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Photoshop软件在免疫组化图像分析中的应用周洲;张军锋;陈建;赖娅娜【摘要】[目的]结合教学与科研工作实践,探讨采用图像处理软件Photoshop分析免疫组化图像的使用规范.[方法]选用合适方法对免疫组化图像进行分割与灰度转换处理,再采用软件测量与分析免疫组化图像,同时与Image-Pro Plus、ImageJ专业软件分析结果比较.[结果]该方法操作便捷,数据准确可靠.[结论]该方法值得在实验教学和科学研究中推广使用.%[Objective] To discuss the normative application of Photoshop software in immunohistochemical image analysis combine with practical leaching and research. [ Method] The suitable methods of image segmentation and gradation conversion were chosen; afterwards immunohistochemical images were analyzed with Photoshop software, which was with specialized software Image-Pro Plus and ImageJ. [ Result] The method was convenient and the data was precise. [Conclusion] The method was good for the experimental teaching and scientific research.【期刊名称】《安徽农业科学》【年(卷),期】2012(040)024【总页数】3页(P11963-11965)【关键词】Photoshop;免疫组化图像;图像分割;图像分析【作者】周洲;张军锋;陈建;赖娅娜【作者单位】南京师范大学生命科学学院,江苏南京210046;江苏省医药动物实验基地,江苏南京210029;南京中医药大学基础医学院,江苏南京210029;南京师范大学生命科学学院,江苏南京210046;江苏省医药动物实验基地,江苏南京210029【正文语种】中文【中图分类】S188+.1近年来，随着高分辨率显微成像系统的广泛应用，数字化图像处理和分析技术在实验教学与科学研究中得到迅速发展，在免疫组化图像分析领域中的应用更为普遍［1］。
灰度值和光密度值在免疫组化定量分析免疫组化技术现在是很成熟的方法，但是对免疫组化照片的分析并没有一个权威的说法。
现在可以查到无数篇应用图像分析来分析免疫组化的文献，但几乎没有哪一篇能详细地叙述分析的过程与方法。
首先，免疫组化的样品应该是用ＤＡＢ对免疫组化产物染色，同时用苏木对细胞核进行复染。
镜下观察样品，细胞核被染上了蓝色，胞浆间有黄色（强阳性的地方会呈现棕黄色）。
居然经常能看到其他颜色的免疫组化照片，这肯定是样品制作过程中有了差错。
用肉眼观察免疫组化切片的结果只能是定性的，不准确的。
使用图像分析软件定量地（至少是半定量）对照片测量出一个数值来自然比用肉眼看更准确。
切片上阳性反应物量是由图片上黄色染色的深浅与面积一起表现的。
所以最终要测量的就是图片上黄色部分的累积光密度（IOD），这是个没有单位的相对数值。
就是把图片上每个黄色的象素点的强度值全部累加起来得到的值。
IOD除以一个适当的面积，就是一个平均光密度。
这个面积可以就是照片的面积，也可以是照片上一个组织区域的面积，或者是有黄色的区域的面积。
必须根据切片的实际情况来适当选择。
对于细胞核的免疫组化切片，在细胞核上，由于有蓝色复染，所以需要另一种分析方法。
将另作讲解。
这张照片曝光稍大。
但仍能表现出免疫组化的黄色染色与细胞核的蓝染。
在拍摄照片时，需要注意的地方是：１.所有的照片必须以同样的显微镜环境与拍摄条件来拍摄。
在拍摄照片时，要保持显微镜光源亮度的稳定，用同样的曝光时间拍摄照片。
在更换视野或切片时，除了对焦距这个操作外，其他所有的操作都不能有变化。
强阳性的样品就是暗的黄的，弱阳性的样品则亮一些，阴性样品就是一片白。
这样才能测量出正确的密度值。
２.曝光的选择：试拍摄一张空照片，看一下白色背景的亮度，应该在２３０附近。
过低过高都不好。
3.注意相机白平衡：如果使用的是专业CCD相机，会有校正白平衡的功能，此时应对空视野进行白平衡校正。
如果是普通的数码相机，要关闭自动白平衡功能。
免疫组化实验结果分析免疫组化实验是一种常用的免疫学技术，通过特定的抗体与标记物之间的特异性结合，可以对样本中特定抗原的定位和分析进行定性和定量研究。
本文将对免疫组化实验结果进行详细分析，以期为科学家和研究人员提供参考和指导。
1. 实验结果概述免疫组化实验主要通过荧光染色或酶标染色的方式来呈现结果。
通常，结果会呈现为显微镜下的图像，显示出特定抗原在组织或细胞中的定位和分布情况。
2. 定性分析通过观察免疫组化实验的结果图像，可以对特定抗原在样本中的存在与否进行定性分析。
当目标抗原与抗体结合后，会出现染色反应，通常为荧光或酶标信号的显现。
如果结果图像中有明显的染色信号，则说明目标抗原存在于样本中。
反之，如果没有染色信号，则说明目标抗原可能不存在或浓度较低。
3. 定量分析在一些情况下，科学家需要对免疫组化实验的结果进行定量分析。
这可以通过计算染色信号的强度或数量来实现。
一种常用的定量方法是使用图像分析软件，对染色信号的强度进行测量。
通过对多个图像进行分析和比较，可以得出目标抗原在不同组织或细胞中的表达量差异，从而进一步探究其生物学功能和疾病相关性。
4. 结果解读和讨论在免疫组化实验结果分析的最后，需要对结果进行解读和讨论。
首先，需要分析目标抗原在样本中的定位和分布情况。
例如，抗原可能位于细胞核、细胞质或细胞膜上。
其次，可以比较不同样本中的抗原表达差异，如正常组织与肿瘤组织之间的差异。
最后，可以将免疫组化实验结果与其他实验结果进行比对，以验证免疫组化实验结果的有效性和可靠性。
5. 结论免疫组化实验结果的分析对于研究特定抗原的功能与表达具有重要意义。
通过定性和定量分析，可以获得关于目标抗原在组织或细胞中的分布、表达量及变化的有用信息。
然而，需要注意的是，免疫组化实验结果的分析应结合其他实验结果和相关文献进行综合解读，以确保结果的准确性和可靠性。
总而言之，免疫组化实验结果的详细分析可以提供有关目标抗原的定位、定量和变化的重要线索。
免疫组化（immunohistochemistry，IHC）是一种利用抗体识别特定蛋白质在组织切片中的表达情况的技术。
在癌症研究和临床诊断中，免疫组化技术被广泛应用于研究蛋白质的表达水平和分布。
而在免疫组化数据的分析中，H-score和平均光密度（average optical density，AOD）作为重要的评价指标，可以帮助我们更精确地分析免疫组化结果。
一、 H-score的概念H-score是一种定量评价免疫组化染色结果的方法，它结合了阳性细胞的百分比和染色强度两个因素。
H-score的计算公式如下：H-score = Σ（PI×I）（I=1, 2, 3）其中，PI表示阳性细胞的百分比，I表示染色强度。
染色强度一般分为3个级别，分别用1、2、3表示，对应无染色、轻染色和重染色。
H-score的取值范围为0-300，分数越高表示染色结果越强烈。
H-score的优势在于能够综合考虑阳性细胞数和染色强度，相比于单纯考虑阳性细胞的比例，更能够客观地反映蛋白质在组织中的表达水平。
二、 AOD的概念AOD是免疫组化染色图像分析的另一种重要参数，它是指单位面积内染色物质的平均光密度。
AOD的计算需要借助于专业的光密度分析软件，通过对染色区域的像素值进行测量和计算得出。
AOD的测定结果可以直观地反映出组织中某种蛋白质的表达水平，与H-score相比，AOD更偏重于定量分析，能够提供更加精细的数据。
在研究和临床实践中，AOD的应用越来越受到重视。
三、 H-score和AOD的关系H-score和AOD两者都可以用于评估免疫组化染色结果，它们之间存在一定的相关性。
一般来说，阳性细胞数越多，染色强度越高，AOD 的数值也会相应增加；而H-score的计算中也会受到阳性细胞比例和染色强度的影响。
通过对H-score和AOD的综合分析，能够更全面地了解免疫组化染色结果所反映的蛋白质表达情况。
四、 H-score和AOD在临床应用中的意义在肿瘤标志物的研究和癌症诊断中，H-score和AOD都具有重要的临床意义。
免疫组化实验结果分析免疫组化实验是一种用特异性抗体与目标蛋白质相互作用的技术，通过对细胞内或组织切片中目标分子的免疫染色来观察、分析目标分子在细胞或组织中的表达与定位情况。
本文将对免疫组化实验结果进行分析，以揭示其在研究领域中的应用与意义。
1. 实验设计与控制免疫组化实验前，首先需要进行实验设计。
在实验设计过程中，应明确需要检测的目标分子以及合适的抗体选择。
同时，合理设定实验组与对照组，用以对比分析不同处理条件下目标分子的表达变化。
控制变量的同时，还需确保实验操作的准确性和可重复性。
2. 结果解读与定量分析在免疫组化实验中，常见的结果表达形式是显微镜下对目标分子免疫染色的图像。
通过观察图像，可以初步判断目标分子在不同组织、细胞种是否存在表达，并探讨其表达差异。
同时，需着重对结果进行定量分析，使用专业软件对图像进行数字化处理，计算光密度或荧光强度等指标，以实现对不同样品之间的比较与分析。
3. 结果分析与比较在进行免疫组化实验结果分析时，需要将不同样品之间的实验结果进行对比与分析，以探究目标分子的表达变化与信号定位。
常见的分析方法包括：(1) 目标分子的表达量分析：通过计算光密度或荧光强度等指标，对不同样品中目标分子的表达量进行定量比较。
可以使用统计学方法对数据进行处理，比如均值、标准差等分析，以评估目标分子的表达水平是否存在显著差异。
(2) 信号定位与定量：通过观察光学显微镜下的染色结果图像，可以初步判断目标分子在细胞或组织中的定位情况。
同时，也可以使用数字化图像分析软件，对染色信号进行定位与定量，以精确描述目标分子在特定位置的表达情况。
(3) 目标分子与疾病发生的关联性：通过对不同疾病样本中目标分子的表达和定位进行研究，可以分析目标分子与疾病的关联性。
比如，某一分子在肿瘤组织中的高表达与某种癌症的发生相关性等。
4. 结果讨论与展望在对免疫组化实验结果进行分析后，可以从结果出发进行讨论与展望，以揭示目标分子的功能与潜在作用。
免疫组化实验结果分析随着科学技术的发展，免疫组化实验已经成为了生命科学研究中不可或缺的技术手段之一。
免疫组化实验通过对样本中特定蛋白的抗体反应进行检测，以便了解该蛋白在组织中的表达情况和分布规律。
本文将重点介绍免疫组化实验结果的分析方法，帮助读者更好地理解和运用该技术。
一、实验结果的基本概念在进行免疫组化实验时，我们会选取适当的抗体与标本进行反应，经过多次重复实验后得到的结果通常会以图像的形式呈现。
以下是实验结果中常用的一些基本概念：1.阳性反应与阴性反应阳性反应是指样本中目标蛋白和抗体发生了明显的反应，在组织切片中形成明显的染色。
阴性反应则是指，样本中的目标蛋白与抗体没有出现反应所致，组织切片中没有出现染色情况。
2.强度与分布免疫染色结果的强度通常可以由直观观察获得，可以根据染色程度的相对强弱将结果分为多个等级。
此外，还可根据反应物在组织中的分布范围，将免疫染色结果分为不同的类型。
二、如何分析免疫组化实验结果对于免疫组化实验的结果，我们通常要进行如下分析：1.分析组织中蛋白的表达及分布情况免疫组化实验可以协助我们了解组织中蛋白的表达情况以及分布规律。
在分析结果时，我们主要应该关注以下问题：（1）该蛋白是否有表达？（2）该蛋白在组织中的分布范围如何？（3）该蛋白的表达情况与组织形态、位置是否有关系？（4）如果存在多个该蛋白的亚型，各亚型是否同时表达？2.测定蛋白的定位除了了解组织中蛋白的表达和分布情况，我们还可以通过免疫组化实验来确定蛋白在细胞中的分布和定位。
我们可以通过以下几个方面去分析免疫组化实验的结果：（1）蛋白在哪里？（2）蛋白是否和其他蛋白有联系？（3）蛋白是否有特定的定位？3.定量分析在以往的免疫组化实验中，我们主要通过观察染色分布的强度来判断样本是否为“阳性反应”。
而在现代分析工具的支持下，我们已经可以对实验结果进行定量测量，从而更加准确地评估样本的特性。
通过下面几个方面我们可以进行定量分析：（1）染色强度如何？（2）染色程度与蛋白表达水平之间的关系如何？（3）有没有其他因素影响了染色的结果？总之，免疫组化实验的结果分析应根据具体情况进行，同时需要注意其他生化、分子和基因学实验的相互支持。
免疫组化照片密度定量分析==转载链接/boyedlover/blog/item/a291eb1bf08dd3dfac6e7570.h tml2009-11-23 21:53Imagepro plus 应用实例2－免疫组化照片密度定量分析。
估计这是大家用得最多的，所以先讲这个了。
免疫组化技术现在是很成熟的方法，但是对免疫组化照片的分析并没有一个权威的说法。
现在可以查到无数篇应用图像分析来分析免疫组化的文献，但几乎没有哪一篇能详细地叙述分析的过程与方法。
首先，免疫组化的样品应该是用ＤＡＢ对免疫组化产物染色，同时用苏木对细胞核进行复染。
镜下观察样品，细胞核被染上了蓝色，胞浆间有黄色（强阳性的地方会呈现棕黄色）。
居然经常能看到其他颜色的免疫组化照片，这肯定是样品制作过程中有了差错。
用肉眼观察免疫组化切片的结果只能是定性的，不准确的。
使用图像分析软件定量地（至少是半定量）对照片测量出一个数值来自然比用肉眼看更准确。
切片上阳性反应物量是由图片上黄色染色的深浅与面积一起表现的。
所以最终要测量的就是图片上黄色部分的累积光密度（IOD），这是个没有单位的相对数值。
就是把图片上每个黄色的象素点的强度值全部累加起来得到的值。
IOD除以一个适当的面积，就是一个平均光密度。
这个面积可以就是照片的面积，也可以是照片上一个组织区域的面积，或者是有黄色的区域的面积。
必须根据切片的实际情况来适当选择。
对于细胞核的免疫组化切片，在细胞核上，由于有蓝色复染，所以需要另一种分析方法。
将另作讲解。
这张照片曝光稍大。
但仍能表现出免疫组化的黄色染色与细胞核的蓝染。
在拍摄照片时，需要注意的地方是：１.所有的照片必须以同样的显微镜环境与拍摄条件来拍摄。
在拍摄照片时，要保持显微镜光源亮度的稳定，用同样的曝光时间拍摄照片。
在更换视野或切片时，除了对焦距这个操作外，其他所有的操作都不能有变化。
强阳性的样品就是暗的黄的，弱阳性的样品则亮一些，阴性样品就是一片白。
硕士学位论文第一章绪论１．１课题的研究背景与意义１．１．１课题研究背景免疫组化是临床病理诊断和研究的重要辅助手段，该技术产生于１９７０年。
它的原理是通过将抗体标记显色剂注入组织样本，这样就可以观察到试剂抗体与样本中受体蛋白结合而呈现的不同染色效果。
基于免疫组化技术的图像从采集到临床应用有一整套系统支持，如下图１．１所示。
从ＩＨＣ图像采集设备上输出的免疫组化图像是３通道真彩色图像，其中阴阳两性细胞的计数和细胞边缘（包括核边缘和膜边界）计算等生理参数统计是判断免疫组化显色反应强度的重要指标，这个指标会作为疾病诊断的重要参考，对肿瘤的早期诊断和治疗有非常重要的价值，然而对这些结果的判断多由病理学家直接观察显微镜下的病理切片得到的，易受个人因素的影响而产生偏差，同时这一诊断过程耗费医生大量的精力。
采用图像分析方法定量检测可以避免观察者主观因素的干扰，但其过程比较复杂，分析时间较长，无法应用于常规临床工作。
通过计算机图像技术自动分析免疫组化彩色图像，辅助医生准确观察和定量检测免疫组化图像所蕴含的病理生理信息，在医学疾病诊断上有重要应用价值ｌｌ。
ｊ。
广———————————］；ｒ———————————］Ｉ图像采集ｌ｛ｉ图像处理Ｉ图１—１免疫组化图像处理系统示意图Ｆｉｇｌ—ｌＴｈｅｄｉａｇｒａｍｏｆＩＨＣｉｍａｇｅｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇｓｙｓｔｅｍ硕士学位论文时更大的问题在于，我们的细胞膜染图像中有很多细胞膜染色是不均匀的，这与细胞膜具有流动性的生物学特性有关，所以要求收敛的活动轮廓方法对于这种情况有着天生的不适应性。
因此针对上面问题我们对一种基于核膜空间参照重构近似膜的方法做了深入研究和改进，已完成我们免疫组化图像处理在临床中的实际使用。
４．３细胞膜分割方法实现细胞膜分割是一项极有挑战性的工作，因为细胞膜只有在膜边界被染色的情况下才可见，而非染色部分是不可见的，而且与常见的细胞膜分割不一样的是，阴性表达不仅使得膜不染色，而且噪声和染色叠加会让染色扩散，使本来就不连续的轮廓缺乏强度的梯度变化，对于计算机而言这种断续的边缘分割和识别是十分困难的。
免疫组化的图象分析我这里说的免疫组化图片，是这样的一类图片：染上的颜色是黄色，如果染得浓，就呈现棕黄色。
（制作样品的过程可别问我。
我不知道）要比较 不同切片的光密度值来确定它们之间的蛋白表达的差异，首先要注意的就是这些切片样品要用尽可能完全一致的方法来处理。
最近看到一个新技术挺不错，就是把各个样品定位后，各切出一个小细条，整整齐齐排成一个阵列，包埋在蜡块中，切成一片切片，然后进行免疫组化反应及染色处理。
这样在一个载玻片上就有了数百个小切片，不仅它的的切片染色条件一致，还节省了抗体试剂。
切片当然首先得拍成照片才能进行分析。
拍照也是一个重要环节，在显微镜下拍摄免疫组化照片需要注意以下几个要点：1. 所有照片必须在完全同样的显微镜条件下拍摄，在更换样品时，除了调整焦距和视野外，显微镜上的其他部件都不能动！所有的样品必须一次拍摄完全。
特别是在拍 摄过程中，不要一会用高倍镜，一会用低倍镜，来回切换物镜。
当然，在使用高倍镜时对焦及寻找视野会稍麻烦一点，但也没办法。
保持各张切片的拍摄条件一致更 重要。
2.数码相机必须设置为手动曝光，并且保持每张照片用同样的曝光条件，同样的曝光时间，同样的光圈。
特别要注意的是，一定要将数码相机的自动白平衡功能给关掉！！！3. 免疫组化切片一般染色不太深，因此拍摄出的照片颜色较浅，就让它浅。
拍摄出的照片中空白部位应尽可能呈现纯白色。
测量其灰度应在230-240之间。
如果 呈现淡蓝色，一般是相机自动白平衡在起作用。
另外一个因素是显微镜灯光电压不正确。
要使灯光本身的色温正确。
既不偏黄，也不偏蓝。
下面两张照片中左边一张 是合适的曝光，右边那张不好。
打开要分析的图片后首先要进行光密度校正。
点开intensity calibration窗口后，选std option density，并点option按纽，在弹出的窗口里点insident旁边的image按纽。
弹出第三个窗口后，将鼠标移到图片的空白处点一下，就可 以看到current value的值会显示出点击部位的灰度值。
白色的背景能达到250左右，而拍得较暗的照片或者背景偏蓝的照片则只有200甚至更低。
一张照片的背景强度不会是完全一样的。
所以要在照片各个不同的空白处都点一下，看看它们的值差别大不大。
许多相机拍的显微镜照片是中间稍亮，四周暗。
所以最后确定的背景值只能是取它们的折中。
较正背景的值会在曲线的X轴端中表现出来。
光密度校正窗口可以放在屏幕上随时检查，有时候在切换了图片后其光密度校正值会有变化。
现在可以调出count/size窗口，先选择测量项目，前面说过density mean是不合适的测量参数，IOD也有点误差，不过这是系统误差，对半定量分析的影响不大。
所以可以选用IOD与area两个测量项目。
当然把选中区域转换成灰度图片再测量更好。
另外对option也要适当设置一下。
然后要保存count/size窗口的设置，点count/size窗口的 file -- save settings，将当前的测量设置文件保存，最好与图片文件存在同一个文件夹里，免得以后找不到。
文件扩展名是 .env 。
保存这个文件的目的是为了制作宏操作用的。
下面就可以选择颜色了，点select colors ,取HSI颜色系统，S与I都选0到255，H选0到30左右。
这基本上包括了黄色区域。
然后也要保存颜色设置文件。
下面就可以测量光密度值了，点count，然后到statistics窗口中查看测量值。
IOD SUM 与area SUM是有意义的测量值。
IOD SUM是图片中黄色区域的累积光密度，area SUM则是选中的黄色区域的面积。
如果想要测准一点，就需要把选中区域复制下来，再转换成灰度图片后再测量光密度。
作法如下：1.选好颜色区域后，在preview中选 transparent on white，这时图片中未被选中的区域都被填上了白色。
再点create preview image按纽，就生成了一张新图片，再用edit -- convert -- grey scale 8把这张图片转换成八位灰度图片。
2. 重新校正光密度，依然把insistent level定为250。
这实际上就是扣背景了。
3.对灰度图片，select color按纽变成了select range。
点出的选色窗口只有一个强度范围，要选择0到255。
整个照片都选上，当然，选0到250也行，没选上的都是白色区域，测量没有影响。
4.回去点count按纽，到statistics窗口里察看测量值。
IOD的确与上面所作的不同。
area也稍有差异，当属复制图片引入的误差。
下面就是统计问题了。
现在我们测量的是整张照片中黄色区域的总光密度值。
图片与图片之间是否就是比较它们之间的IOD值呢？未必。
最简单的情况是，切片充满整个视野，并没有大片空白。
此时IOD值就能反映出这两张图片染色程度的不同。
实际上这些照片的测量区域面积都是整张图片（不是黄色区域的面积），其平均光密度就是IOD除以图片的整个面积。
实际上比较的就是整个视野的平均光密度。
另一种情况是照片上有空白区域，是没有组织的空白。
因此在计算平均光密度时要把这部分面积给扣掉。
使用的测量指标应该是切片的平均光密度，计算方法为IOD/（照片面积-空白区域面积）照片面积就是照片的象素，一张480*720象素的照片面积是345600。
空白区域面积得另测一下，选色时把 I 选在250-255之间，H选30-255，再count一下就能测出了。
不过这样测有时会把组织内部的小空泡也选进去。
这只要在面积测量中设一个大一点 的过滤值就行，比如只计算面积大于200象素的区域。
还可以看measurement date ,找那个最大的几个object的面积。
如果视野内还有不同类型的组织区域，不应被计算进去，可以用不规则曲线工具选中这些区域，用edit -- filled 把它们填上白色。
再进行测量。
还有其他的一些复杂情况，没法一一叙述。
一句话，测量的IOD是分子的值，一般情况下都相似，选择的area这个分母在不同的切片上却各有不同，需要看切片的具体情况进行适当选择。
本质上比较的指标应该是一个平均光密度（IOD/area）。
当切片较多时，制作一个宏操作能大大省时省力。
制作宏的操作：一、准备工作：1。
进行光密度较正。
命名保存，如system。
2。
在count/size窗口中设置：measurement:area(10-10000000),IOD(0-100000000)option: outline:none, label style:none .clean border:none然后点file --save setting，保存该设置为一个文件date.evn，文件位置最好是分析的图片文件夹里3。
在select color 里选HIS:H 0-30,S,I0-255，然后点下面的file按纽，save color到一个rgb24.rge文件,也存到图片文件夹目录中。
二、录制宏：打开图片，点开count/size窗口，先随便测个数据，这样可以打开view--statistics 窗口，可以随时察看测量数据。
再打开intensity calibration窗口。
现在桌面上有光密度较正窗口、count窗口，数据统计值窗口和图片窗口，以此为运行宏的开始。
点宏--录制宏，先起个名字，指定一个快捷键。
然后开始录制。
注意以下的所有操作都只能用鼠标点，不能动任何键。
1。
在intensity calibration窗口中选上已保存过的较正曲线名，注意一下曲线是不是正确，特别是X轴交点位置是不是刚才较正过的值（如200或240之类）2。
点count/size中的file--load setting，调出刚才保存的date.evn文件。
3。
点select color，在调出的窗口中点HSI，再点load file,调出rgb24.rge文件。
4。
仍然在segmentation窗口中下方的preview中选择 all class 和transparent on white.此时图片上应显示被选中的部分仍是黄色，其他部分被填上了白色。
点create preview image复制下这张preview图片。
5。
在新图片上点一下，再点程序菜单上的edit---convert to --gray scale8。
又生成一张新图片，这是黑白图片了。
点录制宏小窗口的stop结束。
把这张黑白图片保存。
关闭其他的图片，打开Excel,然后开始录制另一个宏：1。
开始录制后依然先点一下intensity calibration 的那个校正。
2。
调出count窗口的setting文件。
3。
点select range。
将range范围选为：0-背景值（这个背景值就是在校正背景时得到的值，如200或240之类）4。
回到count中点count按纽。
5。
到statistics窗口中点file DDE to Excel.6。
结束宏的录制。
说明：由于中间会建立新文件，所以这一步的宏操作常出错。
只好分成两步作宏操作。
宏操作录制完后，处理图象时的操作：1。
打开一个图片，运行第一个宏。
得到一张灰度图片。
2。
对灰度图片执行第二个宏操作。
3。
在excel中把数据转移或抄下来。
4。
先打开下一张要处理的图片，再关闭掉上一张图片。
（桌面上不能一张图片也没有）5。
开始处理下一张图片。
图片测量数据的处理：测量指标要根据图片的情况来选择。
各有不同的选取。
可以：仅比较整张图片的IOD。
比较阳性区域的density mean=IOD(sum)/area(sum) (这里的area是黄色部分的area)有时图片上仅有部分区域有样品，还有大片区域是空白。
这就需要另外测量样品区域的area(sample sum),然后比较IOD（sum）/(sample sum area)单个细胞可以比较每个细胞的IOD 或者是 单个细胞IOD/单个细胞area.这些其他的情况都需要重新制作宏。
