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用ImagePro_Plus_分析免疫组化图片

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用ImagePro_Plus_分析免疫组化图片共39页

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用ImagePro_Plus_分析免疫组化图片
16、人民应该为法律而战斗，就像为 了城墙 而战斗 一样。 ——赫 拉克利 特 17、人类对于不公正的行为加以指责 ，并非 因为他 们愿意 做出这 种行为 ，而是 惟恐自 己会成 为这种 行为的 牺牲者 。—— 柏拉图 18、制定法律法令，就是为了不让强 者做什 么事都 横行霸 道。— —奥维 德 19、法律是社会的习惯和思想的结晶 。—— 托·伍·威尔逊 20、人们嘴上挂着的法律，其真实含 义是财 富。— —爱献 生
21、要知道对好事的称颂过于夸大，也会招来人们的反感轻蔑和嫉妒。——培根 22、业精于勤，荒于嬉；行成于思，毁于随。——韩愈
23、一切节省，归根到底都归结为时的节省。——马克思 24、意志命运往往背道而驰，决心到最后会全部推倒。——莎士比亚
25、学习是劳动，是充满思想的劳动。——乌申斯基
谢谢！

IPP使用教程

IPP使用教程

Image pro-Plus6.0 使用教程目录一、入门 (2)二、AOI技巧（1） (9)三、AOI技巧（2） (14)补充：不规则区域计数 (20)四、编制宏 (23)五、计数 (27)六、校正标尺 (33)七、几何测量 (41)八、图象分析策略 (43)九、其他有趣功能 (45)十、光密度 (51)十一、免疫组化光密度测量 (56)十二、macro (58)十三、荧光强度测量 (64)感谢丁香园战友:hbchendl 提供教程畅想先锋-整理2010.07.01一、入门既然是处理图片，当然是先要打开一张要处理的图片嘛。

在你开始学习使用IPP 之前，我假定你是会初步使用office 及photoshop 等常用程序的。

如果一点电脑常识也没有，那还是先学点简单的程序再回来玩IPP。

因此我跳过了打开图片，copy 、paste、象素的概念之类最基础的知识与操作。

这些用不着我来讲。

这张照片中的黄色部分是免疫组化染色的阳性表达成分。

处理目标是通过测量图片中黄色部分的"黄"度来反映相应蛋白表达的的"量"。

对该图片进行观察，可以看到图片中主要有三种主要颜色，一是染成蓝色的细胞核，二是呈现出黄色的胞浆，三是细胞间的空隙区域，呈现出浅蓝色，是为背景。

所以首先要把图片中呈现黄色的区域给挑选出来，然后才是测量这些挑出来的区域的各种测量参数，如面积、平均半径、周长、光密度等等。

这部分需要挑出来进行测量的区域是我们最感兴趣的地方，叫作AOI(area of interest)。

AOI 是IPP 中最有用最重要的概念。

如何能够准确地选取AOI 就是使用IPP 的关键操作。

一旦准确地选取了AOI，下面的测量分析就好办了。

在其他的测量软件中，选择这种不规则的区域一般只能用手拖着鼠标来画，而在IPP 程序里，可以通过设置颜色范围让电脑来帮助你选择这些不规则区域，这样的选择就准确多了。

可以说，使用IPP 的要点就是灵活地使用各种AOI 工具准确地把那些需要测量的区域给挑选出来。

手把手教你使用Imagepro-Plus(1.入门

手把手教你使用Imagepro-Plus(1.入门

手把手教你使用Imagepro-Plus(1.入门)(修订0700905) - Welcome to Forum
mxh8174
2006-07-12 10:22
非常感谢，我已从网上下载下来了一个图像分析软件可是自己研究了好一阵还是一 头雾水，谢谢无私的奉献，使我有为实验节省了一点经费。祝工作顺利！
发贴: 2 积分: 0 得票: 0 状态: 离线
锦上添花：SCI论文修改润饰
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2006-04-21 07:54 陈老师，可否给我发一个中文说明书呢？英文水平太差了！感谢哦！ andybalake@
• 国际著名遗传学家谈家桢院士迎来百岁华诞
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2006-04-22 17:23
jss2004
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2006-09-22 15:59 受益非浅，谢谢
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手把手教你使用Imagepro-Plus(1.入门)(修订0700905) - Welcome to Forum
医学文献看不懂怎么办？
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2005-12-30 11:03

IPP-分析免疫组化图片 ppt课件

IPP-分析免疫组化图片 ppt课件

25
2.1测定整张照片的光密度-图象分析仪
其测定原理有点象分光光度计，直接测定切片 的整体光密度。
可以根据照片上象素点的亮度来区分测定区域 其缺陷是显而易见的。复染上的其他颜色的染
料也会产生光密度吸收，导致严重的干扰。
PPT课件
26
2.2 抽样测量光密度
在彩色电子图片上选取目标颜色区域，抽样测 量这些小区域的灰度值，取其平均值作为比较 染色深浅的指标。
PPT课件
15
哪一个染色物更多？
染色区域颜色深度接近，染色面积有差异。
PPT课件
16
使用不同的area会得到不同的结论 要结合切片情况来判断。
IOD对整张图片的面积作平均。 IOD对特定组织区域的面积作平均。 IOD对显色的组织区域作平均。
PPT课件
17
对整张图片区域进行平均的情况比 较少，这张图片中黄色的IOD值主 要来自于中间一块区域内。
PPT课件
9
1.3比较两张照片的染色物质量的差别
两张照片染色深度一样，染色面积大的质量大
照片A
照片B
PPT课件
10
比较两张照片的染色物质量的差别
两张照片染色区域面积相同，染色深的质量大
照片A
照片B
PPT课件
11
这回该怎么看？
A的颜色深，面积小。 B的颜色浅，面积大。
照片A
照片B
PPT课件
8
1.2定量分析的指标： IOD ( Integrated option density ) 与Mean Density
将图片上各点的光密度值累加起来，得到IOD。 此值与目标物质的总量成正比。
IOD值除以有效目标分布区域的面积，得到 Mean density，此值反映了目标物质的单位面 积浓度。对样品照片进行数字图像分析比较时， 就是比较它们之间的平均光密度值的大小。

用ImagePro-Plus-分析免疫组化图片ppt课件

用ImagePro-Plus-分析免疫组化图片ppt课件

1.6
1.2
0.8 显著性
差异
0.4
0.2
0
阳性样品
0.1
阴性样品
1.2 1.1
1.0
无显著 性差异
背景
背景+阳性样品 背景+阴性样品
扣背景后依然没有显著性差异
阳性样品
阴1性.6样品
背景
1.2
阳性样品-背景
阳1性.2样品-背景
0.8
0.4
0
阳性样品
1.2
0.1
1.1
0.1
1 01..21 0.1
0.1 0.1 0.1 1.0
应当把照片存为无损压缩格式TIFF
特别是对于染色较浅的图片，保存为jpeg格式 后会损失亮度细节，导致测量误差增大。
注意那些 马赛克
总结拍摄注意事项：
调整显微镜光源亮度（电压9伏），足够白， 足够亮。
调整相机曝光时间，使背景呈现白色。灰度值 最好能达到230以上。
确认相机未使用自动白平衡功能。但要使用手 动校正白平衡功能校正背景色彩为纯白色。
3.用IPP分析免疫组化图片的过程
拍摄样品照片。 选取图片上具有染料色调的区域（AOI，area of
interesting）。 测量该区域的IOD。 选择并测量有效统计区域的面积 计算光密度平均值IOD/area（ mean density ） 计算同一实验组切片各照片的平均及标准差。 用统计学方法分析各实验组的平均mean density之间
处理照片时用的却是灰度
各种图象被拍摄成照片进行数字图象处理时， 计算机是对照片的灰度进行测量和计算的。为 了定量物质含量，最后还是需要转换为OD值 来表示。
所以对免疫组化照片的分析结果应该是一个 OD值，光密度。不应该是灰度。

IPP 分析免疫组化图片(教学课件)

IPP 分析免疫组化图片(教学课件)
有的ccd具有手动较正色温的功能可以较正一下背景色调但暗背景既使不偏色也是影响分析结较暗的背景值对分析结果的影响020110121104081216阳性样品阴性样品背景背景阳性样品背景阴性样品显著性差异无显著性差异扣背景后依然没有显著性差异阳性样品1201阴性样品1101背景01阳性样品背景0201阳性样品背景0101111201021004081216阳性样品阴性样品背景阳性样品背景阳性样品背景注意误差线增大了依然没有显著性差异不能使用相机的自动白平衡自动白平衡功能是相机根据照片总体色彩情况自动对每张照片进行白平衡校正
255
精品 PPT 模板
Optical Density: 吸光物质的光学密度.
被测物质的量越多，光密度(OD值)越高，透射出的光越少，反 映在照片上就越黑。
OD值与物质的量直接相关，数字图象上点的灰度值与对应物 质OD值成对数关系，符合朗伯-比尔定律。
理论上OD值是从零到无穷大。实际应用中，OD值的范围常用 0-2.0或者0光度计与酶标仪的测定值是OD值 透射的显微镜图象上的光强度要用OD值 蛋白电泳条带的测量也是OD值。 萤光显微镜及萤光分光光度计的测量值是萤光强度
(Fluorescence intensity) 用EB染色的DNA凝胶电泳条带也是萤光强度，但处
理方法与光密度相同，故也用OD值。这个OD与前面 的OD又有不同的意义。它就是荧光的光密度。反映 着荧光物质的多少。
应该拍摄得较明亮。 各种拍摄条件确定后，就必须使用这个条件一次拍摄完所有的照
片。以保证它们的曝光一致。
精品 PPT 模板
控制相机曝光时间
要把相机曝光时间控制到使视野中空白的地方 呈现纯亮的白色。
拍摄出的照片上，没有组织的空白处的背景灰 度值应达到230左右。可以使用图象分析软件 测量一下空白处的背景灰度值。低于230的背 景灰度值很容易产生色彩的偏离，会影响到图 像分析数值的偏差。同时背景灰度值也不宜过 高。

自动批量计算IPP60免疫组化图片的光密度值

自动批量计算IPP60免疫组化图片的光密度值

自动批量计算IPP6 0免疫组化图片的光密度值解决问题:计算指定区域的面积(area)以及该区域内部特定染色部分的累积光密度(IOD)，从而计算出该区域内特定染色物的平均光密度(meandensity=IOD/area)。

在确定了分析条件后(IntensityCalibration、Segmentation及Countingoption),可以一次性批量处理指定文件夹中所有图片，测量数据输出到excel中进行后续处理。

主要应用于免疫组化图片的分析，也可以应用于其他类似图片。

适用版本:Pathology4.scr适用于IPP4.x，Pathology5.ipm适用于IPP5.x，Pathology6.ipm适用于IPP6.x。

准备工作说明:1关于颜色选取做一下说明。

对于一个彩色图片，利用Count/SizeManual来选择色彩范围的时候，可以看到Segmentation有两个选项页，分别为"HistogramBased"和"ColorCubeBased"。

每次启动IPP时候，对于一个彩色图像，打开"Count/Size"中的"Segmentation"对话框，它的激活选项为"ColorCubeBased"选项页，也就是IPP启动时它的默认选项为"ColorCubeBased"选项页。

对于一个色彩文件(.rge)，它可以同时包含了"HistogramBased"和""ColorCubeBased"模式的色彩范围，那么在调用色彩文件时候，取决于在哪种模式下，如果是在"HistogramBased"下，就调用"HistogramBased"下的保存的色彩范围，对于"ColorCubeBased"也是这样。

免疫组化定量分析-永诺生物-2

免疫组化定量分析-永诺生物-2

应当把照片存为无损压缩格式TIFF 特别是对于染色较浅的图片，保存为jpeg格式后会损失亮度细节，导致测量误差增大。

要注意相机上直接保存为jpeg的图片就没必要转成TIFF了.注意那些马赛克总结拍摄注意事项：调整显微镜光源亮度，足够白，足够亮。

调整相机曝光时间，使背景呈现白色。

灰度值最好能达到230以上。

确认相机未使用自动白平衡功能。

但可以使用手动校正白平衡功能校正背景色彩为纯白色。

使用同样的显微镜工作条件与相机工作条件一次拍摄完所有照片。

保存照片为TIFF格式。

3.2用Image-pro plus分析免疫组化图片与photoshop不同，image-pro plus是一个图片分析测量软件。

IPP的功能不是用来美化图片，如果照片效果不好或分析结果不理想，要从切片处理与拍摄过程上找原因，而不应试图通过对图片的修饰与处理来解决问题。

通过IPP的分析测量只应当准确地反映图片本身的真实测量数据。

3.2.1开始使用IPPIPP的程序界面是典型的windows风格。

它包含了最常用的一些windows程序的一些通用工具。

进入IPP后的第一件事就是打开一幅待分析的图片。

将分析图片信息保存到数据库中 在程序中保存分析图片过程信息是保存实验原始数据的基本原则，必须遵守。

将图片信息及图片分析过程及分析的信息存入IPP程序数据库是一种保存实验原始数据的操作。

要注意对同一张图片进行同样的操作，由于一些手动的操作无法准确地重复，所以会出现两次同样的测量得到有差异的结果的情况。

这也是保存测量结果的理由之一。

3.2.2.设置并保存测量条件设置光密度校正设置测量项目.设置分色选择参数3.2.2.1光密度校正方法校正光密度步骤小结.1.调出intensity carliberation窗口,点New按纽建立一个新的校正.2.选择std option density,此时可见到反向的校正曲线.3.选择背景空白值对应的灰度.相当于分光光度计中的调整100%透射.4.选择此校正为system carliberation,使之能应用于所有照片.3.2.2.2选择测量参数需要测量选择区域的面积(area)与累积光密度(IOD).在测量选项中也有平均光密度这一项,但它不适用于当前的测量,不能选用.选择面积时一般要设置一个过滤值,忽略掉面积过小的点,一般可设置为最小20象素.还要设置一下测量的显示选项(option),一般是选择显示选择区域填充红色.还有一些其他的设置.选择测量参数在分析免疫组化图象时,一般是测量选定的具有特定颜色的区域的面积与累积光密度(IOD)对免疫组化的显微照片,一般应分析它的平均光密度.即时IOD/area.根据图象的特点,要分别测量选择区域的IOD及area.对不同的组织照片，要使用不同的测量指标来进行比较。

image pro图像分析软件教程

image pro图像分析软件教程

分析测量图象软件Imagepro-Plus教程入门Image pro-plus（IPP）的主要用途是分析测量图像。

本人使用该程序进行生物图象分析有一段时间，写此帖的主要目的还是与大家交流使用心得，并总结一下使用方法。

如果你是刚接触IPP，最好先从本帖看起，并同时打开电脑上的IPP程序照着操作。

学会一个软件需要花一段时间的，两分钟不可能学会。

两小时也太短。

但我相信，照着我这几个帖子作下来，至少是可以用IPP干一点事情了。

既然是处理图片，当然是先要打开一张要处理的图片嘛这张照片中的黄色部分是免疫组化染色的阳性表达成分。

处理目标是通过测量图片中黄色部分的"黄"度来反映相应蛋白表达的“量”。

对图片进行观察，可以看到图片中主要有三种主要颜色，一是染成蓝色的细胞核，二是呈现出黄色的胞浆，三是细胞间的空隙区域，呈现出浅蓝色，是为背景。

所以首先要把图片中呈现黄色的区域给挑选出来，这部分区域是我们最感兴趣的地方，叫做AOI（area of interest）。

AOI是IPP中最有用最重要的概念。

如何能够准确地选取AOI就是使用IPP的关键操作。

一旦准确地选取了AOI，下面的测量分析就好办了。

对不同的图片，需灵活地使用各种适当的AOI工具，就这张图片来说，AOI是黄色区域，因此用颜色分类的AOI工具是最有效的。

点击measure---count/size,弹出分类测量窗口，在窗口中选中manual，再点击select color，弹出颜色选择窗口segmentation，这个工具是IPP最有特色的颜色选取工具之一。

用好这个工具是使用IPP的要点。

对于目标颜色鲜明的图片，用吸管工具是最简单的。

点一下吸管图标，在目标区域点一下，就可以选中该点的颜色，当然一下是不可能完全选中所需要指定的全部区域，可以在未选中的地方接着再点，这样多次选取，直到把想选中的区域全部选中为止。

在这张示例图中，选中的蓝色细胞核部分被标上了红色。

手把手教你使用Imagepro-plus(3.AOI技巧续)

手把手教你使用Imagepro-plus(3.AOI技巧续)

Welcome to Forum论坛首页 | 站内搜索 | 我的论坛 | 我的帐户 | 个人属性 | 退出登录标记已读 | 帖子收藏 | 我的简历 | 我要招聘 | 我的消息 | 论坛帮助» Welcome to Forum »计算机与医学、生物学软件»生物医学软件应用打印话题寄给朋友12手把手教你使用Imagepro-plus(3.AOI技巧续) [精华]hbchendl发贴: 958积分: 79得票: 32状态:离线2005-06-10 14:55请首先看此系列主题的第一帖:/bbs/post/view?bid=10&id=3554359&sty=1&tpg=1&age=0在上一主题中讨论的主要是irregular工具，(/bbs/post/view?bid=10&id=3560052&sty=1&tpg=1&age=0)它对于大个的孤立图形对象的选取是有用的。

而面对组织切片中密密麻麻的细胞，就得用本主题讨论的segmentation工具了。

实际上，在第一部分入门中所用的就是segmentation工具，在那里我用颜色吸管选取了图片中蓝色的细胞核，但是如果仔细观察一下选取的效果就会发现，有一些挨在一起的两个以上的细胞核被识别成了一个，另有一些蓝色的杂质颗粒被错误地识别成了细胞核。

如果你试着用吸管工具选取一下图中黄色的免疫反应表达区域，就会发现因为黄色很浅，很不容易准确地选取。

所以对于segmentation工具还需要有更多的应用技巧。

火锅在我之前已经介绍了不少，我在这里班门弄斧是为了保持我这个系列主题的内容完整。

同时也是系统地整理一下这个工具的使用方法。

让我们还是从打开图片并调出count/size窗口开始吧。

（缩略图，点击图片链接看原图）hbchendl edited on 2005-06-12 18:42举报• 【资料】三聚氰胺致病的生化原理hbchendl发贴: 958积分: 79得票: 32状态:离线2005-06-10 15:27对这种色彩饱和度低，各种成分颜色区别很小的图片来说，用吸管是很难准确选择到正确的颜色区域的。

(完整版)IPP使用教程

(完整版)IPP使用教程

Image pro-Plus6.0 使用教程目录一、入门 (2)二、AOI技巧（1） (9)三、AOI技巧（2） (14)补充：不规则区域计数 (20)四、编制宏 (23)五、计数 (27)六、校正标尺 (33)七、几何测量 (41)八、图象分析策略 (43)九、其他有趣功能 (45)十、光密度 (51)十一、免疫组化光密度测量 (56)十二、macro (58)十三、荧光强度测量 (64)感谢丁香园战友:hbchendl 提供教程畅想先锋-整理2010.07.01一、入门既然是处理图片，当然是先要打开一张要处理的图片嘛。

在你开始学习使用IPP 之前，我假定你是会初步使用office 及photoshop 等常用程序的。

如果一点电脑常识也没有，那还是先学点简单的程序再回来玩IPP。

因此我跳过了打开图片，copy 、paste、象素的概念之类最基础的知识与操作。

这些用不着我来讲。

这张照片中的黄色部分是免疫组化染色的阳性表达成分。

处理目标是通过测量图片中黄色部分的"黄"度来反映相应蛋白表达的的"量"。

对该图片进行观察，可以看到图片中主要有三种主要颜色，一是染成蓝色的细胞核，二是呈现出黄色的胞浆，三是细胞间的空隙区域，呈现出浅蓝色，是为背景。

所以首先要把图片中呈现黄色的区域给挑选出来，然后才是测量这些挑出来的区域的各种测量参数，如面积、平均半径、周长、光密度等等。

这部分需要挑出来进行测量的区域是我们最感兴趣的地方，叫作AOI(area of interest)。

AOI 是IPP 中最有用最重要的概念。

如何能够准确地选取AOI 就是使用IPP 的关键操作。

一旦准确地选取了AOI，下面的测量分析就好办了。

在其他的测量软件中，选择这种不规则的区域一般只能用手拖着鼠标来画，而在IPP 程序里，可以通过设置颜色范围让电脑来帮助你选择这些不规则区域，这样的选择就准确多了。

可以说，使用IPP 的要点就是灵活地使用各种AOI 工具准确地把那些需要测量的区域给挑选出来。

Imageproplus使用指南要点

Imageproplus使用指南要点

Imageproplus的主要用途是分析测量图象。

1.基本操作2.AOI技巧3.AOI技巧续4.编制宏操作5.计数6.校正标尺7.几何测量8.图象分析策略9.其他有趣的功能10。

讨厌的光密度11.免疫组化光密度图片的测量12.免疫组化光密度图片的自动测量13.荧光照片的测量14.双染料染色照片的合成方法打开ipp后的界面是这样的，该从何处下手呢?这张照片中的黄色部分是免疫组化染色的阳性表达成分。

处理目标是通过测量图片中黄色部分的"黄"度来反映相应蛋白表达的的"量"。

对该图片进行观察，可以看到图片中主要有三种主要颜色，一是染成蓝色的细胞核，二是呈现出黄色的胞浆，三是细胞间的空隙区域，呈现出浅蓝色，是为背景。

所以首先要把图片中呈现黄色的区域给挑选出来，然后才是测量这些挑出来的区域的各种测量参数，如面积、平均半径、周长、光密度等等。

这部分需要挑出来进行测量的区域是我们最感兴趣的地方，叫作AOI(area of interest)。

AOI是IPP中最有用最重要的概念。

然而在选择AOI之前必须转换图象intensity格式。

校正光密度单位的操作要在打开第一张图片后立即进行。

将光密度单位设定为system之后就不必再对后面的每一张照片都进行光密度校正了。

在默认的intensity格式中，是图片灰度，越黑数值越小，越白数值越大。

而实际上我们测量的染色强度是光密度，染色越深，光密度值越大。

如果不进行光密度单位的转换，测量的数值将完全是错误的。

转换光密度单位的方法如下:点击:measure--carliberation--intensity，调出intensity校正窗口。

然后在窗口中点new 按纽，再点一下下面的std optical density选项，这时可以看到窗口中的直线变成了反向的曲线。

然后还要点一下最上面的system按纽。

最后点close关闭窗口。

这样就把程序系统的灰度单位转换成了光密度单位。

免疫组化照片密度定量分析

免疫组化照片密度定量分析

免疫组化照片密度定量分析==转载链接/boyedlover/blog/item/a291eb1bf08dd3dfac6e7570.h tml2009-11-23 21:53Imagepro plus 应用实例2－免疫组化照片密度定量分析。

估计这是大家用得最多的，所以先讲这个了。

免疫组化技术现在是很成熟的方法，但是对免疫组化照片的分析并没有一个权威的说法。

现在可以查到无数篇应用图像分析来分析免疫组化的文献，但几乎没有哪一篇能详细地叙述分析的过程与方法。

首先，免疫组化的样品应该是用ＤＡＢ对免疫组化产物染色，同时用苏木对细胞核进行复染。

镜下观察样品，细胞核被染上了蓝色，胞浆间有黄色（强阳性的地方会呈现棕黄色）。

居然经常能看到其他颜色的免疫组化照片，这肯定是样品制作过程中有了差错。

用肉眼观察免疫组化切片的结果只能是定性的，不准确的。

使用图像分析软件定量地（至少是半定量）对照片测量出一个数值来自然比用肉眼看更准确。

切片上阳性反应物量是由图片上黄色染色的深浅与面积一起表现的。

所以最终要测量的就是图片上黄色部分的累积光密度（IOD），这是个没有单位的相对数值。

就是把图片上每个黄色的象素点的强度值全部累加起来得到的值。

IOD除以一个适当的面积，就是一个平均光密度。

这个面积可以就是照片的面积，也可以是照片上一个组织区域的面积，或者是有黄色的区域的面积。

必须根据切片的实际情况来适当选择。

对于细胞核的免疫组化切片，在细胞核上，由于有蓝色复染，所以需要另一种分析方法。

将另作讲解。

这张照片曝光稍大。

但仍能表现出免疫组化的黄色染色与细胞核的蓝染。

在拍摄照片时，需要注意的地方是：１.所有的照片必须以同样的显微镜环境与拍摄条件来拍摄。

在拍摄照片时，要保持显微镜光源亮度的稳定，用同样的曝光时间拍摄照片。

在更换视野或切片时，除了对焦距这个操作外，其他所有的操作都不能有变化。

强阳性的样品就是暗的黄的，弱阳性的样品则亮一些，阴性样品就是一片白。

Image+pro-Plus+6.0使用教程_IT168文库

Image+pro-Plus+6.0使用教程_IT168文库

Image pro-Plus6.0使用教程目录一、入门 (2)二、AOI技巧（1） (9)三、AOI技巧（2） (14)补充：不规则区域计数 (20)四、编制宏 (23)五、计数 (27)六、校正标尺 (33)七、几何测量 (41)八、图象分析策略 (43)九、其他有趣功能 (45)十、光密度 (51)十一、免疫组化光密度测量 (56)十二、macro (58)十三、荧光强度测量 (64)感谢丁香园战友:hbchendl提供教程畅想先锋-整理2010.07.01一、入门既然是处理图片，当然是先要打开一张要处理的图片嘛。

在你开始学习使用IPP之前，我假定你是会初步使用office及photoshop等常用程序的。

如果一点电脑常识也没有，那还是先学点简单的程序再回来玩IPP。

因此我跳过了打开图片，copy 、paste、象素的概念之类最基础的知识与操作。

这些用不着我来讲。

这张照片中的黄色部分是免疫组化染色的阳性表达成分。

处理目标是通过测量图片中黄色部分的"黄"度来反映相应蛋白表达的的"量"。

对该图片进行观察，可以看到图片中主要有三种主要颜色，一是染成蓝色的细胞核，二是呈现出黄色的胞浆，三是细胞间的空隙区域，呈现出浅蓝色，是为背景。

所以首先要把图片中呈现黄色的区域给挑选出来，然后才是测量这些挑出来的区域的各种测量参数，如面积、平均半径、周长、光密度等等。

这部分需要挑出来进行测量的区域是我们最感兴趣的地方，叫作AOI(area of interest)。

AOI是IPP中最有用最重要的概念。

如何能够准确地选取AOI就是使用IPP的关键操作。

一旦准确地选取了AOI，下面的测量分析就好办了。

在其他的测量软件中，选择这种不规则的区域一般只能用手拖着鼠标来画，而在IPP程序里，可以通过设置颜色范围让电脑来帮助你选择这些不规则区域，这样的选择就准确多了。

可以说，使用IPP的要点就是灵活地使用各种AOI工具准确地把那些需要测量的区域给挑选出来。

IPP 分析免疫组化图片

IPP 分析免疫组化图片

精选完整ppt课件
18
右上角的空白区面积应该扣除。
精选完整ppt课件
19
也许应是这个特定的组织区域
精选完整ppt课件
20
这个区域是特定染色的区域。在计算 IOD时能同时计算出来，但以此为平 均面积往往并不正确。
精选完整ppt课件
21
对单个细胞的分析比较
单个细胞的IOD 单个细胞的mean density 照片上各细胞IOD或mean density的平均值
使用同样的显微镜工作条件与相机工作条件 （曝光及白平衡设置）一次拍摄完所有照片。
保存照片为TIFF格式。相素不必太大。
精选完整ppt课件
42
3.2用Image-pro plus分析免疫组化图片
与photoshop不同，image-pro plus是一个图 片分析和定量测量软件。
IPP的功能不是用来美化图片，如果照片效果 不好或分析结果不理想，要从切片处理与拍摄 过程上找原因，而不应试图通过对图片的修饰 与处理来解决问题。通过IPP的分析测量只应 当准确地反映图片本身的真实测量数据。
随机选取几个区域 但是能作到“随机”吗？
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2.3 ImagePro plus的独特优势。
准确地按照一个颜色标准来选取一个AOI (area of interesting ) 。测量这个区域的光密 度参数。
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使用IPP比前两种方法更好。
在查到文献中使用的图象分析方法是前两种的 时候，完全可以用IPP的分析测量来代替。结 果更加准确。不必照搬文献上所述的方法。随 着计算机技术的发展，以后也许还会有更好的 图象分析方法及图象分析程序的。
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手把手教你使用Imagepro-Plus(七)——图象分析策略

手把手教你使用Imagepro-Plus(七)——图象分析策略

手把手教你使用Imagepro-Plus（七）——图象分析策略2006-08-03 10:26文章来源: 丁香园点击次数：1127有了图象分析软件，该怎么应用它来分析工作中的图片呢？这就涉及到图片分析的策略。

这并没有一个权威的或者是已经有定论的方法。

因此我在这里只能讲讲我自己作过的一些显微镜图片分析处理的方法。

从我自己的体会来说，几乎每一项分析其策略都不同。

我也不敢说自己的作法就是正确的。

也没有多少文献可供参考。

比如免疫组化染色图片的图象分析方法，查过一些文献，提到图片的数字分析处理时往往就几句话。

有许多还是用图象分析仪测量的。

我怀疑他们自己也没弄明白具体的分析策略是什么。

有人是这样作的：使用正圆形AOI工具，在一张免疫组化图片上随机选取五个位置，分别测量这五个位置上这个正圆形区域的平均光密度，得到一个平均光密度值与标准差。

我认为这样作是错误的。

因为这个平均光密度值的真值就是这张图片整个的平均光密度值。

因此只要选一个矩形AOI，大小就是这张图片的尺寸，其平均光密度值就是刚才那个平均值的真值，没有标准差。

要作好免疫组化图片的数字分析，从拍摄显微镜照片时开始就要考虑操作细节了。

作切片时要保证各个切片条件的一致就不说了，在使用数码相机拍摄切片照片时得注意什么呢？1.显微镜的亮度要前后保持一致。

这包括电源的电压要稳定，最好给显微镜加稳压电源，光源亮度调节在拍摄一组照片的过程中不能动，聚光镜也不能调。

2.数码相机不能用自动调节设置，全部用手动设置。

包括曝光时间、变焦、光圈。

还有一个很多人都想不到的地方：自动白平衡功能要关掉。

前面的照片中有几张看上去背景是浅蓝色的，这就是数码相机的自动白平衡功能在起作用。

因为整个画面都是黄色的染色，相机就会认为画面色温偏低，要进行一下较正，给加点蓝色吧。

浅蓝色背景其光密度与浅黄色的阳性区域差不多，这样就给准确测量光密度带来了更大的误差。

3.拍摄荧光照片时自动曝光所带来的影响更大。

20150611_Imagepro plus免疫组化图像处理及基本功能_刘儒瑜

20150611_Imagepro plus免疫组化图像处理及基本功能_刘儒瑜

Imagepro plus免疫组化图像处理及基本功能
免疫组化图片分析
免疫组化的基本原理：
区域越黑光密度越大，蛋白表达越强。

一般可以由灰度值转换为光密度值计算，用平均光密度值计算（一块区域的光密度总和/区域面积）。

操作步骤：
1、光密度校正
将灰度值转为光密度
2、设置测量参数
参数包括面积、IOD等
设置标记的操作，填充，平滑，是否包括边缘的保存测量环境文件等
3、选择测量区域
图形选中测量区域
3、设置色彩选择
4、
选择区域的HIS设置，
保存选色文件
5、测量区域面积，在测量积分光密度
6、批量操作等
一组免疫组化图片包括几组样本，而每个样本需要测量多次去平均，因此需要保存操作标准，以进行批量操作。

备注：拍摄条件要一致，相同显微镜条件，同一放大倍数，手动相机
基本功能
校正显微镜图片背景不均匀
操作步骤：
获得空白的背景图片
打开样本图片
单击背景校正功能选项
分色选择工具
HIS和rgb调整图像颜色
调整图片亮度
包括调整亮度和对比度
调整图片伽马
滤镜Filter
对灰度和二值图像处理效果较好
图象增强，平滑，去噪，边缘处理，形态学处理等
数据收集
包括对目标的计数，目标参数例如面积，长宽等计算。

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其测定原理有点象分光光度计，直接测定切片 的整体光密度。 可以根据照片上象素点的亮度来区分测定区域 其缺陷是显而易见的。复染上的其他颜色的染 料也会产生光密度吸收，导致严重的干扰。
2.2 抽样测量光密度

在彩色电子图片上选取目标颜色区域，抽样测 量这些小区域的灰度值，取其平均值作为比较 染色深浅的指标。
背景的影响

左图：暗且偏蓝的背景严重降低了黄色的IOD 值。而且影响到了阳性区域的色调。
较暗的背景值对分析测量的影响
1.6 1.2 0.8 0.4 0
阳性样品 阴性样品 背景 背景+阳性样品 背景+阴性样品
1.2 1.0
1.1
显著性 差异
0.2
0.1
无显著 性差异
扣背景后依然没有显著性差异
阳性样品 1.6 阴性样品 背景 1.2 阳性样品-背景 阳性样品-背景 1.2 1.2 1.1 1 1.1 0.2 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 1.0
随机选取几个区域 但是能作到“随机”吗？
2.3 ImagePro plus(IPP)的独特优势。

准确地按照一个颜色标准来选取一个AOI (area of interesting ) 。测量这个区域的光密 度参数。
使用IPP比前两种方法更好。
பைடு நூலகம்
在查到文献中使用的图象分析方法是前两种的 时候，完全可以用IPP的分析测量来代替。结 果更加准确。不必照搬文献上所述的方法。随 着计算机技术的发展，以后也许还会有更好的 图象分析方法及图象分析程序的。

单个细胞的IOD 单个细胞的mean density
边界不清晰的贴壁细胞

整张图片IOD/细胞个数（照片中细胞数目不多， 数起来不费事）
细胞簇的分析

测量整张图片黄色区域IOD。 再测量细胞分布的区域面积 area。 对染成蓝色的细胞核计数，作为细胞数N。 以 IOD /（N * area）作为统计指标。
3.2.2.2选择测量参数



需要测量选择区域的面积(area)与累积光密度 (IOD).在测量选项中也有平均光密度这一项,但 它不适用于当前的测量,不能选用. 选择面积时一般要设置一个过滤值,忽略掉面 积过小的点,一般可设置为最小20象素. 还要设置一下测量的显示选项(option),一般是 选择显示选择区域填充红色.还有一些其他的 设置.



IOD对整张图片的面积作平均。 IOD对特定组织区域面积作平均。√ IOD对显色的组织区域作平均。
对整张图片区域进行平均的情况比较少
右上角的空白应该扣除。
也许应是这个特定的组织区域
这个区域是染色的区域。往往在计算 IOD时同时计算出来，但以此为平均 面积往往并不正确。
对单个细胞的分析比较
用Image-Pro Plus ( IPP ) 分析免疫组化图片
1.免疫组化图片分析原理


根据染色染料颜色的深浅(光密度)及分布面积 大小来确定目标蛋白的量。 染色区域分布面积与目标蛋白量成正比。 染色的颜色深浅(光密度)与目标蛋白量的定量 关系符合朗伯-比尔定律，是对数关系。
1.1光密度与灰度—迷惑人的不同概念
固定显微镜的工作条件


不仅是光源亮度，除了更换样品时调节载物台 位置，其他部件一律固定下来。特别是不要来 回切换使用不同放大倍数的物镜。使用一个物 镜拍摄所有的照片后，再切换到另一个物镜上 拍摄照片。 为保证显微镜光源的稳定一致，所有照片应该 一次拍摄完成。不能分数次拍摄。若能给显微 镜加上稳压电源就更好了。这能保证显微镜光 源亮度的稳定。
用标准样品才能把OD值 与样品量关联到一起



OD值是一个没有单位的相对值。 使用酶标仪或分光光度计时要作标准曲线。对电 泳条带进行定量分析时一样要作标准曲线。 电泳条带照片的灰度值与样品量的关系为指数函 数。在把灰度值转换成OD值时，用一个标准点进 行定量分析是不准确的。多个标准点的标准曲线 亦有很大误差，因此只能说是半定量分析。 在实际应用时,可以直接测量OD值,用以表达染色 物质的相对的量.
Optical Density: 吸收光线的物质的光学密度.


被测物质的量越多，光密度(OD值)越高，透射出的光越少，反 映在照片上就越黑。 OD值与物质的量直接相关，灰度值与OD值成对数关系，符合 朗伯-比尔定律。 理论上OD值是从零到无穷大。实际应用中，OD值的范围常用 0 - 2.0或者0 - 3.0。
应当把照片存为无损压缩格式TIFF

特别是对于染色较浅的图片，保存为jpeg格式 后会损失亮度细节，导致测量误差增大。要注 意相机上直接保存为jpeg的图片就没必要转成 TIFF了.
注意那些 马赛克
总结拍摄注意事项：




调整显微镜光源亮度，足够白，足够亮。 调整相机曝光时间，使背景呈现白色。灰度值 最好能达到230以上。 确认相机未使用自动白平衡功能。但可以使用 手动校正白平衡功能校正背景色彩为纯白色。 使用同样的显微镜工作条件与相机工作条件一 次拍摄完所有照片。 保存照片为TIFF格式。
3.2用Image-pro plus分析免疫组化图片


与photoshop不同，image-pro plus是一个图 片分析测量软件。 IPP的功能不是用来美化图片，如果照片效果 不好或分析结果不理想，要从切片处理与拍摄 过程上找原因，而不应试图通过对图片的修饰 与处理来解决问题。通过IPP的分析测量只应 当准确地反映图片本身的真实测量数据。
3.2.2.设置并保存测量条件

设置光密度校正 设置测量项目. 设置分色选择参数
3.2.2.1光密度校正方法
校正光密度步骤小结.




1.调出intensity carliberation窗口,点New按纽 建立一个新的校正. 2.选择std option density,此时可见到反向的校 正曲线. 3.选择背景空白值对应的灰度.相当于分光光度 计中的调整100%透射. 4.选择此校正为system carliberation,使之能应 用于所有照片.
0.8
注意误差线，依然 没有显著性差异
0.2 0.1
0.4
0
阳性样品 阴性样品 背景 阳性样品-背景 阳性样品-背景
避免使用相机的自动白平衡

自动白平衡功能是相机根据照片总体色彩情况自动对每张照片进 行各自不同的白平衡校正。这会严重影响分析测量的准确性。显 微镜照片用一两种染料染色，照片的色彩就应该是不平衡的，不 能校正。由于免疫组化照片上黄色染色多,自动白平衡会将图片色 调向蓝色调整,导致色彩的失真.
3.用IPP分析免疫组化图片过程



选取图片上具有染料色调的区域（AOI，area of interesting）。 测量该区域的IOD。 选择并测量有效统计区域的面积 计算选择区域内的光密度平均值IOD/area （density mean） 计算同一实验组切片各照片的平均及标准差。 用统计学方法分析各实验组的平均density mean之间是否有显著性差异。
2.从图片上分析光密度方法 的技术发展



简单测量整张照片的光密度值。 在照片上随机选取数个区域，测量其光密度值。 计算其平均值作为整张照片的光密度值。 在照片上准确选择被染上染料的特定颜色的区 域，计算这些区域的累积光密度值（IOD）， 进而计算统计区域的平均光密度值。
2.1测定整张照片的光密度-图象分析仪
3.1用于免疫组化半定量分析的照片拍 摄

与普通显微镜照片不同，用于免疫组化分析的 显微镜照片有其特殊的拍摄要求。
显微镜光源




正确调整显微镜光源为日光色温的白色光。此时是加蓝色 滤光片，灯丝电压为10V左右。一般的显微镜上都会有指 示的。此时的镜下视野会感觉明亮得有点刺眼。 不能通过调整光圈的方法减低亮度，这会影响到图象的清 晰度。光圈与聚光镜要按照柯勒方法调整以保证照片的清 晰. 不能加过大的灰度镜减低亮度。用25%的灰度滤光片还行。 6%的灰度滤光片会导致色彩失真。 如果照明光源不白，有偏色，将直接影响到照片色彩，从 而使得测量结果不准确。
1.3比较两张照片的染色物质量的差别

两张照片染色深度一样，染色面积大的质量大
照片A
照片B
比较两张照片的染色物质量的差别

两张照片染色区域面积相同，染色深的质量大
照片A
照片B
这回该怎么看？

A的颜色深，面积小。 B的颜色浅，面积大。
照片A 照片B
比较体积！
IOD density( x, y )ds
最好使用专业CCD拍摄


民用数码相机适用于拍摄日常生活中的照片， 其自动曝光、自动白平衡功能会有效改善照片 的直观效果。但对于显微镜照片，这些功能却 会改变照片的原始面貌，严重影响照片的分析 测量结果。要想关闭这些功能，往往要进行很 复杂的设置。 不使用自动白平衡校正，但可以使用手动的白 平衡校正背景色彩。对所有照片进行统一的背 景色彩校正。使得照片中空白的背景呈白色。
应该使用手动控制曝光的相机


对每张照片要使用相同的曝光时间，而不是由 相机自动控制曝光。 染色深的阳性样品就应该拍摄得较暗。染色浅 的阴性对照样品则应该拍摄得较明亮。
控制相机曝光时间



要把相机曝光时间控制到使视野中空白的地方 呈现纯亮的白色。 拍摄出的照片上，没有组织的空白处的背景灰 度值应达到230左右。可以使用图象分析软件 测量一下空白处的背景灰度值。低于230的背 景灰度值很容易产生色彩的偏离，会影响到图 像分析数值的偏差。 把空白灰度值调到230相当于在分光光度计上 调节100%透射。