通过western blot检测LC3勺剪切；通过电镜观测自噬体的形成；在荧光显微镜下采用GFP(-RFP) -LC3等融合蛋白来示踪自噬体形成以及降解。

近几年对自噬流的研究日趋增多，针对于此我们汉恒生物科技(上海)有限公司自主研发了用于实时监测自噬( 流)的mRFP-GFP-LC腺病毒，mRFP用于标记及追踪LC3, GF啲减弱可指示溶酶体与自噬小体的融合形成自噬溶酶体，即由于GF荧光蛋白对酸性敏感，当自噬体与溶酶体融合后GFP 荧光发生淬灭, 此时只能检测到红色荧光。

这种串联的荧光蛋白表达载体系统直观清晰的指示了细胞自噬流的水平，是我们自噬研究尤其是自噬流研究不可或缺的利器。

mRFP-GFP-LC3 腺病毒的操作收到病毒后的处理（一）、腺病毒的储存1、腺病毒采用冰袋运输。

（1）、收到病毒液后如未融化请置于-80 C冰箱，下次使用时再进行分装；（2）、如客户收到时腺病毒已融化，请直接分装后置于-80 C冰箱保存；若短期内用于实验，可分装部分于4C保存（尽量一周内用完）。

2、尽量避免反复冻融，否则会降低病毒滴度（每次冻融会降低病毒滴度10%）。

建议不要在-20 C下长期保存。

如果病毒储存时间超过6个月，应该重新测定病毒滴度。

3、建议收到病毒产品后根据实验需求自行分装或购买经过分装的小包装病毒产品（购买时请提出）。