酶联免疫(ELISA)使用试剂盒检测过程中值得关注的问题

ELISA实验中的这些坑你别跳1971年瑞典学者Engvail和Perlmann，荷兰学者Van Weerman和Schuurs分别报道将免疫技术发展为检测体液中微量物质的固相免疫测定⽅法，即酶联免疫吸附测定法 (ELISA) 。

ELISA技术经过40多年的历史演变，⽬前仍然是⽤于定量检测⼤分⼦抗原常⽤的⼀种免疫测定技术。

⽆论你是实验室⼩⽩还是PhD⼤拿，只要是进⾏与免疫学相关的研究，⼀定离不开ELISA这门⼜⽼⼜实⽤的技术。

然⽽，说起ELISA实验，每个⼈都有⾃⼰不同的观点，有⼼酸也有喜悦。

为此，索莱宝列出部分ELISA实验中的⼩诀窍，告诉你：这些坑以后不必再跳了，让你成为师妹眼中的暧昧。

师妹师兄，ELISA实验最近⽼是问题不断，快帮我⽀⽀招吧。

什么问题？师兄师妹太多了，空⽩板；整板阳性或跳孔；标曲好样本值没结果等等。

不要着急，让我看看你的实验步骤和⽅案。

师兄师妹这个试剂盒购⾃国内***⼚家，按照说明书操作的啊。

我前⼏天⽤过索莱宝公司⽜MMP-9 ELISA试剂盒（Bovine MMP-9 ELISA Kit），结果还不错。

针对你实验过程中的问题，需要注意的有以下⼏点：1、样本：⾸先需要确认商品化试剂盒说明书中所述检测样本类型，⾎清、⾎浆和细胞上清还是组织裂解液等，样本禁⽤叠氮钠作防腐剂，避免反复冻融；2、样本稀释倍数：根据预实验的不同稀释梯度来确定正式实验样本的稀释倍数。

⼀般情况下，为了消除复杂基质中⼲扰成分的影响，⾄少进⾏2倍因⼦稀释；3、为了试验结果的准确性，尽量每个样本都做双孔重复；数据分析采⽤4-相参数曲线拟合（4-pI或sigmoidal曲线拟合）；4、如出现空⽩板的结果，请重复试验，确认每个步骤均正确操作，每步加样准确⽆误；5、如出现整板阳或跳孔的结果，请重复试验，避免每个步骤可能引起的污染，确保正确⽆误的操作，特别是洗涤过程；6、如果标曲好但是样本值没结果，说明试剂盒和操作均没有问题，可能原因：⼀是样本中⽬标分析物的含量太低，低于试剂盒的检测限，建议可选⽤更⾼灵敏度的产品或其他的⽅法检测；⼆是实验处理的⽅案需要调整优化；三是实验处理对样本中靶标物的含量⽆影响。

酶联免疫吸附测定（ELISA）常见问题及步骤酶联免疫吸附测定（ELISA）的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。

结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。

实验步骤1.标准品的稀释：按表1在小试管中进行标准品的稀释。

2.加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、标准孔、待测样品孔。

在酶标包被板上标准品准确加样50µl，待测样品孔中先加样品稀释液40µl，然后再加待测样品1 0µl（样品最终稀释度为5倍）。

加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。

3.温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。

4.配液：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30 倍稀释后备用5.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置 30 秒后弃去，如此重复 5次，拍干。

6.加酶：每孔加入酶标试剂50µl，空白孔除外。

7.温育：操作同3。

8.洗涤：操作同5。

9.显色：每孔先加入显色剂A50µl，再加入显色剂B50µl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15 分钟.10.终止：每孔加终止液50µl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。

11.测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（O D值）。

测定应在加终止液后15分钟以内进行。

12.计算：以标准物的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD 值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD 值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。

BDNF的ELISA结果显示为毫微克/毫克组织（ng / mg）或皮克/mL上清液（pg / mL），并表示为平均值±SEM。

常见问题一、白板现象：显色结束后，酶标板所有孔均无颜色，阳性对照不显色。

elisa操作过程中的注意事项Elisa（酶联免疫吸附试验）是一种常用的实验方法，用于检测抗体或抗原的存在和浓度水平。

在进行Elisa实验时，有一些注意事项需要遵循，以确保实验结果的准确性和可靠性。

本文将介绍Elisa操作过程中的注意事项，帮助您顺利完成实验。

实验前的准备工作非常重要。

确保所有试剂和设备都按照指示进行保存和储存，并检查它们的有效期。

此外，实验室应保持清洁整洁，并遵循良好的实验室操作规范，如佩戴实验手套和实验室外套。

在进行Elisa实验之前，需要准备样品和标准曲线。

样品的选取和处理要仔细进行，确保样品的纯度和稳定性。

如果需要进行稀释，应根据实验要求选择适当的稀释液，并按照比例进行稀释。

接下来，选择合适的酶标板进行实验。

酶标板的材质和孔数应根据实验要求进行选择。

在将样品和标准品加入酶标板孔中之前，应先进行预洗步骤。

预洗可以去除杂质和非特异性结合，从而提高实验的灵敏度和特异性。

在加入样品和标准品之前，要确保将酶标板孔标记清楚，并按照实验设计进行分组。

此外，为了避免交叉污染，每个孔要使用新的吸头或移液器头。

在加样过程中，要保持操作的准确性和稳定性，避免溅出或误操作。

加样完成后，将酶标板密封，并进行孵育步骤。

孵育温度和时间应根据实验要求进行调整。

在孵育过程中，要避免震动或移动酶标板，以免干扰反应。

此外，为了保持温度的稳定性，可以将酶标板放置在恒温箱中进行孵育。

孵育完成后，需要进行洗涤步骤。

洗涤的目的是去除非特异性结合物质，从而减少背景干扰。

洗涤缓冲液的选择和洗涤次数要根据实验要求进行调整。

洗涤过程中，要注意不要将吸头或移液器头碰到酶标板底部，以免损坏酶标板。

洗涤完成后，需要加入检测抗体或底物。

在加入检测抗体之前，要先进行适当的稀释，并确保检测抗体的纯度和活性。

加入检测抗体后，要进行二次孵育和洗涤步骤，以确保特异性结合和去除非特异性结合。

进行底物反应和读板步骤。

底物的选择要根据实验要求进行，常见的底物有TMB（3,3',5,5'-四甲基苯基二氨基联苯基三甲基苯并噻唑啉）和ABTS（2,2'-联氨基双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)）。

ELISA试验中常出现的问题及解决方法作者：吴召坤，巩雪英，刘粉红来源：《兽医导刊》 2016年第8期吴召坤巩雪英刘粉红/陕西省丹凤县畜牧兽医中心ELISA试验，即酶联免疫吸附试验，具有敏感性高的特点，兽医实验实常用ELISA试验检测样品的抗原或抗体，ELISA试验中很多因素都会影响试验的结果，试验中常出现的有显色淡，灵敏度偏低、样品重复试验差异大、假阳性和假阴性等。

这些都会使我们对样品的真实结果做出误判，现就ELISA试验中非正常检测结果产生的原因进行分析，寻讨其解决的办法，以提高检测的准确性。

一、显色淡，灵敏度低1.查看试剂盒是否在有效期内，是否按照保存温度保存。

试剂盒过期或保存温度过高（正常保存温度2℃～8℃）都会影响显色。

2.试剂盒从2℃～8℃冰箱取出后在室温平衡至少20～30min。

3.温育时间不足或培养箱温度不足37℃，在ELISA试验中一定要注意温育时间和温度的重要性，在温育的过程中尽量不要打开温箱，僻免温度忽上忽下。

温育时间不足，温度过低都会影响显色。

4.严格按照试剂说明书要求的洗涤方法洗涤，洗涤时加洗涤液不能冲击过大，浸泡时间过长，要按照说明书上要求的洗涤次数洗涤。

5.加样不足，加样时要按照加样量调整好移液器的刻度，使用配套，内壁光滑清洁的吸头，吸头不能交叉使用，同时要对移液器进行校准，僻免加样不足使显色不足。

6.配制洗涤液的水要用纯水机过滤的水，水质应清洁无异常，不能用酸性过大或碱性过大的水，最好用新鲜合格的蒸馏水。

二、样品重复试验差异较大在检测过程中有时同一样品两次检测结果不一样，差异较大，这种情况可能存在以下几种原因。

1.两次检测样品数量可能不同，加样时间长短不一，反应时间长短不一，所以重复检测某一样品时，尽量与第一次加样时间一致。

2.加样量不一致，样品稀释倍数要准确，充分混匀，两次加样要使用同一个移液器。

3.温育时间和温度不一致，洗涤及操作人员不一致。

重复检测样品，操作条件，人员等检测过程应与上次保持一致。

ELISA试剂盒常见注意事项LISA方法被广泛应用于各种抗原和抗体测定。

但ELISA测定中影响因素较多，而且其操作中有一定的技术要求，在检测过程中除正常反应外，有时常见到一些错误的结果。

引起ELISA测定错误结果的原因主要有：①标本因素；②试剂因素；③操作因素。

下面就一些常见ELISA操作过程中的问题一一分析。

1．样品稀释酶联免疫反应是一种敏感性很高的反应，如果血清不稀释，不可避免会产生很强的非特异性反应，出现假阳性。

因此，国外检测血清抗体的试剂盒，均规定将血清稀释至适当的倍数，以降低非特异性反应，使特异性的抗原抗体反应充分体现出来。

一般产品的样品稀释倍数均通过大量试验确定，以保证试验的灵敏度和特异性。

但是，有些用户未能严格按使用说明书操作，如某些产品应取10μl样品进行稀释，个别用户取5μl甚至1μl样品进行稀释，由于吸嘴上不可避免地沾有样品以及微量移液器的精度不够，因此造成样品稀释倍数不准确，检测结果出现问题。

2．试剂盒平衡3．样品和试剂的混匀稀释前、后的样品必须充分混匀，所有试剂在加样前也须摇匀，以保证试验的均一性。

4．加样5．温育温育是ELISA测定中影响测定成败zui为关键的一个因素。

ELISA作为一种固相免疫测定，抗原抗体的结合反应在固相上进行，要使液相中的抗原或抗体与固相上的特异抗体或抗原完全结合，必须在一定的温度条件下反应一定的时间。

温育所需时间与温度成反比，即温度越高，则所需时间相对较短。

zui为常用的温育温度有37℃和室温，其次是43℃和2～8℃。

一些操作者，擅自改变说明书操作，使用自己喜欢的温育时间和温育温度，这样造成一些不必要的麻烦。

因为，不同试剂盒有不同的温育时间和温育温度的选择，随意更改温育时间或者温育温度将导致试验结果出现偏差。

6．洗板固相免疫测定技术是一种非均相免疫测定技术，需以洗涤操作将特异结合于固相的抗原或抗体与反应温育过程中吸附的非特异成份分离开来，以保证ELISA测定的特异性。

酶联免疫（ELISA）使用试剂盒检测过程中值得关注的问题酶联免疫（ELISA）使用试剂盒检测过程中值得关注的问题1、仪器质控为使仪器保持最佳工作状态，应建立维护和校正仪器的标准操作程序（SOP），所要控制的仪器包括移液器（加样枪）、温箱、洗板机和酶标仪。

◎移液器：ELISA加样量小（20-200μl），其准确性直接影响实验结果，利用称重法检查：低、中、高三个刻度分别吸取指示量的水，万分之一天平称重后计算吸量是否准确，一般应在±5%以内；◎恒温箱：经常检查恒温箱温度计所示的温度和水中（或温箱内）实测温度是否一致，允许有±1℃的误差；◎洗板机：每个厂家设置洗板后的残留液有各自的规定，一般不超过2μl；人工扣板时，垫纸不湿；定期检查管孔是否堵塞；◎酶标仪：经常维护其光学部分，防止滤光片霉变，定期检测校正，使其保持良好的工作性能。

2、试剂盒选择◎应尽量选择正规厂家，产品经相应政府部门审核认可，试剂应从灵敏度、特异性、精密度、稳定性、简便性、安全性及经济性全面评价。

◎灵敏度：有二层含义，1）为试剂检出被检物质的最低量的能力；2）为试剂对大量样品中阳性检出的能力。

◎特异性：常用交叉反应率表示。

含有与待测物相近结构部份的物质可能存在交叉反应，使测定结果升高，可能导致假阳性，所以交叉反应是评价其质量的关键指标。

◎精密度：ELISA试剂一般指其批内CV%，其值应小于15%；定量试剂应同时考察线性范围。

◎准确度：通过添加回收实验进行评价。

◎简便性：指在不影响试剂的前三项指标的前题下，实验和测定步骤越少越好，在定性实验中结果判断简单明了，定量试验结果计算也应简单。

◎安全性：指试剂对操作者和环境安全无害无传染性。

◎经济性：试剂在同等质量条件下通过大规模生产或技术进步降低成本，而市场价格比较合理。

◎试剂评价：需要有权威的确证方法和确证的样品进行检测。

3、样本前处理注意事项3.1 均质组织样本:肉、肝食品类切细，用绞肉机反复绞碎，混合均匀。

酶联免疫吸附实验常见问题分析Q1.标曲不显色或显色很弱，样本显色溶解标准品以及倍比稀释时，未涡旋震荡或不够充分。

标准品溶解、倍比稀释时均需要涡旋震荡以保证充分混匀。

单纯依靠移液器反复吹打，效率较低、效果也不一定最佳。

Q2.标曲和样本均不显色在孵育阶段静置在桌面上，这样非常不利于抗原抗体之间的充分接触，导致显色偏弱。

推荐孵育阶段，使用ELISA专用的微孔板振荡器，调至合适的频率，使抗原抗体充分接触，保证结合效果。

如果排除上述原因，有可能是漏加了某个组分，如检测抗体、酶等。

对于比较马虎的新手，一定要做好标记和记录，或者使用添加染料的ELISA试剂盒。

Q3.标曲显色，样本不显色当样本中目的蛋白浓度极低或者样本中干扰因素较强，就无法检测到。

目前ELISA仍然是蛋白检测灵敏度最高的方法，与不同技术结合后，衍生出了多种类型的ELISA，提高了检测灵敏度。

对于目的蛋白浓度特别低的样本，可以尝试用高敏ELISA，但这也并不意味着一定能检测到样本浓度，只能说可以提高样本的可测率，并使结果更加可靠。

因为通常用普通ELISA检测的样本OD值都偏低，而高敏ELISA可提高样本OD值，使之尽量位于标曲范围内，得到的数值也更加可信。

Q4.标曲和样本都显色，但复孔的CV大这个问题就跟移液器和实验者的操作有关了。

移液器的使用维护不规范，就会造成移液的误差较大；实验者自身的操作习惯、加样的一致性对复孔的CV也有很大影响。

掌握移液器的正确使用和维护。

关于个人的操作可练习移液动作、加快速度，确保移液的精密度。

Q5.本底偏高，样本值测不到标曲的本底即Blank孔的OD值一般要求控制在0.1以下(对于高敏ELISA可以适当放宽要求)。

尤其是样本值特别低的时候，本底过高会掩盖目的信号，导致无法测到样本值。

在加入TMB显色后，需实时观察标曲显色情况。

通常在S5孔有肉眼可见的微弱蓝色，即可终止反应。

Q6.样本经不同梯度稀释，计算得到的样本值差异较大有时候我们不清楚样本中目的蛋白的浓度如何，应该如何稀释，那么我们就会做下预实验，确定稀释倍数。

酶联免疫吸附试验注意事项一、前言酶联免疫吸附试验（ELISA）是一种常见的生物学实验技术，用于检测抗体或抗原的存在。

在进行ELISA实验时，需要注意许多细节，以确保实验结果准确可靠。

本文将详细介绍ELISA实验中需要注意的事项。

二、试剂准备1. 标准品的制备：标准品是ELISA实验中非常重要的一个组成部分，它通常用于建立标准曲线，从而确定未知样本中抗体或抗原的浓度。

在制备标准品时，应该按照厂家提供的说明书严格操作，并注意其保存方式和有效期。

2. 酶标板的处理：在使用酶标板之前，应该先进行预处理。

通常情况下，酶标板需要用PBS（磷酸盐缓冲液）或其他缓冲液洗涤数次才能去除表面上可能存在的污染物。

此外，在使用酶标板之前还应该对其进行预热处理。

3. 酶联试剂盒中其他试剂的制备：除了标准品和酶标板之外，ELISA试剂盒中还包括其他试剂如探针、底物、停止液、缓冲液等。

在制备这些试剂时，应该按照说明书中的要求进行操作，并注意其保存方式和有效期。

三、样本处理1. 样本的收集和保存：在进行ELISA实验之前，需要先收集样本并储存起来。

对于血清或血浆样本，应该使用无菌的容器进行收集，并在室温下离心去除细胞残留物。

此外，在储存样本时应该避免反复冻融，以免影响实验结果。

2. 样本的稀释：在ELISA实验中，通常需要将样本稀释到一定浓度才能进行检测。

稀释倍数应该根据实验需要和样品浓度确定，并严格按照说明书中的要求进行操作。

四、实验操作1. 洗板步骤：洗板是ELISA实验中非常重要的一个步骤，它用于去除不特异性结合物质以及未结合试剂等。

在洗板时应该注意以下几点：（1）洗涤次数：通常情况下，每个孔洗涤3-5次即可。

（2）洗涤缓冲液：不同的试剂盒可能需要使用不同的洗涤缓冲液，应该按照说明书中的要求进行操作。

（3）洗涤时间：洗板时间应该控制在适当的范围内，过长或过短都可能影响实验结果。

2. 加样步骤：在加样时应该注意以下几点：（1）加样量：加样量应该根据实验需要和样品浓度确定，并严格按照说明书中的要求进行操作。