蛋白质免疫印迹技术

蛋⽩质印迹法（免疫印迹试验，WesternBlot）蛋⽩质印迹法（免疫印迹试验）即 Western Blot。

它是分⼦⽣物学、⽣物化学和免疫遗传学中常⽤的⼀种实验⽅法。

其基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或⽣物组织样品进⾏着⾊。

通过分析着⾊的位置和着⾊深度获得特定蛋⽩质在所分析的细胞或组织中表达情况的信息。

蛋⽩免疫印迹（Western Blot）是将电泳分离后的细胞或组织中蛋⽩质从凝胶转移到固相⽀持物NC膜或PVDF膜上，然后⽤特异性抗体检测某特定抗原的⼀种蛋⽩质检测技术，现已⼴泛应⽤于基因在蛋⽩⽔平的表达研究、抗体活性检测和疾病早期诊断等多个⽅⾯。

⼀提起Western blot，⼤家会不禁联想到Southern blot和Northern blot。

其实它们的名字也是个有趣的故事。

1975年，Edwin Southern教授发明了DNA杂交检测技术，故命名为Southern blot。

之后，James Alwine、David Kemp和George Stark三位教授⼜发明了RNA杂交检测技术，因与Southern blot相似，故命名为Northern。

George Stark这位⽜⼈教授在两年后⼜开发出类似的蛋⽩质检测⽅法。

1981年，Neal Burnette将其命名为Western blot。

为什么当时没叫Eastern blot呢？这⽆从考证，不过科学家们还真是挺有创意的。

30年来， Western blot技术已成为蛋⽩质研究中最常⽤的⼯具。

它的标准流程如下：蛋⽩质⾸先通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，再通过电泳转移到固相⽀持物上，固相⽀持物包括硝酸纤维素膜、PVDF膜和尼龙膜。

⾸先将膜上未反应的位点封闭起来，以抑制抗体的⾮特异性吸附，这样固定的蛋⽩质即可与特异性的多克隆或单克隆抗体相互作⽤。

最后通过放射、⽣⾊或化学发光的⽅法进⾏定位。

Western Blot原理与Northern Blot、Southern blot类似。

immunoblotting免疫印迹法免疫印迹法（Immunoblotting）免疫印迹法是一种常用的实验技术，用于检测和分析蛋白质的存在与表达水平。

它结合了免疫学和电泳技术，能够帮助研究者确定特定蛋白质的分子量、定量和免疫反应性。

本文将对免疫印迹法的原理、操作流程和应用范围进行探讨。

一、免疫印迹法的原理免疫印迹法的原理基于抗原抗体反应。

首先，待检样品经过电泳分离，然后将蛋白质从凝胶转移到聚丙烯酰胺膜上。

接着，利用一系列步骤将目标蛋白质与特异性的一抗和二抗结合，形成特异性的免疫复合物。

最后，通过酶促发色反应，将免疫复合物标记出来，产生相应的信号。

二、免疫印迹法的操作流程1. 样品制备：待检样品应首先经过蛋白提取、浓缩和纯化处理，以保证分析的准确性。

其中关键的步骤是蛋白质的电泳分离，常用的方法有SDS-PAGE和聚丙烯酰胺凝胶电泳。

2. 转印：将分离的蛋白质从凝胶转移到聚丙烯酰胺膜上，常用的方法有湿式和半湿式转印。

湿式转印适用于小分子量蛋白质，而半湿式转印适用于大分子量蛋白质。

3. 阻断：将转印膜放入含有蛋白质的阻断缓冲液中，防止非特异性结合。

通常使用的阻断缓冲液有牛奶粉、鸡蛋清或BSA。

4. 孵育：将特异性一抗加入阻断缓冲液中，与目标蛋白质发生特异性结合。

一抗的选择应该根据具体的研究目的来确定。

5. 洗涤：将转印膜反复洗涤以去除非特异性结合的抗体和杂质。

洗涤缓冲液的选择应该根据一抗的种类来确定。

6. 结合：加入特异性的二抗，与一抗结合形成免疫复合物。

二抗通常是由小鼠或兔子制备的抗小鼠或反兔子的抗体。

7. 洗涤：再次洗涤以去除未结合的二抗和杂质。

8. 检测：利用酶标技术将免疫复合物标记出来。

常用的酶标方法有辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶。

酶标反应产生的信号可以使用荧光、发光或显色来检测。

9. 分析：通过分析免疫印迹结果，可以确定目标蛋白质的存在与表达水平。

常用的分析方法有荧光成像、蛋白质印迹仪和密度分析软件。

免疫印迹（immunoblotting）免疫印迹（immunoblotting）又称蛋白质印迹（Western blotting），是根据抗原抗体的特异性结合检测复杂样品中的某种蛋白的方法。

该法是在凝胶电泳和固相免疫测定技术基础上发展起来的一种新的免疫生化技术。

由于免疫印迹具有SDS-PAGE 的高分辨力和固相免疫测定的高特异性和敏感性，现已成为蛋白分析的一种常规技术。

免疫印迹常用于鉴定某种蛋白，并能对蛋白进行定性和半定量分析。

主要实验步骤如下：1.蛋白质抽提a．实验对象为组织样品，取适量（250～500mg）新鲜组织样品或正确保存的组织样品，加1ml含蛋白酶抑制剂的总蛋白抽提试剂（或核蛋白抽提试剂），匀浆后抽提总蛋白（或核蛋白）。

b.实验对象为细胞样品，每份样品取1×106～1×107细胞，PBS清洗细胞，去PBS加0.1ml～1ml含蛋白酶抑制剂的总蛋白抽提试剂（或核蛋白抽提试剂）抽提总蛋白（或核蛋白）。

2.蛋白质定量：按KCTMBCA蛋白质定量试剂盒操作说明操作，测定样品浓度。

3.变性聚丙烯酰胺不连续凝胶电泳(SDS-PAGE)将准备好的样品液和生物素标记的蛋白质分子量标准分别上样，标准加进第一个孔中，电泳分离蛋白。

4.蛋白质转移到硝酸纤维膜或PVDF膜按Bio-Rad蛋白转移装置说明组装滤纸凝胶纤维素夹层，30mA恒流条件下，4°C转移过夜。

5.膜的封闭和抗体孵育a．膜在5％BSA溶液中室温孵育1小时以封闭膜上的非特异结合。

b.封闭过的膜加入一级抗体室温孵育1.5小时，抗原抗体结合。

c.加入HRP标记的二级抗体以结合一级抗体及HRP标记的抗生物素抗体以结合分子量标准，室温孵育膜1小时。

加入HRP标记的GAPDH抗体可同时检测GAPDH含量。

6.结果检测：化学发光法检测，膜与化学发光底物孵育，经X胶片曝光显影。

图片扫描保存为电脑文件，并用ImageJ分析软件将图片上每个特异条带灰度值的数字化。

蛋白质免疫印迹（Western Blot ）实验步骤和原理及注意事项1.收集蛋白样品(Protein sample preparation)可以使用适当的裂解液。

收集完蛋白样品后，为确保每个蛋白样品的上样量一致，需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。

根据所使用的裂解液的不同，需要采用适当的蛋白浓度测定方法。

因为不同的蛋白浓度测定方法对于一些去垢剂和还原剂等的兼容性差别很大。

BCA法。

2. 电泳(Electrophoresis)(1) SDS-PAGE凝胶配制(2) 样品处理在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。

例如2X或5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。

使用5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以减小上样体积，在相同体积的上样孔内可以上样更多的蛋白样品。

100℃或沸水浴加热3-5分钟，以充分变性蛋白（根据蛋白分子的大小，煮沸时间可适当变化，一般不低于5min。

煮沸只是变性蛋白，而不是分解，一般加了抑制酶不会分解。

煮沸对于SDS-PAGE凝胶电泳是必须的，只有煮沸,才能消除蛋白质的立体二级结构,伸展为一维线性结构,所以一般来讲二聚体都会解体,才能完全按照分子量跑电泳,加的蛋白Marker才有指示分子量的意义。

蛋白样品变性后与SDS充分结合，SDS使每个氨基酸带相同的电荷,使整个蛋白呈线性结构. 抗体因为要是线性表位结合的，100度煮10min 后13000,离心5分钟,取上清电泳,因为沉淀会导致拖尾.也可以取上清到另一管,4度可以放一周备再次电泳）。

(3)电泳i.清洗玻璃板：一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。

两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干。

ii.灌胶与上样（1）玻璃板对齐后放入夹中卡紧。

然后垂直卡在架子上准备灌胶。

（操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶。

）（2）配10%分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。

灌胶时，可用10 ml枪吸取5 ml胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带中间线高度时即可。

蛋白质印迹法的应用及其技术发展随着生物技术的快速发展和应用，人们对于生物分子表达与功能研究的需求也越来越高。

而蛋白质分子作为生物体中最为基础的机能分子，其研究的重要性也愈加凸显出来。

蛋白质印迹法便是一种应用广泛、有效的手段，用于检测、鉴定和定位目标蛋白质，其在基础研究、医学诊断和药物研发等领域都发挥着重要作用。

一、蛋白质印迹法的工作原理蛋白质印迹法，又称蛋白质免疫印迹法（Western Blotting），是一种广泛应用于蛋白质分子研究中的方法。

它利用特异反应性抗体对于蛋白质分子的亲和作用，将其快速、准确、可靠地检测出来。

现代的蛋白质印迹技术主要包括以下步骤：（1）蛋白质的电泳分离：将目标蛋白标本经SDS-PAGE电泳分离成不同的蛋白质带。

（2）蛋白质的转移：将分离好的蛋白质带通过电泳转移到聚丙烯酰胺薄膜或硝酸纤维素膜上。

（3）膜上目标蛋白的检测：利用与目标蛋白质对应的一抗（Primary Antibody）与膜上相应位置的目标蛋白质发生特异性结合，去除多余抗体，然后利用与一抗对应的二抗（Secondary Antibody）介导的标记物发出染色信号，并用显微摄影的方法记录下来。

二、蛋白质印迹法的应用蛋白质印迹法是一种高度特异性、灵敏度极强的检测手段，其应用在基础研究中具有以下优点：（1）蛋白质的定量和质量鉴定：蛋白质印迹法可以通过“Western blot quantification”等算法，精确地测量样本中目标蛋白的相对含量和质量，同时可以检测出多种不同大小的蛋白。

（2）蛋白质亚细胞定位：蛋白质印迹法结合细胞学分析，可以确定目标蛋白是否定位于细胞膜、细胞核或细胞质内部，同时还能对不同的亚细胞结构进行精确定位，为深入研究细胞内基本过程提供了重要的工具。

（3）蛋白质-蛋白质相互作用：蛋白质印迹法可以通过检测蛋白质-蛋白质之间的相互作用，实现蛋白质复合物结构的解析和对分子交互作用的研究。

三、蛋白质印迹技术的发展趋势随着蛋白质印迹技术的应用范围不断扩大，传统的蛋白质印迹技术也不断创新和改进。

免疫印迹技术(Immunoblotting technique)免疫印迹技术又称蛋白质印迹(Western blotting)是一种借助抗原鉴定特异性抗体的有效方法，该法是在凝胶电泳和固相免疫测定技术基础上发展起来的一种新的免疫生化技术。

本实验以检测可提取性核抗原(ENA)抗体为例。

【实验原理】先将ENA混合抗原经SDS-PAGE电泳，使各种抗原成分根据分子量不同区分开来，再通过电转印将各种抗原成分转印到硝酸纤维素薄膜上，血清中抗ENA抗体与硝酸纤维素薄膜上的ENA抗原成分结合，再与碱性磷酸酶标记的抗人IgG抗体结合，形成抗原抗体酶标抗体复合物，洗涤后加入底物显色，根据有无显色带的出现判断抗ENA抗体的有无，显色带的位置判断抗ENA抗体的类型。

【主要试剂与器材】1.ENA多肽抗体谱检测试剂盒包括印有ENA的硝酸纤维素薄膜、碱性磷酸酶记标的抗人IgG抗体、显色液(BCIP/NBT)、浓缩洗涤液和样品缓冲液、终止液、ENA多肽抗体标准带图谱等，有商品供应。

2.待检血清和阳性质控血清3.小型摇床、恒温箱、反应槽、吸管、微量移液器、滤纸等。

【操作方法】1.将浓缩洗涤液、样品稀释液按说明书用蒸馏水进行稀释。

2.抗原条放入反应槽中，每个槽内加入样品稀释液1.5ml浸泡5min后，弃去槽内液体。

3.用样品稀释液将血清1∶10稀释，吸取1.5ml稀释血清加入槽内，置小型摇床上孵育30min。

4.弃去槽内液体，每个槽内加入1∶10稀释的洗涤液 1.5ml浸泡5min后，弃去槽内液体，用吸水纸吸干。

5.吸取1.5ml用样品稀释液1∶10稀释AP标记的抗人 IgG，加入槽内，置小型摇床上孵育30min。

6. 同4洗涤。

7.每个槽内加入底物液1.5ml，置小型摇床上孵育 20min后，弃去槽内液体，用自来水洗净，加入终止液。

8.与标准显色带比较，判断结果。

【结果判断】将印迹膜上出现的显色区带与标准图谱比较，可判断哪种ENA抗体阳性。

蛋白质免疫印迹（Western Blot，WB ）标签：western-blot免疫印迹 蛋白质蛋白质免疫印迹可应用于：（1）从蛋白质混合物中检出目标蛋白质；（2）定量或定性确定细胞或组织中蛋白质的表达情况；（3）用于蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA、蛋白质-RNA相互作用后续分析。

实验材料蛋白质样品试剂、试剂盒裂解液 PBS SDS上样缓冲液 电泳缓冲液 转移缓冲液 丽春红染液 TBST TBS 洗脱抗体缓冲液 抗体仪器、耗材电泳仪移液器脱色摇床显影仪实验方法原理Western免疫印迹，是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测的方法。

对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。

与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，探针是抗体，显色用标记的二抗。

经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。

以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。

该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。

实验步骤一、试剂准备1. SDS-PAGE试剂：见聚丙烯酰胺凝胶电泳实验。

2. 匀浆缓冲液：1.0 M Tris-HCl(pH 6.8) 1.0 ml；10%SDS 6.0 ml；β-巯基乙醇 0.2 ml；ddH2O 2.8 ml。

3. 转膜缓冲液：甘氨酸 2.9 g；Tris 5.8 g；SDS 0.37 g；甲醇200 ml；加ddH2O定容至1000 ml。

4. 0.01 M PBS(pH7.4)：NaCl 8.0 g；KCl 0.2 g；Na2HPO4 1.44 g；KH2PO40.24 g；加ddH2O至1000 ml。

蛋白质印迹技术蛋白质印迹（Western blotting）是一种检测固定在固相基质上的蛋白质的免疫化学办法，又称免疫印迹（immunoblotting )。

1979年，Towbin等将分析DNA的Southern blotting技术扩展到蛋白质的讨论领域，并且和特异、敏捷的免疫分析技术相结合，称之为“Western blotting"（蛋白质印迹）。

免疫印迹可分为两个步骤：将蛋白质由凝胶转移至固相基质上；特异性抗体检测。

试验原理蛋白质印迹法是将蛋白质混合样品经SDS-PAGE后，分别为不同的条带，其中含有能与特异性抗体相结合的待检测的蛋白质（抗原蛋白），将凝胶上的蛋白质以电转印的方式，转印至固相支持物（如硝酸纤维素膜，NC膜）上，再用特异抗体作为探针对靶蛋白举行检测的办法。

因为该办法结合了PAGE的高辨别率和固相免疫反应的高特异性等多种优点，可检测到低至1-5 ng的中等分子量大小的靶蛋白。

仪器和材料电转移装置（电源）；摇床；暗匣；转印夹；浅盘（30cm×15cm×3cm)；玻璃棒；杂交袋或杂交盒；胶片；保鲜膜；滤纸；0. 22μm孔径的硝酸纤维素膜。

试剂 (1) Running Buffer (Tris-甘氨酸电泳缓冲液，1×2500ml) ; 25 mmol/L Tris 7. 55g 250mmol/L甘氨酸 47. 0g 10%SDS 25m1 (2) Transfer Buffer ( Tris-甘氨酸电转膜缓冲液，1× 2500m1，pH＝8.3）：48 mmol/L Tris 14. 50g 39mmol/L 甘氨酸 7. 25g 10% SDS 9. 25ml 20％甲醇 500m1 (3) TTBS缓冲液（pH 7.5，2 ×2500ml)： 20 mmol/L Tris 12. l l g 0. 5 M NaCl 146. 1 g 0.05%Tween 20 2. 5 ml (4) Stripping Buffer（pH2. 0，1000m1)：甘氨酸 1. 8768 SDS 10. 0g (5) 10％牛奶封闭液：称取10. 0g脱脂奶粉，溶于80m1 TTBS（pH7.5 )中，搅拌彻低溶解，后加入TTBS定容至100m1，再加入10μl Thimerosal混匀。

蛋白质印迹法蛋白质印迹法（ProteinBlotting）是一种用于检测、调控和鉴定蛋白质水平的技术，通常也被称为蛋白质免疫印迹（Immunoblotting）、西方印迹（Western Blotting）或免疫印迹（Immunoblotting）。

它能够快速、准确、重复地测定一个新蛋白质或大量存在的蛋白质，令科学家们能够衡量蛋白质的含量以及细胞蛋白质的变化。

蛋白质印迹法包含用于分离和检测特定蛋白的一系列的步骤。

首先，蛋白质被用碱性和硫酸性溶剂分离出来，然后用紫外线伤害法进行转换，最后通过免疫印迹法测定所需的蛋白质的含量。

蛋白质印迹法的第一步是将细胞蛋白质提取出来，用特定溶剂获得有机液体，其中包含有蛋白质、糖、脂肪酸以及一些其它物质。

用碱性或硫酸性溶液将细胞蛋白质沉淀出来，然后用紫外线伤害法进行转换，将沉淀的蛋白质释放出来，使其可以测定。

接下来的步骤是用免疫印迹法测量特定蛋白质的含量。

这项技术使用对蛋白质特异性的特殊抗体，与待检测蛋白质发生作用，最后将抗体与特定蛋白质结合在一起，使得它们在一个总称为“印迹”的图像上形成可见的标记。

通过观察抗体把特定蛋白质印在“印迹”上时形成的标记，就可以测定检测蛋白质的含量。

蛋白质印迹法在研究蛋白质分子生物学、微生物学、免疫学等各个领域中都发挥着重要作用，在癌症检测中也发挥着重要作用。

通过蛋白质印迹法，研究人员可以快速、准确地测量和监测肿瘤相关的蛋白质，从而有助于癌症的早期发现，从而使得治疗更加有效。

另外，蛋白质印迹法还可以用于研究各种亚细胞定位的蛋白质，有助于科学家们更好地理解蛋白质的功能。

蛋白质印迹法在细胞生物学的研究中也有着重要的应用，它可以帮助科学家们快速、准确地测定细胞里某种蛋白质的含量，从而更好地理解细胞的结构和功能。

总的来说，蛋白质印迹法不仅是一种快速、准确的技术，而且是一种重要的技术，有助于科学家们更好地检测、调控以及鉴定蛋白质水平。

随着科学技术的发展，蛋白质印迹法在治疗和疾病诊断方面也会起到越来越重要的作用。

免疫印迹检测方法
免疫印迹检测方法，又称蛋白质印迹或Western Blotting，是一种利用抗
原抗体的特异性结合检测复杂样品中的某种蛋白的方法。

以下是其基本步骤：
1. 取样：取上清液作为样品。

2. 电泳：制备电泳凝胶，进行SDS-PAGE。

3. 转移：通过半干式转移，将电泳后的凝胶上的蛋白质转移到膜上。

这个过程包括割胶、平衡、膜处理、转膜等步骤。

其中，转膜是关键步骤，需要将凝胶上的蛋白质精确转移到NC膜上，滤纸、凝胶、NC膜需要精确对齐，
去除气泡，并在恒流1mA/cm2下转移小时。

4. 免疫检测：在转移后的膜上，利用抗体进行检测。

这一步通常包括一抗和二抗的结合，以及通过化学发光检测或其他方法检测到结合的抗体。

5. 结果分析：通过对比染色结果和标准条带，可以分析出样品中特定蛋白质的表达情况。

此外，阴性对照是以1%BSA取代一抗，其余步骤与实验组相同。

以上信息仅供参考，具体步骤可能会根据实验需求和条件有所不同，建议咨询专业人士获取具体信息。

westernblotting原理
Western blotting，又称蛋白质印迹或免疫印迹，是一种用于检测特定蛋白质在复杂样品中的存在和表达水平的分子生物学技术。

其基本原理可以分为以下几个步骤：
1. 蛋白质样品制备：首先，需要从细胞或组织中提取蛋白质，并将其稀释到适合的浓度。

2. 凝胶电泳分离：将提取的蛋白质样品加入凝胶（通常是聚丙烯酰胺凝胶）中，并通过电泳分离。

由于不同蛋白质的带电性质和分子质量不同，它们在凝胶中会分离出不同的条带。

3. 蛋白质转移：将凝胶中的蛋白质转移到一种名为硝酸纤维素（nitrocellulose）或聚偏氟乙烯（PVDF）的膜上。

这一步骤称为蛋白质转移或印迹。

蛋白质通过范德华力或电场力从凝胶转移到膜上，保证了其在膜上的空间位置与在凝胶中一致。

4. blocking：为了减少非特异性结合，需要在膜上加入一种阻断剂（如牛奶或BSA）来覆盖未被蛋白质占据的膜表面。

5. 抗原-抗体反应：将特异性抗体（通常为辣根过氧化物酶或酶联免
疫吸附测定中的酶标记抗体）与膜上的目标蛋白质结合。

这些抗体识别并与其特异性结合的目标蛋白质。

6. 检测和显色：使用一种带有酶的检测抗体（第二抗体）与第一抗体结合。

这种酶标记的第二抗体可以催化底物转化为可见的色产物。

通过化学反应，颜色的深浅与目标蛋白质在样品中的含量成正比。

7. 数据分析：最后，通过图像分析或光密度计来量化膜上的蛋白带，从而分析样品中特定蛋白质的表达水平。

总之，Western blotting是一种强大的技术，可以用于定性和定量分析样品中的特定蛋白质，是分子生物学和生物化学中不可或缺的工具。

immunoblotting免疫印迹法免疫印迹法（Immunoblotting）是一种常用的蛋白质检测方法，它通过使用特异性抗体来检测目标蛋白质在复杂的混合物中的存在和量。

免疫印迹法的原理是将蛋白质样品分离后转移到固定膜上，然后用特异性抗体与目标蛋白质结合，最后通过检测抗体标记物的信号来确定目标蛋白质的存在与数量。

免疫印迹法的步骤如下：1.蛋白质分离：首先，将待测样品进行电泳分离。

通常使用聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）进行分离，根据蛋白质的分子量大小将其分离成不同的带状条带。

2.转印：将蛋白质从凝胶转移到固定膜上。

这个步骤通常使用西方半湿法或湿法转印，将凝胶和膜夹在一起，通过电流使蛋白质从凝胶逐渐转移到膜上。

3.阻断：为了减少非特异性结合，需要用饱和蛋白或其他蛋白质进行膜的阻断。

常见的阻断剂包括牛血清白蛋白（BSA）或非脂干奶粉。

4.抗体结合：将特异性的一抗加入到含有阻断剂的缓冲液中，将膜与抗体溶液一同孵育，使抗体与目标蛋白质结合。

5.清洗：将膜用洗涤缓冲液洗涤，以去除未结合的抗体和其他非特异性的成分。

6.检测：将抗体标记物（如荧光素、辣根过氧化物酶等）加入到膜上，使其与结合的抗体发生特异性反应。

通过荧光素的化学反应或辣根过氧化物酶底物的显色反应来产生可见的信号。

这些信号可以通过数字成像系统进行记录和分析。

免疫印迹法的优点包括：能够检测特定蛋白质的存在和量；需要样品量比较小，一般几微克；灵敏度高，可检测到非常低浓度的目标蛋白质；可以同时检测多个蛋白质。

然而，免疫印迹法也存在一些局限性，如需要已知的特异性抗体来进行检测，如果没有可用的抗体，就无法检测目标蛋白质；对于高分子量的蛋白质，由于电泳分离的限制，可能无法很好地分离和转移；部分抗体可能存在交叉反应或非特异性结合问题；荧光或显色信号必须进行定量分析才能获得准确的结果。

总体来说，免疫印迹法是一种常用且可靠的蛋白质检测方法，广泛应用于生物医学研究和临床诊断中。

蛋白质免疫印迹（WesternBlot，WB）实验方法原理步骤及注意事项实验方法原理Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测的方法。

对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。

与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。

经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。

以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。

该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。

实验材料蛋白质样品试剂、试剂盒丙烯酰胺SDS Tris-HClβ-巯基乙醇ddH2O甘氨酸Tris甲醇PBSNaClKClNa2HPO4KH2PO4ddH2O考马斯亮兰乙酸脱脂奶粉硫酸镍胺H2O2DAB试剂盒仪器、耗材电泳仪电泳槽离心机离心管硝酸纤维素膜匀浆器剪刀移液枪刮棒实验步骤一、试剂准备1. SDS-PAGE试剂：见聚丙烯酰胺凝胶电泳实验。

2. 匀浆缓冲液：1.0 M Tris-HCl(pH 6.8) 1.0 ml；10%SDS 6.0ml；β-巯基乙醇 0.2 ml；ddH2O 2.8 ml。

3. 转膜缓冲液：甘氨酸 2.9 g；Tris 5.8 g；SDS 0.37 g；甲醇200 ml；加ddH2O定容至1000 ml。

4. 0.01 M PBS(pH7.4)：NaCl 8.0 g；KCl 0.2 g；Na2HPO41.44g；KH2PO40.24 g；加ddH2O至1000 ml。

5. 膜染色液：考马斯亮兰0.2 g；甲醇80 ml；乙酸 2 ml；ddH2O118 ml。