HEK-293T细胞转染操作步骤

293细胞转染操作方法一、转染前的细胞培养准备1.1 细胞培养基的准备：使用DMEM（Dulbecco's Modified Eagle Medium）培养基，添加10%胎牛血清（FBS），1%青霉素/链霉素（Penicillin-Streptomycin）混合液，将其预先置于37摄氏度恒温培养箱中加热。

同时，准备冰上的无血清DMEM培养基。

1.2 细胞传代：将293细胞稳定传代到80%的密度，并将细胞分装到培养皿中。

培养皿通常使用直径为6 cm的培养皿。

1.3 细胞接种：将培养皿中的细胞用10 ml DMEM培养基吸取，将细胞均匀分布在一个新的培养皿中。

1.4细胞培养：将新的培养皿放入37摄氏度恒温培养箱中，在5%CO2和95%湿度条件下培养。

二、转染试剂的准备2.1 转染物质的选择：根据实验需求，选择合适的转染试剂，如磷脂体试剂（Lipofectamine 2000）、Calcium Phosphate（CaPO4）沉淀法、聚乙烯亚胺（PEI）等。

2.2转染载体的制备：将所需的转染载体提取并纯化，测定其浓度和纯度。

2.3试剂的稀释：按照转染试剂说明书的要求，将其稀释至适宜浓度。

三、转染操作的步骤3.1细胞处理：在进行转染操作前，需要将细胞从培养皿中用无酶消化的方式将其析出，溶于含血清和无血清的培养基中，计算细胞的数量和体积，用无酶消化的方式将其析出。

3.2细胞分装：将分装的细胞放入每个培养皿中，并用光学显微镜观察细胞的黑暗度和数量。

3.3准备转染混合物：将适量的转染载体与转染试剂混合，置于室温静置15-30分钟，使其相互作用发生。

3.4转染操作：将转染混合物均匀滴加到细胞上，用手轻摇培养皿以均匀涂抹。

转染时间通常为4-6小时。

3.5转染后处理：转染时间结束后，将细胞培养基进行更换，并在体外长时间培养。

四、注意事项4.1转染试剂和转染载体的选择：需要根据实验需求选择合适的试剂和载体，不同的试剂和载体对细胞的转染效率和细胞毒性有所不同。

293T逆转录病毒制备（慢病毒包装）1.转染前一天，10%FBS DMEM不含双抗培养基种3*10^6细胞至10cm dish，培养24h（3盘 NC #3 #4）2. a.用OptiMEM 470ul稀释Fugene9 30ul(NC/Sh#3/Sh#4)，充分吹打混匀，RT5minb.Target plasmid：3.75ug (NC/Sh#3/Sh#4)Gag-pol：3.75ugVSVG：2.5ug（8/5ug pCDH 6/3.33ug psPAX2 2/1.67ug PMD）c. 将上述准备的质粒混合液滴加到optimem与Fugene9的混合液中，RT静置20min；转染混合物逐滴加至细胞中3. 转染24h之后，弃上清液，更换新鲜培养基，置37°细胞培养箱中继续培养病毒液的收集1.转染48h 后（此时293T长满），收集上清液于15ml 离心管中，3000rpm离心20min2.将上清液用0.45um滤头过滤,再向10cm dish 加10ml培液3.24h之后，再次收集上清液，0.45um滤头过滤，随后保存于-80°冰箱中。

慢病毒感染目的细胞1.需要提前一天铺板至8个10cm dish中（细胞接种个数是1*10^6），以保证感染时的密度为30-40%；（Control，NC，#3，#4 PLC和7405各四盘）2.贴壁后弃上清液，配置25ml+40ul （10mg/ml）polybrene混匀（24ml）培养基DMEM (10％FBS不含双抗) , 6个dish加3ml混匀液，然后加入3ml病毒2盘Control组只加3ml混匀液+3ml DMEM（10%FBS不含双抗）10cm dish置于细胞培养箱中再培养48h3.48h后，弃上清，更换各自新鲜培养液8ml，并加入puromycin筛选PLC/PRE/5 0.6ug/ml（4.8ul 1mg/ml puromycin）Bel-7405 0.5ug/ml（4ul 1mg/ml puromycin）4.筛选2-3天之后，观察dish中细胞生长的状况，判断筛选是否成功(比较Control和感染组生存情况)5.若筛选成功，继续加入相应浓度抗生素筛选（注意杀菌）6.WB验证。

293T细胞培养攻略1.培养基准备293T细胞通常使用DMEM（Dulbecco's Modified Eagle Medium）作为培养基，配以10%胎牛血清（FBS），1%青霉素/链霉素（Penicillin/Streptomycin）。

在培养293T细胞之前，首先将适量的DMEM加热至37°C，并将相应数量的胎牛血清和抗生素加入其中。

2.细胞传代传代细胞是保持293T细胞健康生长和细胞性能的重要步骤。

当细胞达到80-90%的密度时，可以开始细胞传代。

首先，用无菌PBS（磷酸盐缓冲液）将细胞培养瓶中的培养基洗涤一次，然后用0.25%胰酶/EDTA（乙二胺四乙酸）溶液将细胞溶解5-10分钟。

溶解后，加入与胰酶/EDTA液体相等的培养基，轻轻悬浮细胞，并将其移至新的培养瓶中。

将新的培养基加入新瓶中，以使其达到适当的细胞密度。

3.293T细胞的培养条件4.细胞转染293T细胞被广泛用于转染实验。

细胞转染是将外源DNA转运到293T 细胞中的方法，以研究基因功能或进行蛋白表达。

293T细胞的易于转染性质使其适合于多种转染实验，包括常规的钙磷法和化学法（如聚乙烯亚胺）以及电穿孔法。

在进行转染实验之前，应将细胞培养至80-90%的密度，并在转染之后对其进行恢复。

5.结束实验时的保存和冻存细胞在完成实验后，如果有需要保存细胞的需求，可以将293T细胞冻存。

为此，收集细胞，并用DPBS（无菌磷酸盐缓冲液）洗涤细胞。

然后，用0.25%胰酶/EDTA液解细胞5分钟，并加入相等体积的培养基以停止胰酶的作用。

将细胞离心，并以适当的速度冻存保护液（如10%DMSO和90%FBS）重新悬浮细胞。

将细胞悬浮液分装至冻存管中，并使用液氮保存。

总结：293T细胞是一种常用的细胞系，在生物医学研究中发挥着重要作用。

通过遵循上述培养攻略，可以获得高质量和可靠的293T细胞培养结果。

有针对性的细胞传代、定期更换培养基、温度和CO2的适当控制以及正确的细胞转染和细胞冻存步骤可以确保细胞的生长和稳定性，为细胞实验提供最佳条件。

Hela细胞传代培养操作步骤1．观察培养基是否正常，细胞状态如何，细胞密度如何，决定是否传代。

观察时拧紧盖子。

2．加热PBS、versene、培养基，(提前做好) 瓶子不要倒着放，不要让液体接触到瓶塞。

3．打开超净台（先开风机，后开照明），用75%乙醇清洁台面，点燃酒精灯。

不要把废液缸拿出去倒，如果废液太多，可以用其他容器先装废液。

取小离心管一个，置于架子上。

4．取尖吸管、吸量管各一支，放置在专用的架上。

放置的方式，注意吸管、吸量管前端都不要与架子接触。

5．取待传代的细胞。

打开versene，用酒精灯外焰烧。

烧吸管时距离酒精灯心远些，不要把渣滓带进去。

把试剂拿入台子的时候，尽量平稳，不要让试剂碰到瓶口。

6．用吸量管吸取旧的培养基，置离心管中，吸量管加入versene，然后将versene瓶收起来。

（加versene 主要是为了将旧培养基洗去）。

在离心管中间部分将液体加入。

吸液体和加液体时都不要对着细胞。

7．打开胰酶，然后将versene弃掉。

换新管，用尖吸管吸取适量胰酶加入。

加胰酶后，尽快放平，使细胞消化时间一致。

8．将细胞放入37度孵箱。

放孵箱2min, 收胰酶，打开PBS. 之后拿出来镜下随时观察。

使用二次消化法，去除容器中残余的细胞。

别忘了用旧培养基中和。

9．取细胞，镜下观察消化情况。

消化程度合适之后（细胞变圆，但不漂起），用尖吸管弃去胰酶，取离心管中的培养基加入细胞，吹打，至所有细胞从培养皿底部脱落下来。

用PBS洗细胞，versene对细胞有毒性，且不能被血清中和。

然后吸取至离心管中，800 rpm离心5分钟。

10．吸量管吸取适量培养基加入新的培养皿中。

11．细胞离心毕，用吸新培养基的管弃去上清，先把泡沫吸走。

换吸量管吸取培养皿中培养基适量，加入离心管，小体积混匀，将细胞重悬，尖吸管吹匀。

12．擦计数板，用枪吸10ul的液体，计数。

不要把枪伸到离心管内。

13．吸量管吸取细胞悬液，加入新的培养皿中。

派真生物HEK-293T/ACE2 细胞稳转株使用说明书HEK-293T/ACE2 细胞稳转株HEK-293T/ACE2 细胞稳转株ACE2即血管紧张素转化酶II（Angiotensin-converting enzyme2）是一种Ⅰ型膜蛋白,其包括一个N端肽酶结构域( peptidasedomain,PD)和一个C端 Collectrin样结构域（Collectrin-ikedomain,CLD）。

ACE2的PD为冠状病毒的S蛋白提供了直接结合位点。

冠状病毒因其病毒脂质层外由棘突蛋白） spike protein,S蛋白）构成的冠状突起而得名。

冠状病毒通过S蛋白与靶细胞表面特定受体结合,然后进入细胞复制并引起宿主感染。

冠状病毒的S蛋白包含S1及S2两个亚单位,其中S1包含受体结合域（RBD）,RBD直接与血管紧张素转换酶2（ACE2）结合,S2负责与宿主细胞膜融合。

当S1与宿主受体ACE2结合时,S2上的裂解位点暴露并被宿主蛋白酶切断,此过程对于病毒感染十分重要。

本细胞系是将ACE2过表达慢病毒感染293T细胞并筛选得到的稳定株。

HEK-293T/ACE2 细胞稳转株产品描述产品名称：中文名称：包装规格：特性蛋白：HEK-293T/ACE2过表达人源 ACE2 的人肾上皮细胞2管（细胞数1E+7个/管）过表达人的血管紧张素转化酶 2 蛋白（ACE2）建议第一次 1:2 传代。

2 天换液10%DMSO +90%完全培养基Puro 嘌呤抗性传代方法: 传代情况：冻存条件：备 注：检测报告：提供感染滴度数据、293T /hACE2感染图片或荧光素酶表达量结果派真生物复苏细胞：将含有2mL 细胞悬液的冻存管在 37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入 5mL 培养基混合均匀。

在 1000rpm 条件下离心 5 分钟，弃去上清液，补加 4-6mL 完全培养基后吹匀。

然后将所有细胞悬液加入 10cm 皿中培养过夜，培养过夜。

293细胞转染操作方法293细胞是人类胚胎肾细胞中一个常用的细胞系，广泛应用于生物医学研究和生物工程领域。

细胞转染是在细胞外导入外源DNA或RNA分子，从而使目标细胞表达、产生特定蛋白或影响细胞功能的一种实验方法。

293细胞的转染操作方法如下：1.细胞培养和处理：a.293细胞的培养：将293细胞维持在培养基中，并常规进行细胞的传代培养，细胞密度应在对应的培养瓶内保持在适宜范围（通常为70-80%的瓶内细胞密度）。

b.细胞处理：将需要转染的293细胞培养至适宜的状态，通常为对数生长期的细胞。

2.转染试剂的制备：a.转染试剂的制备：根据转染试剂的类型，如钙磷共沉淀、电穿孔和脂质体介导转染等，选择相应的试剂制备。

b.转染试剂的优化：通过调整试剂的浓度、PH值、温度等参数，优化转染试剂的表现以达到最佳的转染效果。

3.转染操作：a.将培养好的293细胞均匀地分配到培养板或培养瓶中。

通常情况下，在转染前24小时适宜添加细胞培养液以维持适宜的细胞密度。

b.将目标DNA或RNA与转染试剂混合。

根据转染试剂的要求和实验的设计，将目标表达物与相应的试剂按照比例进行混合。

混合过程中避免产生气泡。

c.加入混合溶液到培养板或培养瓶中的293细胞中。

将混合溶液均匀地加于细胞上，轻轻摇晃培养瓶以保持溶液分布均匀。

置于恒温培养箱中；通常转染时间为4-6小时，有的转染时间会更长。

d.保持适宜的培养条件，转染后培养细胞至少24小时至72小时，以期获得最佳的表达或功能分析效果。

4.转染后的细胞处理：a.按照实验设计和操作需要，提取或处理转染后的细胞。

可以根据所需，对细胞进行蛋白抽提、RNA提取、药物处理等。

b.需要注意，转染试剂本身可能对细胞有毒性，因此需要对转染后的细胞进行相应的生存性分析，并优化培养条件以提高细胞的存活率和功能表达效果。

这是293细胞转染的一般操作方法。

具体操作时，需要根据实验设计和试剂选择进一步调整操作参数。

客服电话： KOP293瞬时转染蛋白表达系统使用指南（3.3版）1.产品概述本系统适合于HEK-293细胞及其它293细胞的高密度悬浮培养、DNA瞬时转染及蛋白表达。

为确保使用效果，建议用户在使用本系统前详细阅读此使用指南。

此系统所包含的试剂可在本指南末页附录中查找，用户可根据需要自行搭配使用。

2.实验步骤本实验方法根据HEK-293细胞的三角烧瓶悬浮培养经验总结而成，但此蛋白表达系统同时适用于其它悬浮培养方式的293细胞的DNA转染及蛋白表达。

2.1转染前细胞培养1、将HEK-293细胞置于5%的CO2恒温摇床中（使用其它浓度的CO2可能会严重影响细胞培养效果），37℃、120rpm恒温震荡培养（具体转速可根据用户培养箱摇床种类及实际培养情况自行调节）。

传代时，需先做细胞计数和观察细胞活率，尽量选择密度在3-6×106个/毫升的高活率细胞进行传代培养。

过高培养密度的细胞在传代培养后有可能会出现生长速度缓慢、培养密度降低等生长状态的变化，并直接影响重组蛋白表达等后续应用效果。

2、传代培养时建议传代后的细胞密度为0.3×106个/毫升，一般每4天需传代1次（或传代密度为0.6×106个/毫升，每隔3天传代1次）。

本培养液可支撑的最高细胞密度约为1.3×107个/毫升，细胞在达到此密度时存活率一般仍可保持在95%以上。

3、若在培养过程中出现死细胞数过多的状况，应把细胞丢弃，使用新的细胞。

2.2转染细胞的准备a.在细胞瞬时转染前需确定其细胞密度及存活率。

为确保转染效果，建议使用生长处于指数期（密度约为2~4×106个/毫升）、存活率大于98%的细胞转染；b.细胞无需离心，若细胞密度为2.0×106个/ml时，则可直接转染，若细胞密度>2.0×106个/ml，则需兑入新鲜的KOP293培养液，将细胞密度稀释成2×106个/毫升（客户也可根据自身经验摸索合适的转染密度）；c.摇瓶置于5%的CO2恒温摇床中，37℃、120rpm恒温震荡培养10min后开始转染。

Lipo293转染试剂是一种高效的转染试剂，特别适用于贴壁生长的HEK293、HEK293T、HEK293A、293FT等293系列细胞的转染。

以下是Lipo293转染试剂的使用说明书：适用范围：Lipo293转染试剂适用于贴壁生长的HEK293、HEK293T、HEK293A、293FT等293系列细胞的转染。

转染步骤：（1）准备转染试剂和DNA：按照推荐的DNA用量，将DNA溶解在无菌水中，然后与Lipo293转染试剂按照1:1的比例混合。

（2）细胞处理：将细胞按照推荐的培养条件在细胞培养箱中培养至适宜的密度。

（3）转染：将DNA-Lipo293复合物与细胞混合，并轻轻摇晃，使复合物均匀分布。

（4）培养：将转染后的细胞继续培养，期间注意观察细胞的生长状态。

注意事项：（1）使用高质量的DNA：为了获得最佳的转染效果，建议使用高质量的DNA。

（2）细胞密度和状态：转染前，细胞需要处于良好的生长状态，密度适宜。

（3）保存条件：Lipo293转染试剂应保存在4℃或-20℃的条件下，避免反复冻融。

（4）过敏反应：对于过敏体质的用户，建议在使用前进行皮肤过敏试验。

293T 细胞培养1.培养基: DMEM =丙酮酸钠++10%血清++青链霉素2.复苏：37 度融化后，擦干冻存管酒精擦，细胞加入15ml 离心管，加5ml 培养基，500g 离心5min，弃上清，加1ml 培养基重悬后加入到培养瓶中，5~6ml 左右，记得晃匀。

3. 传代:吸出旧培基，加5mlPBS 洗一遍，用移液管加1ml 胰酶，洗一遍吸出，37 度放1min 左右计时，看到大片大片脱落了即加入新培基吹打，吹洗充分后，吸1ml加到事先加好10ml 新培育基的新瓶里。

293T 细胞是用5 型腺病毒75 株系转化，含有Ad5 E1 区的人胚肾亚三倍体细胞系，是一种E1 区缺陷互补细胞系。

293T 细胞是贴壁依赖型呈上皮样细胞，表现出典型的腺病毒转化细胞的表型，细胞允许Ad5 和其他血清型腺病毒在其上增殖。

哺乳细胞的大规模培养方式有三种：贴壁培养、微载体培养、无血清悬浮培养。

这三种方式均可用于293T 细胞的大规模培养。

293T 细胞在无Ca2+或含Ca2+培养基中可同样生长，也可生长在血清浓度降低的培养基中。

单层培养细胞在5-10％FBS-DMEM 中能生长很好。

一般来讲，1:10 传代后，一周可以长满。

严禁过度生长，这点很重要。

因为会导致细胞密度加大和堆积，影响病毒斑的形成和转染，传代时也不易打散。

悬浮的293T 细胞很容易大规模培养，但不容易长期保持稳定。

293T 细胞在传代120 次以后，其表型可能改变，生长状况不再完全是单层的了，偶尔会形成局部的细胞成团聚集，应立即抛弃，重新引入新传代的细胞。

293 细胞培养特性：1、细胞明显适应酸性环境,pH 值在6.9～7.1 时,可顺利贴壁生长, 换液293T 时动作要轻。

一般用高糖的DMEM 培养基。

2、传代：倒去废液，PBS 洗一次（轻），用0.02%EDTA 与0.25%Trypsin 消化，生长良好细胞，培养瓶中轻摇,使之流遍所有细胞表面,即将其吸除或弃去消化30s，然后吸去，再让剩下的EDTA/Trypsin 作用30s,镜下观察细胞脱落,就可加DMEM 终止消化，反复吹打至细胞全成单个悬浮细胞即可。

qq ：439572370HEK-293是用DMEM 培养基培养吗？
HEK-293细胞是我在锐赛生物实验室做项目时常培养的细胞，DMEM+10%血清+双抗+谷氨酰胺，这类的细胞贴壁性不是太强，所以不要消化过久，容易损伤细胞。

状态较好的293细胞
细胞生长较快，一般1:3~1:5传代，30%~50%融合度2-3
天即可长满。

细胞状态不好后会变瘦、产生大量黑点（细胞碎片）。

网友咨询：我们这里的293转染质粒效率一直不高，
各种方法均试过了，很少能达到50%，老板说他在
国外做293转染很容易达到80%以上。

我想问一下哪里有好的293细胞卖？非常感谢。

答：293系列的细胞都是非常好转染的：注意点：
1.转染前细胞的铺板密度、细胞状态
2.转染的时间
3.转染试剂与质粒的比值
干扰载体转染293T 细胞48h 的图片，供参考。

293T 细胞生长速度更快，形态较293A 细胞小，贴壁性比293
细胞弱很多，消化时间更要注意，没培养过的刚接手细胞要在注意留种的同时多试验消化几次，掌握经验值。

293
细胞常用于腺病毒包装、293T
细胞常用于慢病毒包装。