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同时检测动物肌肉中26种β2-兴奋剂和激素残留【摘要】建立了动物肌肉中10种β2兴奋剂、16种激素共26种促蛋白合成剂的固相萃取样品前处理方法，用同位素内标结合气相色谱质谱联用法进行分析。
动物肌肉经过β葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶酶解，酶解液通过SLW固相萃取柱浓缩净化，先用甲醇洗脱16种激素，然后用5%氨化乙酸乙酯洗脱10种β2兴奋剂，后者经过双三甲基硅基三氟乙酰胺+1%（φ）三甲基氯硅烷衍生后，用GC/MS测定β2兴奋剂；前者再用SLH固相萃取柱净化，七氟丁酸酐衍生后用GC/MS测定激素。
结果表明, SLW固相萃取柱能够很好地分离动物肌肉酶解液中10种β2兴奋剂、16种激素,结合GC/MS测定，本方法检出浓度为0.5～1.0 μg/kg，回收率在68. 2%～10３.2%之间，相对标准偏差1.５%～12.4%。
【关键词】促蛋白合成剂β2 兴奋剂激素多种残留气相色谱质谱本文系浙江省卫生厅优秀青年人才基金（No.2006QN007）、浙江省重点科研农业基金（No.2005C22029）和浙江省重大科技攻关基金（No．2005C12007）资助项目* E mail: pgwu@1 引言畜产品生产过程滥用促蛋白合成剂（主要有激素、β2兴奋剂）对食品安全、生态环境造成直接及潜在的危害。
20世纪80年代以来许多国家或组织通过立法来限制或禁止在食用动物养殖中使用促蛋白合成剂。
我国也禁止将促蛋白合成剂用于动物促生长目的。
由于利益驱动，在世界范围内激素和β2兴奋剂仍被大量滥用。
国内外对动物肌肉中激素、β2兴奋剂多残留确认检测技术文献报道很多，主要有气相色谱质谱法(GC/MS)[1～8]、液相色谱质谱法(LC/MS)[9～12]，但所采用的方法很少涉及上述两大类药物多残留的同时检测。
动物性食品中兽药残留由于残留物水平很低，样品基质复杂，干扰物质多，要尽可能除去与目标物同时存在的杂质，减少色谱干扰峰，避免检测器和色谱柱污染，因此样品预处理约占工作量的70%，样品的分离纯化是兽药残留分析中费时和费力的步骤，多类兽药残留集成化检测技术和兽药提取净化技术是今后研究的热点，固相萃取技术、同位素稀释技术近年来在复杂样品药物残留检测中得到广泛应用[1～12]。
免疫分析法测定食品中四环素类药物残留作者：李依孜韩宣怡来源：《食品安全导刊》2021年第08期摘要：四环素类药物在动物疾病的防治中有重要的作用，但随着四环素类药物的广泛使用，出现了滥用、用药不规范等情况，使食品及环境中产生了大量药物残留，食用含四环素类药物残留的食物会对人体健康产生危害。
本文对免疫分析法测定食品中四环素类药物残留进行了研究，主要讨论现今仍在广泛使用的检测方法，并对其性质进行分析，最后对四环素类药物检测的发展趋势进行展望。
关键词：四环素类药物;药物残留;免疫分析法随着畜牧业的发展，兽药残留问题得到了越来越多的关注。
其中四环素类药物价格便宜、抗菌效果好，常用于预防或治疗畜禽等的肠道感染[1]。
合理的使用药物可以使畜禽的患病概率和饲养成本降低。
但在用药过程中，部分养殖人员相关知识储备不足，过量使用药物，或未经过一定周期使药物完全排出，使生产的食品中存留药物或者其代谢产物。
四环素类药物的普遍使用给养殖者提供了很多的便利，但也可能会产生兽药残留问题。
经过长期的摄入，在体内不断蓄积。
过多的抗菌药物作用于人体甚至有致癌、致畸、致突变的危害，尤其对发育不完全的婴幼儿有极大的危害。
四环素类药物遍布体内各处，极易在牙齿和身体骨骼处沉积，与钙元素发生反应，生成难溶物质，不利于青少年的发育，还会导致牙齿发生不可逆的染色，且可对肝脏造成损害。
1 免疫分析法测定目前，测定动物性食品中的四环素类药物有很多种不同的方法，如微生物检测法、免疫分析法、仪器分析法等。
其中仪器分析法虽然具有较高的准确度，但仪器价格昂贵，对操作人员要求较高，并且检测时间长，因此其应用受到了限制。
微生物法样品前处理以及操作步骤简单，但需要二次确证，常用于定性分析。
而免疫分析法是以抗原抗体的结合反应作为基础的一种综合性检验技术。
这种方法具有敏感性高、特异性强的优势，当样品中抗菌药物残留量大于10 μg/kg时即可使用，广泛应用于四环素类药物的定性和定量分析。
液相色谱-串联质谱法测定动物组织中醋酸甲地孕酮与醋酸甲羟孕酮贾涛【摘要】本文以液相色谱-串联质谱法检测动物组织中醋酸甲地孕酮与醋酸甲羟孕酮.试样经3-盐酸葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶酶解后,试样中的雌激素用乙酸乙酯提取,浓缩后用乙腈溶解,正己烷脱脂,阳离子固相萃取柱净化,甲醇洗脱,浓缩后用流动相溶解,高效液相色谱-串联质谱法测定,内标法定量.经试验,醋酸甲地孕酮和醋酸甲羟孕酮在动物肌肉组织中的检测限为1μg/kg(μg/L),定量限为2μg/kg(μg/L)；本方法在2～10μg/kg (μg/L)添加浓度的回收率≥70％,批内相对标准偏差≤20％,批间相对标准偏差≤ 20％；醋酸甲地孕酮的回归方程为y=1.14363x+1.37296,相关系数r=0.9992,醋酸甲羟孕酮的回归方程为y=0.938334x+0.6094,相关系数r=0.9998,从回归方程及相关系数r可以看出药物浓度与色谱峰面积呈线性相关.【期刊名称】《农产品质量与安全》【年(卷),期】2013(000)005【总页数】5页(P48-52)【关键词】液相色谱-串联质谱法;动物组织;醋酸甲地孕酮;醋酸甲羟孕酮【作者】贾涛【作者单位】北京市饲料监察所,北京100107【正文语种】中文醋酸甲地孕酮（megestrol acetate），分子式为C24H32O4，分子量为384.52。
醋酸甲羟孕酮（medroxyprogesterone acetate），分子式为C24H34O4，分子量为386.53。
醋酸甲地孕酮与醋酸甲羟孕酮相比仅甾核B环上多一个不饱和键。
醋酸甲地孕酮与醋酸甲羟孕酮均为人工合成的孕激素，作用类似于黄体酮。
主要是通过抑制垂体前叶促黄体生成激素的释放，从而抑制卵巢排卵过程。
但长期服用会产生药物依赖症，并伴有致癌、致畸风险。
在人类药物应用中，醋酸甲孕酮用作避孕药和激素替代治疗用药；在畜牧业中，曾被用作动物生长促进剂，以促进动物生长，提高饲料转化率，节省成本，提高经济效益，但药物成分会残留在动物肌肉等组织中。
食品中的激素残留分析方法食品中的激素残留一直是公众关注的热点问题之一。
激素残留可能导致食品安全问题和健康风险，因此准确分析食品中的激素残留成为了食品科学研究的重要领域。
本文将介绍几种常用的食品中激素残留分析方法，旨在提供一定的参考和指导。
一、生物检测法生物检测法是指利用生物体对激素的反应进行检测和分析的方法。
常见的生物检测方法包括组织培养法、生物酶法和免疫检测法。
组织培养法可以通过观察组织生长情况来判断激素残留水平；生物酶法则利用生物体中的特定酶来测定激素的含量；免疫检测法则运用抗体与激素结合产生免疫反应进行测定。
二、色谱法色谱法是一种常用的激素残留分析方法，主要包括气相色谱法和液相色谱法。
气相色谱法（GC）通过使食品中的激素化合物在高温条件下挥发，然后通过色谱柱分离和检测。
液相色谱法（LC）则是将食品样品进行提取后，利用液相色谱柱进行分离，并通过检测器进行分析。
色谱法具有分离效果好、分析精确等优点，被广泛用于食品中激素残留的分析。
三、质谱法质谱法是一种高灵敏、高分辨率的分析方法，常用的包括质谱-质谱联用（MS-MS）和质谱-色谱联用（LC-MS）。
质谱-质谱联用通过分析物质的离子化和碎裂，得到其特征离子来进行定性和定量测定。
质谱-色谱联用则将色谱法与质谱法进行结合，既能进行分离，又能通过质谱进行检测。
质谱法由于其高灵敏度和高分辨率的特点，在食品中激素残留的分析中得到了广泛应用。
四、生物传感器法生物传感器法是一种利用生物传感器对激素进行快速、简便和低成本检测的方法。
生物传感器是一种将生物组件与传感装置相结合的分析工具，利用生物组件与激素发生特定的相互作用来实现检测目的。
常见的生物传感器包括光学传感器、电化学传感器和生物反应器等。
生物传感器法具有检测快速、灵敏度高和操作简便等特点，被广泛用于食品中激素残留的分析与监测。
总结：食品中的激素残留分析方法多种多样，在选择分析方法时应根据具体情况综合考虑不同方法的优势和适用范围。
动物肌肉组织中甾类同化激素多组分残留的液相色谱-质谱检测方法秦燕;陈捷;张美金【期刊名称】《分析化学》【年(卷),期】2006(34)3【摘要】建立了不同动物肌肉中甾类同化激素(表睾酮、丙酸睾酮、19-去甲基睾酮、甲基睾酮、孕酮、甲羟孕酮、雌二醇、雌三醇、炔雌醇、雌酮)多残留量的LC/MS/MS确证方法.样品加醋酸缓冲溶液均质,加酶溶液酶解后,再加甲醇超声提取,用叔丁基甲醚液-液萃取至少2次,之后经反相固相萃取柱净化,以乙腈-水为流动相,经C18柱分离后进行LC/MS/MS多反应监测模式下的定性及定量分析.其中雄激素,孕激素采用正离子扫描,雌激素则采用负离子扫描.17beta-NT、MTS、ETS、MED、PG、PTS、EST、17beta-ES、EES和ESN的定量检出限为0.5～1.0μg/kg.在1.0μg/kg的定量检出限添加水平,上述10种激素的平均回收率为55%～77%;相对标准偏差为7.1%～35%.可实现样本灵敏、准确的定性定量分析.【总页数】5页(P298-302)【作者】秦燕;陈捷;张美金【作者单位】广州出入境检验检疫局食品实验室,广州,510623;广州出入境检验检疫局食品实验室,广州,510623;广州出入境检验检疫局食品实验室,广州,510623【正文语种】中文【中图分类】Q95【相关文献】1.固相萃取-液相色谱串联质谱同时测定牛奶中8种甾类同化激素多残留 [J], 吕惠卿;陈慧华;韦敏珏;应永飞2.动物尿液中15种甾类同化激素的液相色谱-串联质谱同时测定 [J], 应永飞;朱聪英;陈慧华;吴平谷;韦敏珏;周文海;陈勇3.动物组织中多种残留非类固醇同化激素的液相色谱-串联质谱法同时测定 [J], 许泓;庞国芳;林安清;古珑;何佳;张曼;张骏;林娜4.气相色谱-质谱法检测动物肌肉组织中残留的甾类同化激素 [J], 陈捷;秦燕;张美金5.超高压液相色谱-串联质谱法快速测定牛肉、牛肾中3种甾类同化激素药物残留量 [J], 王飞;宓捷波;葛含光因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
气相色谱-质谱法测定动物组织中残留的10种β2-兴奋剂吴平谷;陈慧华;王强;应永飞;赵永信;宋国良;徐小明【期刊名称】《色谱》【年(卷),期】2008(26)1【摘要】采用同位素稀释法并结合固相萃取技术,建立了动物组织中马布特罗、特布他林、卡布特罗、克伦特罗、西马特罗、沙丁胺醇、clenpenterol、苯氧丙酚胺、班布特罗、莱克多巴胺等10种β2-兴奋剂残留的气相色谱-质谱(GC-MS)检测方法.动物组织中添加同位素内标D9-克伦特罗、D3-沙丁胺醇、D5-莱克多巴胺,经无水乙醇提取、正己烷脱脂、SLS离子交换固相萃取柱净化后,用双三甲基硅基三氟乙酰胺+1%三甲基氯硅烷衍生,再进行GC-MS测定,内标法定量.结果表明,动物组织中添加2.0～10.0 μg/kg水平的β2-兴奋剂,回收率为72.8%～110.3%,相对标准偏差为1.2%～11.3%,最低检测限为0.5～1.0 μg/kg.【总页数】4页(P39-42)【作者】吴平谷;陈慧华;王强;应永飞;赵永信;宋国良;徐小明【作者单位】浙江省疾病预防控制中心,浙江,杭州,310009;浙江省畜产品质量安全检测中心,浙江,杭州,310020;浙江省农业科学院,浙江,杭州,310020;浙江省畜产品质量安全检测中心,浙江,杭州,310020;浙江省疾病预防控制中心,浙江,杭州,310009;浙江省疾病预防控制中心,浙江,杭州,310009;浙江省疾病预防控制中心,浙江,杭州,310009【正文语种】中文【中图分类】O658【相关文献】1.液相色谱串联质谱法测定动物组织中17种β-兴奋剂残留 [J], 招钰娟;邓晓华;甘沛明;梁雪琪;黎小鹏2.气相色谱-质谱法测定动物尿液中3种β2-兴奋剂药物残留量 [J], 李鹤健;苏青云;祝曙华;黄志波;程雪梅3.气相色谱-质谱法测定动物组织中三种1,2-二苯乙烯类药物的残留量 [J], 吴银良;刘素英;侯东军;沈建忠;王海;单吉浩4.固相萃取-气相色谱/质谱法同时检测动物组织中多种β-兴奋剂残留量的研究 [J], 林维宣;田苗;董伟峰5.气相色谱-质谱法测定动物组织中的β_2-兴奋剂含量 [J], 吴平谷;虞晓珍因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
气相色谱-质谱法检测动物肌肉组织中残留的甾类同化激素陈捷;秦燕;张美金【期刊名称】《色谱》【年(卷),期】2006(24)1【摘要】建立了不同动物肌肉中甾类同化激素残留的气相色谱/质谱(GC/MS)检测方法.样品经酶解、组织捣碎和超声提取后,用叔丁基甲醚萃取和反相固相萃取柱净化,进一步衍生后进行GC/MS分析,分别测定雄激素(表睾酮(ETS)、丙酸睾酮(PTS)、19-去甲基睾酮(17β-NT)、甲基睾酮(MTS))和雌激素(雌二醇(17β-ES)、雌三醇(EST)、炔雌醇(EES)、雌酮(ESN)、苯甲酸雌二醇(BES)).实验结果表明,ETS、17β-NT、MTS、PTS、BES、ESN、17β-ES、EES和EST的定量检测限为1.0～2.0μg/kg.在2.0μg/kg的定量检测低限添加水平,上述9种激素的平均回收率为62.5%～80.5%,相对标准偏差为12.5%～26.8%.该法可实现对样品进行灵敏、准确的定性定量分析.【总页数】4页(P19-22)【作者】陈捷;秦燕;张美金【作者单位】广州出入境检验检疫局食品检测中心,广东,广州,510623;广州出入境检验检疫局食品检测中心,广东,广州,510623;广州出入境检验检疫局食品检测中心,广东,广州,510623【正文语种】中文【中图分类】O658【相关文献】1.动物组织中多种残留非类固醇同化激素的液相色谱-串联质谱法同时测定 [J], 许泓;庞国芳;林安清;古珑;何佳;张曼;张骏;林娜2.动物肌肉组织中甾类同化激素多组分残留的液相色谱-质谱检测方法 [J], 秦燕;陈捷;张美金3.固相萃取-气相色谱/质谱法同时检测动物组织中多种β-兴奋剂残留量的研究 [J], 林维宣;田苗;董伟峰4.超高效液相色谱-串联质谱法检测动物肌肉组织中19种β-受体激动剂残留 [J], 李丹;孙雷;毕言锋;苏富琴;徐秉恩;王鹤佳;徐士新5.超高压液相色谱-串联质谱法快速测定牛肉、牛肾中3种甾类同化激素药物残留量 [J], 王飞;宓捷波;葛含光因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
动物组织中β-兴奋剂类药物多残留酶联免疫检测方法的建立万宇平;刘宁;陶光灿;吴鹏;李勇;崔廷婷【摘要】应用直接竞争酶联免疫吸附技术,建立了一种快速检测动物组织中β-兴奋剂类药物多残留的方法,并对其技术性能进行了评价.结果表明,该方法的IC50浮动范围为0.4～0.7 μg/L,对组织样本的检测限为0.5 μg/kg；样本添加回收率为72.9％～103.5％,变异系数为5.8％～14.1％；可用于检测克仑特罗、沙丁胺醇、塞布特罗、妥布特罗、克仑潘特、溴布特罗、溴氯布特罗、马喷特罗.【期刊名称】《河南农业科学》【年(卷),期】2013(042)002【总页数】4页(P132-135)【关键词】酶联免疫吸附法;β-兴奋剂类药物;多残留;动物组织【作者】万宇平;刘宁;陶光灿;吴鹏;李勇;崔廷婷【作者单位】北京勤邦生物技术有限公司,北京102206;临沂新程金锣肉制品集团有限公司,山东临沂276036;北京勤邦生物技术有限公司,北京102206;北京勤邦生物技术有限公司,北京102206;北京勤邦生物技术有限公司,北京102206;北京勤邦生物技术有限公司,北京102206【正文语种】中文【中图分类】S816.7β－兴奋剂（β－agonist）全称为β－肾上腺素受体激动剂（β－adrenoceptoragonist），又叫β－激动剂，是一类化学结构和生理功能类似肾上腺素和去甲肾上腺素的苯乙胺类衍生物［1］。
因其具有加快畜禽生长、降低脂肪含量、提高瘦肉率等作用［2］，曾被作为饲料添加剂广泛用于畜禽生产。
但β－兴奋剂会在动物组织中形成蓄积性残留，进而通过食物链进入人体，对人的肝、肾等内脏器官产生毒副作用［3］，因此，世界各国已将这类物质列为禁止用于食品动物的化学物质，我国也明确禁止在饲料和动物饮水中使用克仑特罗、沙丁胺醇、西马特罗等β－兴奋剂［4］。
目前，国内外关于β－兴奋剂类药物多残留分析一般使用毛细管电泳法［5－6］、高效液相色谱法（HPLC）［7－8］、气相色谱质谱联用技术（GC－MS）［9－10］及液相色谱质谱联用技术（LC－MS）［2，11］。
酶联免疫法检测动物源性食品中甲羟孕酮的残留张立新;冯才伟;贾芳芳;刘玉梅;杨烁【摘要】本试验旨在利用酶联免疫技术对鸡肉和鱼肉中的甲羟孕酮药物残留进行检测.经过测试,该试剂盒对鸡肉和鱼肉样本的检测限均为1μg/kg；当药物添加浓度为1、2、4μg/kg时,其平均回收率范围是65.5％～94.6％,批内、批间相对标准偏差均小于10％；交叉反应率试验表明该试剂盒的特异性良好;酶联免疫法与仪器法的验证结果一致.【期刊名称】《四川畜牧兽医》【年(卷),期】2013(040)011【总页数】3页(P29-31)【关键词】酶联免疫法;甲羟孕酮;鸡肉;鱼肉;残留【作者】张立新;冯才伟;贾芳芳;刘玉梅;杨烁【作者单位】北京市优质农产品产销服务站,北京 100101;北京勤邦生物技术有限公司,北京 102206;北京勤邦生物技术有限公司,北京 102206;北京勤邦生物技术有限公司,北京 102206;北京勤邦生物技术有限公司,北京 102206【正文语种】中文【中图分类】S851.347.5甲羟孕酮又称甲孕酮，是一种长期避孕药，也可用于一些对激素敏感肿瘤的姑息治疗；鱼类会因为水中微量的甲羟孕酮而改变性别。
人食用含有甲羟孕酮的动物源性食品后，会扰乱人体内分泌、生长发育、免疫系统、生殖系统等方面的正常功能，还可能致癌、致畸，因此建立检测动物源性食品中甲羟孕酮残留的方法很有必要。
目前，检测该类药物的方法主要是仪器法，但其资金、人员等成本投入较高，不宜推广。
本试验运用酶联免疫检测法，测定了鸡肉和鱼肉中甲羟孕酮的残留量，旨在寻找成本更低的替代检测方法。
1 材料与方法1.1 材料与仪器甲羟孕酮ELISA检测试剂盒（包含96孔酶标板，甲羟孕酮标准品，酶结合物，底物液、终止液、洗涤液、复溶液），购自北京某生物技术有限公司；氢氧化钠、乙腈等购自北京某试剂公司；鸡肉、鱼肉样品购自超市；酶标仪购自上海某分析仪器有限公司，涡旋仪、均质器购自湖南某科学仪器有限公司。
收稿日期：２００６－０４－１１ ＊通讯作者基金项目：国家自然科学基金项目（２０４７５０２２）作者简介：刘剑波（１９８２－），男，硕士研究生，研究方向为食品安全。
酶联免疫和气质联用检测动物不同组织中残留甲羟孕酮刘剑波１，彭池方２，胥传来２，＊，金征宇２（１．湖南岳阳市质量技术监督局，湖南 岳阳 ４１４０００；２．江南大学食品学院，江苏 无锡 ２１４０３６）摘 要：本文应用酶联免疫分析（ＥＬＩＳＡ）测定了ＭＰＡ在动物源可食性组织中的残留量，并采用气相色谱－质谱联用（ＧＣ－ＭＳ）方法加以确证。
以０．８ｍｇ／ｋｇ剂量连续喂服５ｄ，停药７ｄ后，白兔的腿肌肉、肝脏和肾脏中中ＭＰＡ残留量分别为白兔腿肌肉残留量为７、６、２３μｇ／ｋｇ水平。
分析ＧＣ－ＭＳ确证方法与ＥＬＩＳＡ方法所得结果，两者检测结果相关性良好。
关键词：甲羟孕酮；残留；酶联免疫分析；气相色谱－质谱联用Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｍｅｄｒｏｘｙｐｒｏｇｅｔｅｒｏｎｅ Ａｃｅｔａｔｅ ｉｎ Ａｎｉｍａｌ Ｔｉｓｓｕｅｓ ｂｙ ＥＬＩＳＡ ａｎｄ ＧＣ－ＭＳＬＩＵ Ｊｉａｎ－ｂｏ１，ＰＥＮＧ Ｃｈｉ－ｆａｎｇ２，ＸＵ Ｃｈｕａｎ－ｌａｉ２，＊，ＪＩＮ Ｚｈｅｎｇ－ｙｕ２（１．Ｙｕｅｙａｎｇ Ｂｕｒｅａｕ ｏｆ Ｑｕａｌｉｔｙ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｓｕｐｅｒｖｉｓｉｏｎ， Ｙｕｅｙａｎｇ ４１４０００， Ｃｈｉｎａ；２．Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｙａｎｇｔｚｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｗｕｘｉ ２１４０３６， Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ ：Ｔｈｅ ＭＰＡ ｒｅｓｉｄｕｅ ｗａｓ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｂｙ ＥＬＩＳＡ ｉｎ ｔｈｅ ｅｄｉｂｌｅ ｔｉｓｓｕｅｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ａｎｉｍａｌ． Ａｆｔｅｒ ５ ｄａｙｓ ｏｒａｌ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎａｔ ０．８ｍｇ／ｋｇ， ｔｈｅ ＭＰＡ ｒｅｓｉｄｕｅ ｉｎ ｍｕｓｃｌｅ， ｌｉｖｅｒ ａｎｄ ｋｉｄｎｅｙ ｗｅｒｅ ７， ６ ａｎｄ ２３μｇ／ｋｇ， ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ． Ｔｈｅ ａｂｏｖｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ａｒｅ ｃｏｎｆｉｒｍｅｄｂｙ ＧＣ－ＭＳ． Ａｎｄ ａ ｇｏｏｄ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｉｓ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ＧＣ－ＭＳ ａｎｄ ＥＬＩＳＡ ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ＭＰＡ（ｍｅｄｒｏｘｙｐｒｏｇｅｔｅｒｏｎｅ ａｃｅｔａｔｅ）；ｒｅｓｉｄｕｅ；ＥＬＩＳＡ；ＧＣ－ＭＳ中图分类号：Ｒ３９２－２３；Ｏ６５７．６３ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００２－６６３０（２００７）０３－０２５７－０４甲羟孕酮（ｍｅｄｒｏｘｙｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅ ａｃｅｔａｔｅ，ＭＰＡ）为一种合成孕激素，属于同化激素，具有蛋白质同化作用，在畜牧养殖中主要用于动物繁殖、生育疾病治疗等，同时它在促生长应用中也有很长的历史。
长期摄入过量残留ＭＰＡ等同化激素的动物食品会给人体带来许多危害，目前许多国家都禁止同化激素用于动物催肥［１－２］。
我国农业部也制定有关激素使用的法规［３］，开始逐步规范这些兽药的使用。
研究兽药在不同靶组织的残留分布情况，不仅可以为ＭＲＬ（最大残留限量）的制定提供科学的参考，同时对实际情况中选择何种靶组织和监测方法也具有重要意义。
目前，许多国家对ＭＰＡ都规定了残留限量，或禁止检出，而我国对ＭＰＡ在可食性动物组织的残留尚未作出明确规定。
有关ＭＰＡ在动物饲养中的研究主要是针对其同期发情的应用，对其残留检测的研究也主要是仪器分析方法［１－４］，而ＥＬＩＳＡ方法较少，且主要是ＥＬＩＳＡ药物代谢研究中的应用［５－６］。
因此，有必要采用ＥＬＩＳＡ方法分析ＭＰＡ在动物不同可食性组织中的残留量，开展该方法对靶组织的应用研究。
对于兽药残留的监测和分析，目前常采用的检测流程是先用ＥＬＩＳＡ方法筛选，再采用仪器分析，如ＧＣ－ＭＳ、ＬＣ－ＭＳ２等方法加以确证。
本文采用先采用ＥＬＩＳＡ方法检测阳性白兔的肌肉、肝脏、肾脏中ＭＰＡ的残留量，然后采用ＧＣ－ＭＳ方法加以确证，初步得到ＭＰＡ在动物可食性组织中的残留分布情况，并探讨两种方法检测动物可食性组织的可行性。
１材料与方法１．１材料醋酸甲羟孕酮检测试剂盒 荷兰Ｅｕｒｏ－ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ公司；Ｃ１８固相萃取小柱（５００ｍｇ／６ｍｌ）、色谱纯乙腈 江苏汉邦科技公司；醋酸甲羟孕酮、Ｎ－甲基－Ｎ－三甲基硅烷－三氟乙酰胺（ＭＳＴＦＡ）和三甲基氯硅烷（ＴＭＣＳ） Ｓｉｇｍａ公司；其它未经说明试剂均为分析纯。
２月龄雌性新西兰白兔和饲料为无锡山禾药业公司ＳＰＦ动物实验室提供。
１．２仪器ＭｕＬｔｉｓｋａ Ｍｋｓ酶标仪；Ｗｅｌｌｗａｓｈ Ｐｌｕｓ洗板机；可调试移液器 Ｔｈｅｒｍｏ ｅｌｅｃｔｒｏｎ公司；气相色谱－质谱仪：Ａｇｉｌｅｎｔ ６８９０Ｎ气相色谱－Ａｇｉｌｅｎｔ ５９７３Ｎ型质谱检测器；色谱柱：Ａｇｉｌｅｎｔ １２２－１０３２ 毛细管柱ＤＢ－１，０．２５ｍｍ×３０ｍ×０．２５μｍ；ＦＡ２５匀质器 Ｆｌｕｋａ公司；ＴＤＬ８０－２Ｂ离心机 上海安亭仪器公司。
１．３方法１．３．１动物饲养与样品制备３只白兔，将ＭＰＡ水悬浊液（０．８ｍｇ）经１４号导尿管灌入每只兔胃中，一日一次，连续５ｄ，定期定量喂养饲料，宰杀前休药７ｄ。
分离肝脏、肾脏和腿部肌肉，分别剪碎，匀质。
１．３．２ＥＬＩＳＡ分析取１．０ｇ匀质样品于玻璃管中，按照ＥＤ公司试剂盒说明书（版本：５１３１ＭＰＡ１ｐ［２］０９．０２）进行样品的提取、净化及ＥＬＩＳＡ操作。
１．３．３ＧＣ－ＭＳ分析参考上述说明书，如下提取、净化样品。
加入１０．０ｍｌ环己烷，涡旋３０ｓ，２０００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ，取上清。
上清转移至未活化的Ｃ１８柱中（流速约为０．５ｍｌ／ｍｉｎ），以３ｍｌ环己烷洗涤柱子，真空干柱１０ｍｉｎ，用３．５ｍｌ ８０％甲醇洗脱，加２ｍｌ蒸馏水到洗脱液中。
再转移到另一Ｃ１８柱（分别用５ｍｌ １００％和５ｍｌ ５０％甲醇预先洗涤），用７．０ｍｌ ５０％甲醇洗涤柱子，真空干柱；用５．５ｍｌ ８０％甲醇洗涤柱子（流速１．０ｍｌ／ｍｉｎ）。
提取净化液的碱解［７］５０氮气流蒸发洗脱液，残余物溶于０．２ｍｌ １．０ｍｏｌ／Ｌ ＫＯＨ甲醇碱解液，３７℃下保温３０ｍｉｎ，加入１．０ｍｌ酸性缓冲液（取１．７ｍｌ盐酸与９８．３ｍｌ ２ｍｏｌ／Ｌ，ｐＨ５．２醋酸盐缓冲液混合）中止水解。
此混合液用３．０ｍｌ 叔丁基甲醚提取两次，合并提取液，４０℃用氮气蒸发浓缩，转移至衍生化小瓶中，４０℃继续氮气蒸发至干。
制备ＭＰＡ的三甲基硅衍生物［３］：衍生化溶液为含有５％ＴＭＣＳ的ＭＳＴＦＡ乙腈溶液（４０／６０，Ｖ／Ｖ），新鲜配制。
加１００μｌ衍生化溶液至衍生化小瓶中，６０℃烘箱中加热反应１０ｍｉｎ，将反应液５０℃氮气蒸发至干，残余衍生物溶于２５μｌ异辛烷。
色谱条件如下：进样２μｌ不分流；载气为高纯氦，２．５ｍｌ／ｍｉｎ；升温程序为１６０℃（１ｍｉｎ）→２０℃／ｍｉｎ→３００℃；接口温度 ２８０℃；质谱条件：溶剂延迟１０ｍｉｎ；电离模式 电子轰击，７０ｅＶ；离子源温度２３０℃；四级杆温度１５０℃；电子倍增器电压 自动调谐值加２００Ｖ；选择离子３７３、２８３、２６５、１４５。
２结果与分析２．１ＥＬＩＳＡ分析ＥＬＩＳＡ分析标准曲线见图１。
从图１看出，作为痕量分析方法，ＥＬＩＳＡ标准曲线，从０．２ｎｇ／ｍｌ到４０ｎｇ／ｍｌ，仍有较好的线性关系。
因此，具备了较好的定量作用。
分析结果见表１。
由于游离的和乙酰化的甲羟孕酮有可能同时残留于各组织中，因此，ＥＬＩＳＡ分析所得的结果综合了两种形式的甲羟孕酮。
因此，有必要采用ＧＣ－ＭＳ等物理方法加以确证。
－１０１２Ａ０（％）ｌｇ Ｃ（ｎｇ／ｍｌ）图１ ＥＬＩＳＡ标准曲线Ｆｉｇ．１ ＥＬＩＳＡ ｓｔａｎｄａｒｄ ｃｕｒｖｅ２．２ＧＣ－ＭＳ分析所采用的ＧＣ－ＭＳ方法为文献中所述的欧盟残留检测确证方法。
图２为标准溶液和三种组织样品的总离子色谱图，采用选择离子为３７３、２８３、２６５和１４５四种离子，根据欧盟兽药残留质谱确证方法要求［８］，ＧＣ－ＭＳ选择四种离子扫描监测，得到四分，从而使待测物结构得以确定。
分析所得到的色谱峰的质谱图，将图（ｄ）、（ｆ）和（ｈ）与（ｂ）相比较，仅有肾脏样品的２６５质谱峰相对丰度比其它的高，这是由于２６５峰的相对峰度仅略大于１０％，在电子轰击离子源下，相对偏差可达到５０％，再加上基质干扰的影响，使得其偏离较大。
通过ＥＬＩＳＡ分析得到该肾脏样品中含有ＭＰＡ，同时，采用ＧＣ－ＭＳ分析未经过水解处理的此样品时，肾脏样品在１３～１４ｍｉｎ区域没有ＭＰＡ峰，而经水解处理后，该区域找到ＭＰＡ峰，因此，推测在肾脏中ＭＰＡ主要以乙酰化的酯分子形式存在。
酯分子无游离的羟基于与所采用的衍生试剂形成三甲基硅烷化醚，而经过水解，有了游离的羟基，可衍生试剂形成三甲基硅烷化醚，在相对应的保留找到对应的峰，故而断定其为ＭＰＡ。
ＧＣ－ＭＳ分析所得结果见表１。
分析表１结果，考虑到动物个体的差异，分析平均残留量，白兔腿肌肉残留量为７μｇ／ｋｇ，肝脏中残留量为５～６μｇ／ｋｇ，肾脏中残留量为２３μｇ／ｋｇ。
总体看来，肌肉和肝脏处于同一数量级，低于１０ｎｇ／ｍｌ，而肾脏中残留量则比肌肉和肝１３．２０１３．４０１３．６０１３．８０１４．００丰度时间（ｍｉｎ）（ａ） ４．７５ｎｇ／ｍｌ ＭＰＡ标准总离子色谱图１４０１６０１８０２００２２０２４０２６０２８０３００３２０３４０３６０丰度ｍ／ｚ（ｂ） （ａ）图中保留时间（Ｒｆ）对应质谱图８１０１２１４丰度时间（ｍｉｎ）（ｃ） 腿肌肉总离子色谱图１４１６１８２０２２２４２６２８３０３２３４３６丰度ｍ／ｚ（ｄ） （ｃ）图中Ｒｆ １３．４５ｍｉｎ对应质谱图７８９１０１１１２１３丰度时间（ｍｉｎ）（ｅ） 肾脏总离子色谱图１４１６１８２０２２２４２６２８３０３２３４３６丰度ｍ／ｚ（ｆ） （ｅ）图中Ｒｆ １３．３１ｍｉｎ对应质谱图７８９１０１１１２１３１４丰度时间（ｍｉｎ）（ｇ） 肝脏总离子色谱图图２ 各样品ＧＣ－ＭＳ总离子色谱图和质谱图Ｆｉｇ．２ ＧＣ－ＭＳ ｔｏｔａｌ ｉｏｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈ ｏｆ ｓａｍｐｌｅｓ ａｎｄ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｕｍｓ脏显著高，大于２０μｇ／ｋｇ。
此外，由于动物个体的差异，不同动物间的残留量差异可达到１６％～２４％。
２．３ＥＬＩＳＡ和ＧＣ－ＭＳ分析ＭＰＡ在组织中残留的相关性两种方法结果相关性见图２，可见两种方法相关性很高，从而说明，在开展ＭＰＡ在兔组织中残留行为的研究时，采用ＥＬＩＳＡ方法与ＧＣ－ＭＳ方法一样，均可以１４０１６０１８０２００２２０２４０２６０２８０３００３２０３４０３６０丰度ｍ／ｚ（ｈ） （ｇ）图中Ｒｆ １３．４６ｍｉｎ对应质谱图得到较准确的数据。
