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酶联免疫吸附试验 PPT课件

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ELISA原理与应用-很详细PPT课件

ELISA原理与应用-很详细PPT课件
它具有高灵敏度、高特异性和可定量等优点，广泛应用于生物医学研究、临床诊 断、食品安全等领域。
ELISA的原理
酶联免疫吸附测定的基本原理是抗原 -抗体反应，即利用抗原与抗体之间 的特异性结合，实现对目标分子的检 测。
随后加入酶标记的抗体或抗原，与固 相载体上的抗原或抗体发生特异性结 合，形成酶标记的抗原-抗体复合物。
Elisa技术简介
简要介绍Elisa技术的原理、特点、 分类和应用范围，让读者对Elisa技 术有一个初步的了解。
结合图表和图片，形象生动地展示 Elisa技术的操作流程和实验设计，便 于读者理解和记忆。
02
Elisa原理
酶联免疫吸附测定（ELISA）的定义
酶联免疫吸附测定（ELISA）是一种基于抗原-抗体反应的检测技术，通过酶标记的 方法，将抗原或抗体结合到固相载体上，实现对目标分子的定量或定性检测。
标准化问题
不同实验室间Elisa检测结果 的标准化问题尚未完全解决，
导致结果可比性不高。
对操作人员要求高
虽然Elisa技术操作简便，但 对操作人员的专业知识和技能
要求较高。
06
Elisa技术的发展趋势和未来展望
技术创新和改进
自动化技术
提高检测的自动化程度，减少人 工操作，提高检测效率。
纳米技术
利用纳米材料提高检测的灵敏度 和特异性，实现更精确的检测。
食品安全检测
食品中微生物检测
检测食品中的细菌、病毒和寄生虫等微生物，确保食品的安全性。
食品中农药残留检测
检测食品中农药残留量，控制食品中的农药污染。
食品添加剂检测
检测食品中的添加剂种类和含量，保证食品的质量和安全。
环境监测
水质监测

微生物与免疫学 实验四 酶联免疫吸附实验 ELISA(共34张PPT)

微生物与免疫学 实验四 酶联免疫吸附实验 ELISA(共34张PPT)
一 、ELISA法间接法检测血清中HBsAb 1．熟悉ELISA的原理。
洗涤液(浓缩液，用前以蒸馏水稀释25倍) （2）加样过快，孔间发生污染；
（9）血清标本未完全凝固即加入，反应孔内出现纤维蛋白凝固或残留血细胞，易出现假阳性反应等。
显色剂A、B（一般为四甲基联苯胺和H O ） Ag-Ab1 + Ab2* Ag-Ab1-Ab2*
• （6）温育时间、洗板、显色时间不一致；
（7）孔内污染杂物；
（8）酶标仪滤光片不正确；
（9）血清标本未完全凝固即加入，反应孔 内出现纤维蛋白凝固或残留血细胞，易出 现假阳性反应等。
• 3．白板
（阳性对照不显色） （1）漏加酶结合物；
（2）洗板液配制中出现问题，如量筒不干 净，含酶抑制物（如叠氮钠）等。
HBs Ag（ 本实 验测
）
+
HBe Ag
-
抗HBs（ 本实验 测）
-
+
+
-
+
+
-
+
-
-
-
-
+
-
-
-
-
-
+
抗HBe
-
+
+ -
抗HBc
结果分析
- HBV感染或无症状携带者
- 急慢性乙肝或携带者
+ “大三阳”急慢性乙肝患者（传染 性强）
+ “小三阳”急慢性乙肝感染，趋向 于恢复
+ 既往感染恢复期
+ 既往感染或“窗口期”
实验步骤
• 每4人一组，每组有检测HBsAg和检测HBsAb的 反应条各一条, 每条含6个反应孔。

elisa检测技术 ppt课件 共25页

elisa检测技术 ppt课件 共25页
优点: 1. 特异性高、准确性好； 2. 实验操作简便，用时短。
缺点: 1. 应用范围较小，生产难度大。 ——需制备各种酶标抗原或抗体。
间接法ELISA
间接法ELISA是将酶标记在二抗上，当抗体（一抗）和包被 在酶标板的抗原结合形成抗原-抗体复合物后，再以酶标二抗和 复合物结合，通过测定酶反应产物的颜色可以（间接）反映一抗 和抗原的结合情况，进而计算出抗原或抗体的量（见后图）。
洗涤3次，拍干
加底物溶液 (空孔除外)
避光 37℃, 10-30min
加终止液 (空孔除外)
加酶标抗体 (空孔除外)
上机检测、结果判定 (空孔调零)
双抗夹心法检测血清IL-2含量
设计加板次序 (空孔、阴、阳、标准)
加板 (阴、阳、标准、样)
37℃, 30min 洗涤3次, 拍干
加酶标抗体 (空孔除外)
酶标板
ELISA常用酶类
辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)
DH2+ H2O2
D + H2O
上式中，DH2为供氢体，H2O2为受氢体。
常用底物：
1. 邻苯二胺(OPD)，产物为橙红色（492nm检测）； 2. 四甲基联苯胺(TMB)，产物为蓝色，酸性条件下变为
谢谢！
xiexie!
ELISA试剂盒的组成
完整的ELISA试剂盒通常包含以下各组分： （1）已包被抗原或抗体的固相载体（俗称酶标板）； （2）酶标记的抗原或抗体（酶标记物）； （3）酶的底物； （4）参考标准品（定量试剂盒）及其稀释液； （5）酶标记物及样本的稀释液； （6）洗涤液（通常为浓缩液，用前按比例稀释）； （7）反应终止液； （8）封口膜若干、说明书一份。

酶免疫技术—酶联免疫吸附试验(免疫学检验课件)

酶免疫技术—酶联免疫吸附试验(免疫学检验课件)

（二）最适工作浓度的选择
在ELISA测定中应对包被抗原或抗体的浓度和酶标 抗原或抗体的浓度予以选择以达到最佳的测定条件以 间接法测抗体为例
1．酶标抗抗体工作浓度的选择
（1）用100ng/ml人IgG进行包被，洗涤。 （2）将酶标抗人IgG用稀释液作一系列稀释后分别加入已 包被的孔中，温育，洗涤。 （3）加底物显色。加酸终止反应后，读取吸光度（A）值 在1.0时的酶标抗体稀释度，作为酶标抗体的工作浓度。
抗原
E
E
E 底物
捕获法
EE E
E
（+）
EE
（-）
3．注意事项
采用固相捕获法检测IgM类抗体时要注意的 是RF（IgM类）及其它非特异IgM的干扰。RF （IgM类）能与固相抗人μ链抗体结合，并可与 随后加入的酶标抗体（动物IgG）反应，从而导 致假阳性反应。
非特异IgM由于其在第一步温育中， 可与特异IgM竞争与固相抗体结合，所以 会影响测定的灵敏度。因此，使用本法测 IgM，必须对临床样本进行适当稀释。
E
2．技术要点
（1）将特异性抗体包被于固相反应板上，洗涤。 （2）加待检标本,温育，洗涤。 （3）加酶标抗体，洗涤。 （4）加底物，根据颜色反应的程度进行该抗原的
定性或定量。
双抗体夹心法测抗原
EE E EE E
（+）
EE E
（-）
3．注意事项
双抗体夹心法中，应注意类风湿因子(RF) 的干扰。如果待检标本中含有RF，可能产生假 阳性结果。使用抗体的F(ab’)2或Fab片段作为酶 标抗体可消除RF的干扰。
E E
E
（+）
E EE
E EE
（-）
（2）竞争法检测HBeAb：

酶联免疫吸附测定法ppt课件

酶联免疫吸附测定法ppt课件

实验器材和药品
固相载体在ELISA测定过程中作为吸附 剂和容器。 最常用的是聚苯乙烯和聚氯乙 烯 。它们有较强的吸附蛋白质的性能，抗 体或蛋白质抗原吸附其上后仍保留原来的 免疫学活性。 微量滴定板，量滴定板为8×12的96孔 式。ELISA板的特点是可以同时进行大量标 本的检测，并可在特制的比色计上迅速读 出结果。聚苯乙烯经射线照射后，其吸附 性增加。
酶联免疫吸附测 定法
免疫学实验
基本原理 它采用抗原与抗体的特异反应将待
测物与酶连接，然后通过酶与底物产生 颜色反应，用于定量测定。测定的对象 可以是抗体也可以是抗原。
在这种测定方法中有3种必要的试剂：
①固相的抗原或抗体（免疫吸附剂） ②酶标记的抗原或抗体（标记物） ③酶作用的底物（显色剂）
实验原理 双抗体夹心法
酶反应终止液
HRP反应终止液为硫酸，一般采用2mol/L AP用NaOH终止
实验方法:

1. 加样：加一定稀释的待检样品0.1ml于已包被之反应 孔中，置37℃孵育1小时。然后洗涤。(同时做空白孔，阴 性对照孔及阳性对照孔)。 2. 加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗 体(经滴定后的稀释度)0.1ml。37℃孵育0.5～1小时，洗涤。 3. 加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的底物溶 液0.1ml，37℃10～30分钟。 4. 终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。 5. 结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果： 反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极 浅。也可测O·D值：在ELISA检测仪上，以空白对照孔调 零后测各孔O·D值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍， 即为阳性。
几种酶标分析仪
NM-9602 标配酶标分析仪

1酶联免疫吸附试验ELISA课件

1酶联免疫吸附试验ELISA课件
0.2mL
0.2mL
0.2mL
0.2mL
0.2mL
… …
… …
… …
… …
… …
… …
… …
… …
… …
摇匀，37℃，水浴15min
（1份/2人）
预期果：
1．管内液体混浊呈浅红色为不溶血，管内液体透明呈红色为溶血。
溶血
不溶血
2.
试验管
血清对照管
抗原对照管
补体对照管
SRBC对照管
？
溶血
溶血
溶血
不溶血
1.酶联免疫吸附试验（ELISA)
免疫标记技术
定义： 将抗原-抗体反应与标记技术相结合，用放射性同位素、酶或荧光素标记的已知抗体或抗原，通过检测标记物，间接测定未知的抗原或抗体。 分类： 放射免疫测定法：131I，32P 免疫荧光技术：FITC，PE 免疫酶测定法：HRP，AP
免疫酶测定法 (Enzyme ImmunoAssay,EIA)
材料：
方法：
1
2
3
4
5
试验管
血清 对照管
抗原 对照管
补体 对照管
SRBC 对照管
待测血清
0.2mL
0.2mL
0.2mL
0.2mL
0.2mL
0.2mL
0.2mL
0.2mL
0.2mL
0.2mL
0.4mL
0.8mL
抗原
补体
N.S
摇匀，37℃，水浴15min
溶血素
SRBC
0.2mL
0.2mL
0.2mL
0.2mL
酶联免疫吸附试验 (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay,ELISA)

酶联免疫吸附实验ppt课件

作纵坐标，以平滑线连接各标准品的坐标点。通 过标本的OD值可在标准曲线上查出其浓度。 3、若标本OD值高于标准曲线上限，应适当稀释后 重测，计算浓度时应乘以稀释倍数。 4、试剂盒灵敏度：最小可测人TNF-a达4pg/ml。
19
20
第四.五部分: 注意事项(1)
1、手工洗板时，甩尽孔内液体，每孔加洗涤 液350μl，静止30秒后甩尽液体，在厚迭吸 水纸上拍干，洗4次。
23
工作液 100ul/孔，封住板孔， 37℃孵育60分钟。
16
第四.三部分: 实验方法和步骤
9、洗板4次。 10 、除空白孔外，加入1：100稀释的酶结合
工作液(100 ul/孔).封住板孔, 37℃孵育30分 钟. 11 、洗板4次. 12、各孔加入显色剂100 ul/孔,避光37℃孵育 10-20分钟。 13、各孔加入终止液100ul/孔,混匀后即刻测 A450值(5分钟内)。15ຫໍສະໝຸດ 第四.三部分: 实验方法和步骤
5、从密封袋中取出所需板条，其它板条密封放回 4℃
6、除空白孔外，分别将不同浓度标准品/标本100ul/ 孔加入板条的相应孔中，标准品和标本应作双复 孔或三复孔。用封板胶纸封住反应孔，37℃孵育 90分钟。
7、洗板4次。 8、除空白孔外，加入1:100稀释的生物素化抗体(2a)
• 2、将浓缩洗涤液（4）用双蒸水稀释(1:20)。未 用完的放回4℃。
• 3、标准品:以标准品/标本稀释液(1b)1.0ml复溶冻 干标准品(1a), 静置15分钟后混匀，按说明稀释至 所需浓度，再进行倍比稀释至所需浓度。未用完 的复溶标准品放入-20℃保存, 稀释的标准品不应 重复使用。
• 4、可根据实际情况，将标本做适当倍数稀释(可 做预实验，以确定稀释倍数)。

酶联免疫吸附试验ppt课件


显色原理
DH2 + H2O2
HRP
D
+
2H2O
（底物）
常用的供氢体： 邻苯二胺 OPD 四甲基联苯胺 TMB ABTS
OPD（邻苯二胺）

OPD氧化后的产物呈明黄色，用酸终止酶反应 后，由橙红色转向棕黄色，在492nm处有最高
吸收峰，灵敏度高，比色方便，是HRP结合物
最常用的底物。


封闭液 6ml 洗液(PBS-Tween20) 1瓶 样品稀释液(PBS) 4.5ml 兔血清 (已包被) 酶标抗体(HRP-Ab) 1.5ml 底物 4.5ml 终止液(H2SO4) 2ml
酶标板(已包被) 1块 锡 纸 1张 200l pipette 1把 Tip 若干 试管 7支 1ml吸管(配胶帽) 1支 培养箱43℃ 1台/室 吸水纸 若干 记号笔 1支

TMB有无致癌性等优点，因此在ELISA中应用日趋广泛。
注意事项
1.
加样时应将液体加在孔底，避免加在孔壁上部，避免出 现气泡。 加样器头不能混用，尤其是吸酶和底物时，一定要换加 样器头。 底物应现用现配。
2.
3.
4.
5.
空白对照孔与阴性对照孔不加酶标抗体。
加样时注意酶标板的方向。
免疫标记技术的分类、原理及应用
空隙，从而防止非特异性吸附，影响结果
的准确性。如图：
封 闭 的 作 用
Coating
Blocking E
E
E
E
E
E
E
E
After blocking
Without blocking
最常用的封闭剂：
0.5%-1%的牛血清白蛋白（BSA） 10%的小牛血清 1%明胶

ELISA的原理PPT课件


洗涤
洗涤在ELISA过程中虽不是一个反应步骤，但却也决定着实验 的成败。
ELSIA洗涤：达到分离游离的和结合的酶标记物的目的。 清除残留在板孔中游离的物质，以及非特异性地吸附的干扰物 质。聚苯乙烯等塑料对蛋白质的吸附是普遍性的，而在洗涤时又应把这种
非特异性吸附的干扰物质洗涤下来。
可以说在ELISA操作中，洗涤是最主要的关键技术。
酶联免疫吸附试验
(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay,ELISA)
1.定义 2.分类
用酶标记抗原或抗体检测液体（血液、细胞液） 中未知抗体或抗原的方法。
➢ 间接法（Indirect ELISA）：
• 将已知抗原吸附于固相载体，酶标记二抗 • 检测液相中未知抗体
➢ 双抗体夹心法（Sandwich ELISA)：
Please Criticize And Guide The Shortcomings
讲师：XXXXXX XX年XX月XX日
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体）按不同的步骤与固相载体表面的抗原（或抗体） 起反应。
④用洗涤的方法去除未结合的酶标抗原（或抗体），最 后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成 一定的比例。
⑤加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物。 ⑥产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据
颜色反应的深浅来定性或定量分析。
免疫标记
显色
HRP的底物
DH2+ H2O2 E D+ 2H2O
上式中， DH2为供氢体， H2O2为受氢体。
DH2一般为无色化合物，经酶作用后成为有色的产物。 DH2如：邻苯二胺(OPD)、四甲基联苯胺(TMB)和ABTS 。

酶联免疫吸附试验(ELISA)PPT课件


6. 酶反应终止液 常用的HRP反应终止液为硫酸，其浓
度按加量及比色液的最终体积而异，在板 式ELISAБайду номын сангаас一般采用2mol/L。
7.参考标准品 定量测定的ELISA试剂盒应含有制作
标准曲线用的参考标准品，应包括覆盖可 检测范围的4-5个浓度，一般均配入含蛋 白保护剂及防腐剂的缓冲液中。
ELISA测定方法
前两种方法主要用于测定抗体和大分子 抗原，适用于临床诊断上，而竞争法事测 定小分子抗原的方法，因而尤其适用于食 品分析。
ELIZA 方法图示
间接法
“Indirect” ELISA
1.The steps of "indirect" ELISA follows the mechanism below: A buffered solution of the protein antigen to be tested for is added to each well of a microtiter plate, where it is given time to
5. 洗涤液 洗涤液多为含非离子型洗涤剂的中性
缓冲液。聚苯乙烯载体与蛋白质的结合是 疏水性的，非离子型洗涤剂既含疏水基团 ，也含亲水基团，其疏水基团与蛋白质的 疏水基团借疏水键结合，从而削弱蛋白质 与固相载体的结合，并借助于亲水基团和 水分子的结合作用，使蛋白质回复到水溶 液状态，从而脱离固相载体。洗涤液中的 非离子型洗涤剂一般是吐温20，其浓度可 在0.05%-0.2%之间，高于0.2%时，可使 包被在固相上的抗原或抗体解吸附而减低 试验的灵敏度。
ELISA属于标记免疫学技术的一种，1971 年由荷兰和瑞典的学者提出，由于其操作过 程简单易行并可以定量，从而使其在食品安 全和卫生检测中得到了广泛的应用。目前市 场上有多种基于ELISA方法开发的用于食品 中抗生素检测的试剂盒产品。
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7、 酶标二抗：稀释HRP标记羊抗猪IgG，每孔100µL， 37℃作用30min； 8、洗涤； 9、显色：加新鲜配制的TMB底物液每孔100µL，室温 避光作用15min； 10、加终止液：加50µL 2mol/L硫酸； 11、读数：用酶标仪检测OD450值。
ELISA的优点：
血清学方法有很多种, 如传统的琼脂扩散( A G ID ) 、 血 凝抑制( H A / H I ) 、 乳胶凝集、 试管凝集、补体结合 等方法，但这些方法不是最合适的检测方法。EILSA技 术与其有着不同的特点： 1、灵敏度高。ELI SA是通过酶促反应放大检测信号, 从 而提高检测的灵敏度, 其检测限可达 ng 甚至pg 水平, 可 做定量测定。 2、特异性强。ELI SA的每一步体的特异性识别过程, 结 构类似物、 有色物质、 荧光物质等对检测的影响很小。 3、样品的预处理过程和 ELI SA的操作步骤简单快捷， 有的试剂盒仅需1~2个小时即可得出检测结果，并且可同 时检测数十甚至上百个样品。 4、设备简单，适用于基层。
ELISA的应用
ELISA法是免疫诊断中的一项新技术，现已成功地应用 于多种病原微生物所引起的传染病、寄生虫病及非传染病 等方面的免疫诊断。也已应用于大分子抗原和小分子抗原 的定量测定，根据已经使用的结果，认为ELISA法具有灵 敏、特异、简单、快速、稳定及易于自动化操作等特点。 不仅适用于临床标本的检查，而且由于一天之内可以检查 几百甚至上千份标本,因此，也适合于血清流行病学调查。 本法不仅可以用来测定抗体，而且也可用于测定体液中的 循环抗原，所以也是一种早期诊断的良好方法。因此 ELISA法在生物医学各领域的应用范围日益扩大。
+ 固相抗体 标本
+ 酶标抗体
+ 底物
显色
二、间接法测抗体
间接法是检测抗体最常用的方法。操作步骤如下： 1.将抗原包被在固相载体上。 2.如样品中含有抗体，则结合为抗原抗体复合物。 3.再加入酶标记抗抗体，则结合为抗原-抗体-酶标记抗抗体
复合物。 4.酶催化底物并显色。
+ 固相抗原 标本
+ 酶标抗体
为酶标记抗原-抗体复合物。
4.酶催化底物并显色。
参
酶标抗原
考 管
YYY +
YYY +
YYY
待
酶标抗原
测 管
YYY +
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱYYY +
YYY
抗原
间接ELISA方法的建立
1、抗原最佳包被液的选择； 2、抗原、血清和酶标二抗工作浓度的确定； 3、封闭液的选择； 4、封闭时间的优化； 5、血清稀释液的选择； 6、抗原抗体反应时间的优化。
+ 底物
显色
三、酶标抗原竞争法
竞争法可用于测定抗原，也可用于测定抗体。以测定抗原为例，受检抗原
和酶标抗原竞争与固相抗体结合，因此结合于固相的酶标抗原量与受检抗
原的量呈反比。
1.将抗体包被在固相载体上。
2.如样品中含有抗原，则优先竞争结合抗体，结合为抗原抗体复合物。
3.同时加入酶标记抗原，抗原没有结合的位点酶标记抗原去占据，则结合
酶联免疫吸附试验
（Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)
ELISA的基本原理
①使抗原或抗体结合固相载体表面，并保持活性。 ②使抗体或抗原与某种酶连接成酶标抗体或抗原。 ③在测定时，把受检抗体（或抗原）和酶标抗原（或抗体）按
不同的步骤与固相载体表面的抗原（或抗体）起反应。
ELISA操作步骤
以间接ELISA为例： 1、包被抗原:用包被液将抗原稀释至合适浓度，加入到
酶标板中，每孔100µl，4℃过夜； 2、洗涤:弃去孔内液体，用洗涤液洗3次，每次 3min，
最后用吸水纸拍干；
3、封闭：各孔加入封闭液200ul，37℃作用1h； 4、洗涤； 5、加被检血清：将血清样品稀释至最佳浓度，每 孔100µL，每个样本两孔，每块板同时设阴性、阳 性及空白对照各两孔，37℃作用30min； 6、洗涤；
（1）固相的抗原或抗体， （2）酶标记的抗原或抗体， （3）酶作用的底物。 根据试剂的来源和标本的性状以及检测的具备条件，可设
计出各种不同类型的检测方法。
一、双抗体夹心法
双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法，操作步骤如下： 1.将抗体包被在固相载体上。 2.如样品中含有抗原，则结合为抗原抗体复合物。 3.再加入酶标记抗体，则结合为抗体-抗原-酶标记抗体复合物。 4.酶催化底物并显色。
④用洗涤的方法去除未结合的酶标抗原（或抗体）， 最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量 成一定的比例。 ⑤加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物。 ⑥产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根 据颜色反应的深浅来定性或定量分析。
ELISA的类型
ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定 方法中有三个必要的试剂：