质粒转染步骤

双荧光素酶报告实验质粒转染详细步骤及说明
1. 待测细胞在10 cm dish 中培养至80-90% 融合时，倾去培养液，用2ml PBS 洗涤细胞两次；
2. 加1ml Trypsin-EDTA solution, 混匀后，小心吸去胰酶溶液，37ºC 放置1-5分钟；
3. 加入2 ml 完全培养基，吹打使细胞形成单细胞悬液；
4. 血球计数板计数，将细胞稀释至1×10 6 细胞/ml；
5. 取100 μl 上述细胞稀释液加入96 孔板，使细胞密度达到1×10 5 个细胞/孔，混匀后于37ºC 5% CO 2 培养24 小时；
6. 在3 个1.5 ml EP 管中各加入50 μl 无血清培养基，分别加入0.2 μg，0.4 μg，0.8 μgpEX-1 质粒，混匀；取另一1.5 ml EP 管，加入150 μl 无血清DMEM，加入1.5 μl 转染试剂，充分混匀，室温放置5 分钟后将150 μl 平均3 等份对应加入含有质粒的3个EP 管，充分混合，室温放置20 分钟；
7. 吸去96 孔板中的培养液，将转染混合物逐滴加入96 孔板中，混匀后，在培养箱中
温育5 小时；
8. 吸弃转染液，加入100 μl 完全培养液。

37ºC 5% CO 2 继续培养, 24h 和48h 观察并拍照质粒转染效果图片。

瞬时转染实验步骤全文共四篇示例，供读者参考第一篇示例：瞬时转染实验是一种常用的基因转染技术，可用于将外源DNA或RNA导入到目标细胞中，以研究基因表达和功能。

本文将介绍瞬时转染实验的步骤及注意事项。

一、实验前准备1.1 制备转染试剂：根据所需的转染试剂种类，准备相应的试剂。

常用的转染试剂包括有机溶剂转染试剂（如Lipofectamine 2000）、阳离子聚合物转染试剂（如Polyethylenimine，简称PEI）等。

1.2 制备转染质粒：准备含有目标基因的转染质粒。

转染质粒应进行质粒提取、纯化并测序确认。

1.3 培养细胞：细胞应在培养皿中充分培养至70%～90%的浓度，以保证转染效率。

1.4 预热培养基：将足够的培养基提前预热至37℃，以用于细胞培养和转染。

二、转染操作步骤2.1 向细胞培养皿中加入转染试剂：按照转染试剂的使用说明书，向培养皿中加入适量的转染试剂，并在无血清培养基中混合均匀。

2.2 加入转染质粒：将准备好的转染质粒溶液滴加入培养皿中，注意避免空气泡。

2.3 孵育细胞：将培养皿放置在37℃的培养箱中孵育一定时间，通常为4～6小时。

2.4 更换培养基：在转染后适当时间内更换含有血清的培养基，以保证细胞正常生长。

2.5 收获样品：根据实验设计和研究目的，选择合适的时间点收获转染后的细胞样品。

三、注意事项3.1 转染试剂浓度：转染试剂的浓度应根据实验目的和细胞类型进行优化，以达到最佳的转染效果。

3.2 转染时间和转染效率：转染时间过长或过短都可能影响转染效果，应根据实际情况进行调整。

3.3 质粒浓度和纯度：转染质粒应具有足够的纯度和浓度，以确保转染效果。

3.4 细胞密度和状态：细胞应在良好的状态下进行转染，过高或过低的细胞密度都会影响转染效果。

3.5 实验控制组：应设置适当的对照组，以进行比较和验证实验结果的可靠性。

总结：瞬时转染实验是一种常用的基因转染技术，通过适当的实验操作步骤和注意事项，可获得可靠的实验结果。

LIPOFECTAMINE2000转染试剂转染步骤1.准备转染试剂：取出存储在-20℃的LIPOFECTAMINE2000试剂，并将其溶解在适量的去离子水或者PBS缓冲液中，制备转染试剂。

2. 根据实验需要确定转染的质粒DNA量和细胞数量。

一般来说，每个转染需要1-2ug的质粒DNA，细胞密度则根据细胞类型的不同而有所变化。

3.将准备好的转染试剂和质粒DNA混合在一起。

首先将质粒DNA加入到含有LIPOFECTAMINE2000的管中，并轻轻混合均匀，然后将混合物静置15-30分钟，使其形成脂质-DNA复合物。

4.在脂质-DNA复合物静置的同时，准备待转染的细胞。

将细胞用无血清培养基洗涤一次，并将其悬浮在新的无血清培养基中。

5.将静置好的脂质-DNA复合物滴加到细胞中。

将脂质-DNA复合物滴加到含有细胞的培养皿中，并轻轻摇晃培养皿，使复合物均匀分布在细胞表面。

6.将转染后的细胞培养在37℃的CO2培养箱中孵育。

具体培养时间视实验需求而定，一般来说，24-48小时后可以进行下一步实验。

7. 检测转染效率。

可以通过荧光显微镜观察细胞内是否表达了目的基因或荧光标记，也可以采用Western blotting或者RT-PCR等方法进行进一步的检测。

总的来说，LIPOFECTAMINE2000转染试剂转染步骤相对简单，但需要注意的是在每一步操作中都要轻柔并避免产生气泡，以确保脂质-DNA复合物可以均匀地与细胞相结合，从而提高转染效率。

同时，在实验过程中需要注意质粒DNA的质量和浓度，以及细胞的健康状态，这些因素都会对转染效果产生影响。

希望以上介绍对您有所帮助，祝您实验顺利。

质粒扩增、提取、转化和转染等操作程序60质粒扩增、提取、转化和转染等操作程序一、感受态细菌制备（CaCl2法）1. 从LB平板上挑取新活化的大肠杆菌单菌落，接种于5ml不加Amp的LB 培养基中，37℃振荡培养过夜（200r/min，至OD=1.5左右）。

2. 取0.5ml上述振荡过夜的菌液，转入含50ml的LB的三角烧瓶（1%）中，37℃条件下振荡培养2~2.5小时左右（200r/min），使OD600达到0.2~0.4左右（100μl测600nm时OD值）。

3. 将培养液50ml分装到4个10ml的离心管中，每管10ml，冰上放置10min，4. 4℃条件下，4000r/min离心10分钟，弃上清。

将离心管倒扣在吸水纸上，尽量倒尽管中的培养基。

5. 每管加入预冷的0.1mol/l CaCl2溶液2ml，用枪轻轻吹打，重悬沉淀。

转移到一个离心管中，共8ml。

6. 冰上放置10min后，4℃条件下，4000r/min离心10min。

7. 沉淀用预冷的1.6ml 含有15%甘油的0.1mol/l的CaCl2溶液悬浮。

分装成200μl的小份，共8管（40ml变为1.6ml浓缩25倍），-70℃保存备用。

二、溶液的配置1. LB培养基：1%蛋白胨（typtone）、0.5%酵母提取物（yeast extract）、1%NaCl，即10g蛋白胨，5g酵母提取物，10g氯化钠溶解在950ml水中，用1mol/LNaOH调PH至7.0，在补足水至1L。

高压灭菌20分钟备用。

2. 0.1mol/l的CaCl2溶液：1.1g/100ml，称取1.1g CaCl2，加入双蒸水定容至100ml，滤膜过滤或高压灭菌，分装成10ml/小份，4℃保存。

另取8.5ml+1.5ml已灭菌甘油，甘油含量为15%甘油，分装成1ml/小份（10份）4℃保存。

3. 配置液体培养基时，高压灭菌20min备用；4. 配置固体培养基时+（1.5g/100ml）琼脂糖，然后高压灭菌20min。

[说明]转染详细步骤大攻略转染详细步骤大攻略范例----真核重组表达质粒pDsRed-N1-NS1在A549细胞中表达按上海索莱宝生物科技有限公司去内毒素质粒小提试剂盒说明书方法进行质粒抽提，测得质粒浓度为410.32ng/µl。

将培养的A549细胞铺板，待细胞密度长到90%左右时，按lipo2000说明书转染A549细胞，36h后于荧光显微镜下观察DsRed-NS1融合蛋白的表达情况。

具体操作步骤如下: 1)质粒准备按上海索莱宝生物科技有限公司去内毒素质粒小提试剂盒说明书方法进行质粒抽提，具体步骤如下:(1) 取1-5ml细菌培养物，12000rpm离心1 min,尽量吸除上清(菌液较多时可以通过多次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中)。

(2) 向留有菌体沉淀的离心管中加入200µl溶液P1(请先检查是否已加入RNaseA),使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌细胞沉淀。

(注:如果菌块未彻底混匀，会影响裂解导致质粒提取量和纯度偏低)(3)向离心管中加入200µl溶液P2，温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解。

(注:混匀一定要温和，以免污染基因组DNA，此时菌液应变得清亮粘稠，所用时间不应超过5min，以免质粒受到破坏)(4)向离心管中加入250µl溶液P3，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，此时会出现白色絮状沉淀。

12000rpm 离心10min，用移液器小心地将上清转移到另一个干净的离心管中，尽量不要吸出沉淀。

(注:溶液P3加入后应立即混合，避免产生局部沉淀。

如果上清中还有微小白色沉淀，可再次离心后取上清)(5)加入1/5体积冰预冷的去内毒素清除剂，振荡混匀，溶液变浑浊，冰浴2min至溶液变清亮。

(6)37?水浴5 min，不时振荡，溶液又变浑浊。

12000rpm室温离心5min，溶液应分为两相，上层水相含质粒DNA，下层油状相含内毒素。

(7)将质粒DNA上层水相转移至新管，弃下层油状相，注意不要吸入油状相，重复抽提三次，即重复步骤5-7三次。

质粒扩增、提取、转化和转染等操作程序质粒扩增、提取、转化和转染等操作程序一、感受态细菌制备（CaCl2法）1. 从LB平板上挑取新活化的大肠杆菌单菌落，接种于5ml不加Amp的LB培养基中，37℃振荡培养过夜（200r/min，至OD=1.5左右）。

2. 取0.5ml上述振荡过夜的菌液，转入含50ml的LB的三角烧瓶（1%）中，37℃条件下振荡培养2~2.5小时左右（200r/min），使OD600达到0.2~0.4左右（100μl 测600nm时OD值）。

3. 将培养液50ml分装到4个10ml的离心管中，每管10ml，冰上放置10min，4. 4℃条件下，4000r/min离心10分钟，弃上清。

将离心管倒扣在吸水纸上，尽量倒尽管中的培养基。

5. 每管加入预冷的0.1mol/l CaCl2溶液2ml，用枪轻轻吹打，重悬沉淀。

转移到一个离心管中，共8ml。

6. 冰上放置10min后，4℃条件下，4000r/min离心10min。

7. 沉淀用预冷的1.6ml 含有15%甘油的0.1mol/l的CaCl2溶液悬浮。

分装成200μl 的小份，共8管（40ml变为1.6ml浓缩25倍），-70℃保存备用。

二、溶液的配置1. LB培养基：1%蛋白胨（typtone）、0.5%酵母提取物（yeast extract）、1%NaCl，即10g蛋白胨，5g酵母提取物，10g氯化钠溶解在950ml水中，用1mol/LNaOH 调PH至7.0，在补足水至1L。

高压灭菌20分钟备用。

2. 0.1mol/l的CaCl2溶液：1.1g/100ml，称取1.1g CaCl2，加入双蒸水定容至100ml，滤膜过滤或高压灭菌，分装成10ml/小份，4℃保存。

另取8.5ml+1.5ml已灭菌甘油，甘油含量为15%甘油，分装成1ml/小份（10份）4℃保存。

3. 配置液体培养基时，高压灭菌20min备用；4. 配置固体培养基时+（1.5g/100ml）琼脂糖，然后高压灭菌20min。

转染步骤范文转染是指将外源DNA导入到受体细胞中的过程，用于基因工程、基因治疗等研究和应用。

转染步骤是实现转染的关键步骤，包括细胞培养、转染试剂制备、转染试剂处理、细胞培养和分析。

以下是转染步骤的详细描述。

第一步：细胞培养在进行转染实验之前，首先需要培养并扩增所使用的细胞。

细胞的培养基因常见的有DMEM、RPMI等，培养基中会添加适当的酵素抑制剂（如胰酶）和生长因子，以促进细胞的生长和增殖。

第二步：转染试剂制备转染试剂可以是化学试剂，也可以是病毒载体或质粒DNA。

化学试剂常见的有聚乙烯亚胺（PEI）、脂质体、阳离子聚合物等。

病毒载体包括腺病毒、逆转录病毒、腺相关病毒、大肠杆菌之Coli phage等。

质粒DNA则是将外源DNA经过酶切和纯化处理得到的。

第三步：转染试剂处理在这一步中，将转染试剂与细胞一起孵育，以使转染试剂与细胞内部的DNA互相结合。

转染试剂的使用方法根据具体试剂的特点而定，常见的方法有磷酸钙共沉淀、脂质体包裹、病毒载体包装等。

第四步：细胞培养和分析在细胞孵育一定时间后，可以对转染效率进行分析。

常见的分析方法包括荧光显微镜观察、流式细胞术、PCR等。

通过这些分析方法，可以观察到转染后的外源DNA是否成功导入到细胞，并根据实验需要进行下一步操作。

除了以上步骤，还有一些实验时需要注意的要点，例如选择合适的细胞密度和培养时间、优化转染条件、进行有效杀菌等。

同时，也需要仔细阅读相关实验操作手册，并参考先前类似研究的文献，以确保实验的准确性和可重复性。

总结起来，转染步骤是进行基因转染的重要环节，包括细胞培养、转染试剂制备、转染试剂处理、细胞培养和分析。

通过精确执行每个步骤，并结合适当的方法和实验操作要点，可以高效地将外源DNA导入到受体细胞中，实现基因工程和基因治疗等研究和应用的目的。

基因编辑质粒载体/ 体外转录RNA 转染细胞方法基因编辑载体/体外转录RNA可以使用多种转染试剂进行转染,具体实验方法请参考试剂说明，这里以使用lipofectamin2000为例。

1) 以24 孔培养板操作为例（其他孔板各种的试剂用量，请参照“Lipofectamine2000 manual”），转染前一天，将0.5~2×10 5个细胞接种于培养板中，每孔中加入约500 μL 无抗生素的培养基，使转染时的细胞密度能够达到30~50％；2) 取1 μL/ 孔Lipofectamine2000（使用前轻轻摇匀），用50 μL Opti-MEM I Reduced Serum Medium 稀释。

轻轻混和后在室温孵育5 分钟；3) 取1 μg 质粒载体/ 体外转录RNA，用50 μL Opti-MEM I Reduced Serum Medium 稀释，轻轻混和均匀;4) 稀释后的Lipofectamine2000 经过5 分钟孵育后，与稀释后的质粒载体/ 体外转录RNA 轻轻混和，室温静置20 分钟，以形成载体- 转染试剂混和物/RNA- 转染试剂混和物；注意：稀释后的Lipofectamine2000 尽量在25 分钟之内，和质粒载体/ 体外转录RNA 混和，如果放置时间过长，可能导致转染试剂活性的降低。

5) 将载体- 转染试剂混和液/RNA- 转染试剂混和物加入含有细胞及培养液（约含400 μL）的孔中，轻轻摇晃孔板，使其混和；6) 在37 ℃的CO 2 培养箱中培养，4~6 小时后可将培养基换为含血清的完全培养基( 该步骤可以省略)；7) 如果载体含荧光基因，转染24 小时后即可在荧光显微镜下观察到荧光，一般转染后72 小时，收集细胞检测突变。

转染24~48小时后可利用载体表达荧光，通过流式细胞仪富集转染细胞，或通过载体表达puro，通过抗性富集转染细胞。

如果体外转录RNA 为荧光基因mRNA，转染6 小时后即可在荧光显微镜下观察到荧光，24~48 小时荧光强度较强，48 小时之后荧光强度逐渐降低，到120 小时基本消失。

慢病毒转染原理慢病毒转染是一种使用病毒来传播特定基因的技术，是生物工程应用与研究的重要技术之一，具有广泛的应用领域。

慢病毒转染指的是将外源基因特异性地转染到宿主细胞中，通过利用慢病毒扩散的能力，从而促进基因的表达。

慢病毒转染通常包括：（1）获取载体和转染感兴趣的目标基因；（2）预先在质粒中构建特异性包合体；（3）将此质粒与病毒膜融合，从而制备慢病毒载体；（4）移植所获慢病毒载体到宿主细胞，由此开启转染过程，最后完成基因的表达。

慢病毒转染的具体步骤有：（1）质粒构建：首先，在可编辑的微型重组质粒中准备质粒DNA。

质粒DNA的构建一般由多个子部分组成，包括目标基因和启动子-表达尾序列等。

启动子-表达尾序列是控制基因表达水平的重要位点，启动子负责基因转录的起始，表达尾序列则参与基因识别及基因表达的正常运转。

（2）质粒载体融合：将构建好的质粒转染到慢病毒膜中，使其分离出慢病毒载体。

慢病毒载体是一类利用慢病毒传播外源基因的重要工具，由慢病毒膜表示的特异性配体在外源基因介导下特异性的融合，形成慢病毒载体，此慢病毒载体则有助于外源基因的把握及转染。

将挑选好的慢病毒载体转染到宿主细胞中，注入体内，在此过程中，外源基因和慢病毒膜进入宿主细胞，开始与宿主细胞相互作用。

当宿主细胞受到诱导时，慢病毒膜即发生膜融合并释放外源基因，基因转染开始，外源基因进入宿主细胞，并以慢病毒形式扩散，使病毒的表达物最终表达出来，形成所需的目的基因产物。

慢病毒转染是一类利用病毒传播外源基因的重要技术，已经在基因工程、实验室表达、转基因生物技术、基因治疗等研究方面发挥了重要作用，为基因工程技术提供了重要理论依据和技术支持。

慢病毒转染技术已被广泛地应用于各个领域，在医疗和药物研发方面取得了重要的成果，在包括基因治疗在内的生物技术的发展中起着重要的作用。

转染步骤及经验（精华）一、基础理论转染是将外源性基因导入细胞内的一种专门技术。

分类：物理介导方法：电穿孔法、显微注射和基因枪；化学介导方法：如经典的磷酸钙共沉淀法、脂质体转染方法、和多种阳离子物质介导的技术；生物介导方法：有较为原始的原生质体转染，和现在比较多见的各种病毒介导的转染技术。

理想细胞转染方法，应该具有转染效率高、细胞毒性小等优点。

病毒介导的转染技术，是目前转染效率最高的方法，同时具有细胞毒性很低的优势。

但是，病毒转染方法的准备程序复杂，常常对细胞类型有很强的选择性，在一般实验室中很难普及。

其它物理和化学介导的转染方法，则各有其特点。

需要指出的一点，无论采用哪种转染技术，要获得最优的转染结果，可能都需要对转染条件进行优化。

影响转染效率的因素很多，从细胞类型、细胞培养条件和细胞生长状态到转染方法的操作细节（见后文）。

二、转染操作流程（以常用的6孔板为例）(1) 细胞培养：取6孔培养板，以3x104/cm2密度铺板，37℃5%CO2培养箱中培养至70%～90%汇合。

(不同细胞略有不同，根据实验室优化的条件进行，汇合过分，转染后不利筛选细胞)。

(2) 转染液制备：在EP管中制备以下两液(为转染每一个孔细胞所用的量)A液：用不含血清培养基稀释1-10μg DNA，终量100μL，B液：用不含血清培养基稀释对应量的转染试剂，终量100μL；轻轻混合A、B液（1:1混匀），室温中置15分钟，稍后会出现微浊现象，但并不妨碍转染。

(3) 转染准备：用2mL不含血清培养液漂洗两次，再加入2mL不含血清及PS的培养液。

(4) 转染：把A/B复合物缓缓加入培养液中（缓慢滴加），轻轻摇匀，37℃温箱置6～8小时，吸除无血清转染液，换入正常培养液继续培养。

三、转染注意事项1. 血清A. DNA-阳离子脂质体复合物形成时不能含血清，因为血清会影响复合物的形成。

B．一般细胞对无血清培养可以耐受几个小时没问题，转染用的培养液可以含血清也可以不加，但血清一度曾被认为会降低转染效率，转染培养基中加入血清需要对条件进行优化。