蛋白质免疫印迹技术及常见问题

免疫印迹实验注意事项一、实验概述免疫印迹（Western blot）是一种重要的蛋白质检测技术，在生物医学研究中被广泛应用。

该实验通过将蛋白质样品经电泳分离，并将其转移到膜上，最终使用特异性抗体探测目标蛋白质。

然而，为了确保实验结果的准确性和可靠性，实验过程中需要注意以下事项。

二、实验仪器和试剂准备在进行免疫印迹实验之前，需要准备合适的仪器和试剂。

以下是一些注意事项：1. 仪器准备•确保电泳仪、转印仪和成像仪等仪器的功能正常，并进行必要的校准和测试。

•清洁仪器，避免污染和干扰实验结果。

2. 试剂准备•使用优质的试剂，并根据说明书正确配制试剂溶液。

•为避免批次差异，建议每次实验使用同一批试剂。

•试剂保存在适当的温度和条件下，以保证其稳定性。

3. 溶液准备•使用无菌、纯净的水和试剂配制实验所需的溶液。

•确保溶液的 pH 值正确，并进行必要的调整。

•溶液保存在适当的温度和条件下，避免污染和变质。

三、实验操作注意事项在进行免疫印迹实验时，需要注意以下操作事项：1. 样品处理•样品的制备和处理应严格按照实验要求进行，以确保样品的完整性和稳定性。

•样品处理过程中应尽量避免使用可能影响蛋白质结构和功能的试剂和条件。

2. 蛋白质的电泳分离•样品电泳前，必须对电泳胶进行适当的处理和准备，确保其质量和性能。

•样品电泳条件的选择要考虑样品性质和目标蛋白质的分子量等因素。

•电泳过程中，要严格控制电流和电压，避免产生异常结果。

3. 转膜过程•使用合适的滤纸和膜材料，并按照正确的方法和条件进行转膜操作。

•转膜时间和电压的选择要根据蛋白质的分子量和转膜效率进行调整。

4. 抗体探测和成像•使用具有较高亲和力和特异性的抗体进行探测，以提高结果的准确性和可靠性。

•抗体的浓度和反应时间应根据需要进行调整，避免产生过度或不足的信号。

•成像过程中，要确保暗室环境的光线充足、胶片或成像仪的参数设置正确。

5. 数据分析和结果解读•在进行数据分析和结果解读时，应使用合适的软件和方法，确保结果的准确性和可靠性。

蛋白质电泳与western blot1Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。

对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。

该文主要通过以下几个方面来详细地介绍一下Western Blot技术。

（1）原理（2）分类①放射自显影②底物化学发光ECL ③底物荧光ECF ④底物DAB呈色（3）主要试剂（4）主要程序（5）实验常见的问题指南 1. 参考书推荐 2. 针对样品的常见问题 3. 抗体 4. 滤纸、胶和膜的问题 5. Marker 的相关疑问 6. 染色的选择7. 参照的疑问8. 缓冲液配方的常见问题 9. 条件的摸索10. 方法的介绍 11. 结果分析（1）原理：与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。

经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。

以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。

该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。

（2）分类①放射自显影②底物化学发光ECL ③底物荧光ECF ④底物DAB呈色现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色，体同水平和实验条件的是用第一种方法，目前发表文章通常是用底物化学发光ECL。

只要买现成的试剂盒就行，操作也比较简单，原理如下（二抗用HRP标记）：反应底物为过氧化物+鲁米诺，如遇到HRP，即发光，可使胶片曝光，就可洗出条带。

（3）主要试剂1、(以利于溶解双丙稀酰胺)的去离子水配制含有29%(w/v)丙稀酰胺和1%(w/v)N，N’-亚甲双丙烯酰胺储存液丙稀酰胺29g，N，N-亚甲叉双丙稀酰胺1g，加H2O至100ml。

蛋白质免疫印迹（Western Blot ）实验步骤和原理及注意事项1.收集蛋白样品(Protein sample preparation)可以使用适当的裂解液。

收集完蛋白样品后，为确保每个蛋白样品的上样量一致，需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。

根据所使用的裂解液的不同，需要采用适当的蛋白浓度测定方法。

因为不同的蛋白浓度测定方法对于一些去垢剂和还原剂等的兼容性差别很大。

BCA法。

2. 电泳(Electrophoresis)(1) SDS-PAGE凝胶配制(2) 样品处理在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。

例如2X或5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。

使用5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以减小上样体积，在相同体积的上样孔内可以上样更多的蛋白样品。

100℃或沸水浴加热3-5分钟，以充分变性蛋白（根据蛋白分子的大小，煮沸时间可适当变化，一般不低于5min。

煮沸只是变性蛋白，而不是分解，一般加了抑制酶不会分解。

煮沸对于SDS-PAGE凝胶电泳是必须的，只有煮沸,才能消除蛋白质的立体二级结构,伸展为一维线性结构,所以一般来讲二聚体都会解体,才能完全按照分子量跑电泳,加的蛋白Marker才有指示分子量的意义。

蛋白样品变性后与SDS充分结合，SDS使每个氨基酸带相同的电荷,使整个蛋白呈线性结构. 抗体因为要是线性表位结合的，100度煮10min 后13000,离心5分钟,取上清电泳,因为沉淀会导致拖尾.也可以取上清到另一管,4度可以放一周备再次电泳）。

(3)电泳i.清洗玻璃板：一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。

两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干。

ii.灌胶与上样（1）玻璃板对齐后放入夹中卡紧。

然后垂直卡在架子上准备灌胶。

（操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶。

）（2）配10%分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。

灌胶时，可用10 ml枪吸取5 ml胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带中间线高度时即可。

常见问题分析一.无信号一抗和二抗不匹配：二抗需和一抗宿主的物种相同（如一抗来自兔，二抗为抗兔抗体）。

没有足够的一抗或二抗结合目标蛋白：使用高浓度抗体。

4 °C 延长孵育时间（如过夜）。

封闭剂与一抗或二抗有交叉反应：使用温和的去污剂如吐温-20，或更换封闭剂（常用的脱脂奶粉、BSA、血清或明胶）。

一抗不识别待检物种的蛋白：参照说明书，比对免疫原序列和蛋白序列以确保抗体和目的蛋白会发生反应，设置阳性对照。

蛋白上样量不足：每条泳道蛋白上样量不低于20μg，使用蛋白酶抑制剂并设置阳性对照。

组织中目的蛋白含量低：浓缩使信号最大化。

转膜不充分：使用可逆染色剂如丽春红检测转膜效果，检查转膜操作是否正确。

PVDF 膜需预先浸在甲醇中，然后浸到转移缓冲液中。

洗膜过度：勿过度洗膜。

过度封闭使目标蛋白不能显色：使用0.5% 奶粉或无奶粉代替5% 奶粉的抗体稀释液，或更换封闭剂，减少封闭时间。

一抗失效：使用新鲜抗体，重复使用有效浓度会降低。

二抗受叠氮钠抑制：避免叠氮钠和HRP 标记抗体一起使用。

检测试剂盒过期和底物失活：使用新鲜的底物。

二．背景高未进行非特异性封闭或封闭不充分：延长封闭时间，考虑更换合适的封闭剂。

一抗浓度过高：稀释抗体至合适浓度，以更高稀释度抗体延长孵育时间（耗时长但特异性结合最好）。

二抗与封闭剂非特异性结合或反应：设置二抗对照（不加一抗）。

未结合蛋白质洗涤不充分：增加洗涤次数。

选膜不当产生的高背景：硝酸纤维素膜比PVDF 膜背景低。

膜干燥：在孵育过程中防止膜变干，每一步都要保证膜有充分的反应液，可放入搅拌子不断搅动或轻轻振荡使膜浸在溶液里。

三．多带现象细胞传代次数过多，蛋白表达不同：使用原始未传代的细胞株，和现在的细胞株一起做平行对照实验。

体内表达的蛋白样本具有多种修饰形式如乙酰化、甲基化、烷基化、磷酸化、糖基化等：参考文献，使用试剂使样品去磷酸化、去糖基化来证明翻译后的修饰。

蛋白样本降解（蛋白质分子量降低）：在样品缓冲液中加入足够的蛋白酶抑制剂。

WesternBlot蛋白免疫印迹原理及常见问题（FAQ）1. Western blot结果中的背景为什么较高?可能的原因及建议1.膜封闭不够——延长封闭的时间；选择更加适合的封闭液。

2.一抗稀释度不适宜——对抗体进行滴度测试，选择最适宜的抗体稀释度。

3.一抗孵育的温度偏高——建议4℃结合过夜。

4.膜在实验过程中干过——实验过程中要注意保持膜的湿润。

5.检测时曝光时间过长——减少曝光时间。

2. Western blot结果中杂带较多可能的原因及建议1.目的蛋白有多个修饰位点（磷酸化位点、糖基化位点、乙酰化位点等），本身可以呈现多条带。

2.查阅文献或进行生物信息学分析，获得蛋白序列的修饰位点信息，通过去修饰确定蛋白实际大小。

3.目的蛋白有其它剪切本——查阅文献或生物信息学分析可能性。

4.样本处理过程中目的蛋白发生降解——加入蛋白酶抑制剂；样本处理时在冰上操作。

5.上样量过高，太敏感——适当减少上样量。

6.一抗特异性不高——重新选择或制备高特异性的抗体。

7.一抗不纯——纯化抗体8.一抗或者二抗浓度偏高——降低抗体浓度。

3. Western blot结果中无信号或显示信号弱可能的原因及建议1.检测样本不表达目的蛋白——选择表达量高的细胞作为阳性对照，用于确定检测样本是否为阴性。

2.检测样本低表达目的蛋白——提高上样量，裂解液中注意加入蛋白酶抑制剂。

3.转移不完全或过转移——可以用丽春红染膜并结合染胶（考马斯亮蓝）后确定条带是否转至膜上或转移过头；适当调整转膜的时间和电流。

4.抗体不能识别测试种属的相关蛋白——购买抗体前应当认真阅读抗体说明书，确定其是否能够交叉识别测试种属的对应蛋白。

5.一抗孵育时间不足——建议4℃结合过夜。

6.二抗与一抗不匹配——选择针对一抗来源的种属的抗体。

7.洗膜过度——洗膜时间不宜过长，加入的去垢剂不宜过强或过多，建议使用0.1%的弱去垢剂Tween-20。

4. 其它现象：1.膜上多处出现黑点或黑斑——抗体与封闭试剂发生非特异性的结合。

【干货收藏贴】WB常见问题精品全集锦做了很久的WB（western blot），走了很多弯路，但是WB想要做好并不难，总结WB实验中可能会遇到的问题，分析可能的原因及对应的解决方案，这就是实验成功的基石。

以下，我们先解决很多技术菌的疑惑，然后再着手汇总实验中常见问题和可能原因分析以及给出建议解决方案。

WB常见问题分析1.为什么我的细胞提取液中没有检测到目的蛋白？原因有很多：a) 细胞中不表达这种蛋白质，换一种细胞；b) 细胞中的蛋白质被降解掉了，可加入蛋白酶抑制剂，抑制蛋白酶活性；c) 抗体不能识别目标蛋白，多看看说明，是否有问题；d) 酶降解可能是没有保持低温操作，样品保存不当，样品放置时间过长。

2.我做的蛋白质分子量很小（10KDa），请问怎么做WB？a)可以选择PSQ 膜，同时缩短转移时间。

也可以将两张膜叠在一起，再转移。

其他按步骤即可；b)也可选择孔径0.22um的PVDF膜或者NC膜，转膜时间缩短，另外可采用Tricine-SDS-PAGE体系。

3.我的目的带很弱，如何加强？a)可以加大抗原上样量，这是最主要的；b)也可以将一抗稀释比例降低；c)还可以延长曝光时间。

4.DAB好还是ECL好？DAB 有毒，但是比较灵敏，是HRP 最敏感的底物；ECL结果容易控制，但被催化时灵敏度差一点，但如果达到阀值，就特别灵敏，可以检测pg级抗原。

5.胶片是一片空白，是怎么回事？如果能够排除下面的几个问题那么问题多半出现在一抗和抗原制备上。

a) 二抗的HRP 活性太强，将底物消耗光；b) ECM底物中H2O2，不稳定，失活；c) ECL底物没覆盖到相应位置；d) 一抗选择不当二抗失活；e) 二抗失活。

6.磷酸化抗体的检测样本制备时是否一定要加NaF等？NaF是一种广谱磷酸化酶的抑制剂，一般最好加。

但是不加也可以，大部分时候是不用加的。

7.细胞水平要做WB，多少细胞提的蛋白够做WB？一般5×106就足够。

Western Blot（蛋白质印迹）技术是生物医学研究中常用的蛋白质分析技术之一，可以用于检测蛋白质样品中的特定抗原。

然而，在进行Western Blot实验时，可能会遇到一些问题，下面列举了一些常见问题及解决方法：1.电泳条带不清晰或无条带：解决方法：•检查样品质量，确保待检测样品是可用的，无降解或污染。

•调整电泳参数，如电压、电流和时间等，以优化电泳效果。

•更换抗体，确认抗体的特异性，避免非特异性结合。

2.膜上背景过重：解决方法：•在抗体孵育之前，使用封闭剂封闭膜上的非特异性位点，减少抗体非特异性结合。

•减少一抗和二抗的浓度，减轻非特异性结合。

•增加洗涤次数和时间，以清除未结合的抗体和蛋白质。

3.目的蛋白信号弱或无：解决方法：•调整一抗和二抗的浓度，提高特异性结合的信号强度。

•选择更灵敏的显色方法，如化学发光法等。

•在转膜前，优化样品处理，如提取、纯化和浓缩等步骤。

4.非特异性条带：解决方法：•检查抗体特异性，确认抗体的特异性，更换抗体以减少非特异性结合。

•检查样品处理步骤，避免样品中的杂蛋白干扰。

•增加洗涤次数和时间，以清除未结合的抗体和非特异性结合的蛋白质。

5.显影后膜上条带处变为黄色或白色：解决方法：•可能是由于曝光时间过长或显影液浓度过高导致的，可以降低曝光时间和减少显影液浓度来解决问题。

•在膜清洗时使用甲醇或乙醇等有机溶剂，清除膜上的多余抗体和显色剂。

6.条带内无显影的白点：解决方法：•在转膜前检查是否存在气泡，气泡会影响转膜效果和条带形成。

•增加转膜时间和电流，以促进蛋白质的转移。

•检查显影液是否过期或存在质量问题。

7.存在散在小圆斑：解决方法：•这可能是由于封闭液中的杂质颗粒导致的，可以通过过滤封闭液来清除杂质。

•检查一抗和二抗是否含有杂质抗体或存在抗体污染的情况，更换抗体可以解决问题。

•检查显色液是否存在问题，如过期或存在杂质等，更换显色液可以解决问题。

8.条带变形或不均匀：解决方法：•检查电泳胶的质量和制备过程是否存在问题。

蛋白质免疫印迹（WesternBlot，WB）实验方法原理步骤及注意事项实验方法原理Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测的方法。

对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。

与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。

经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。

以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。

该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。

实验材料蛋白质样品试剂、试剂盒丙烯酰胺SDS Tris-HClβ-巯基乙醇ddH2O甘氨酸Tris甲醇PBSNaClKClNa2HPO4KH2PO4ddH2O考马斯亮兰乙酸脱脂奶粉硫酸镍胺H2O2DAB试剂盒仪器、耗材电泳仪电泳槽离心机离心管硝酸纤维素膜匀浆器剪刀移液枪刮棒实验步骤一、试剂准备1. SDS-PAGE试剂：见聚丙烯酰胺凝胶电泳实验。

2. 匀浆缓冲液：1.0 M Tris-HCl(pH 6.8) 1.0 ml；10%SDS 6.0ml；β-巯基乙醇 0.2 ml；ddH2O 2.8 ml。

3. 转膜缓冲液：甘氨酸 2.9 g；Tris 5.8 g；SDS 0.37 g；甲醇200 ml；加ddH2O定容至1000 ml。

4. 0.01 M PBS(pH7.4)：NaCl 8.0 g；KCl 0.2 g；Na2HPO41.44g；KH2PO40.24 g；加ddH2O至1000 ml。

5. 膜染色液：考马斯亮兰0.2 g；甲醇80 ml；乙酸 2 ml；ddH2O118 ml。

蛋白免疫印迹实验注意事项
1.标记探针：应选择适当的标记方式，例如荧光标记或酶标记，以确保检测结果的准确性和可靠性。

2.样品制备：应根据实验目的和特点制备样品，取样时遵循标准化程序，例如选择适当的组织，确定样品的种类和数量等。

3.准备蛋白样品：可使用常规离心和浮渣等方法来纯化蛋白质样品。

同时，应使用合适的分离条件，例如SDS-PAGE分离等方法。

4.电泳条件：在进行SDS-PAGE分离时应注意电泳条件、电泳时间和电极的电位等参数。

这些参数应经过适当的优化，以确保蛋白质分离的完整性和稳定性。

5.膜修饰：在进行印迹前，应对PVDF或NC膜进行预处理，以提高其亲水性和蛋白吸附性能，例如使用甲醇或乙醇水溶液进行湿润处理。

6.印迹条件：印迹条件应根据探针和样品的特性进行优化，例如印迹的温度、时间和探针浓度等。

在印迹后，应及时清洗膜以去除多余的标记物。

7.数据分析：印迹结果应准确地获取并进行合理的解释和分析，注意4°C或-20°C保存条件。

8.良好的实验室卫生：应保证实验室的卫生和环境良好，以避免外源性影响实验结果。

同时，应加强实验室安全意识，严格按照实验安全规范进行操作。